保护性基因血红素加氧酶-1在减轻肝脏缺血再灌注损伤中的机制研究

摘要

根据最新研究发现，肥大细胞在心、脑、肠等器官的缺血再灌注损伤中发生脱颗粒并且能加重缺血再灌注损伤，推断肥大细胞在肝脏缺血再灌注损伤中也发生脱颗粒并且加重局部损伤，再结合机体自身保护性基因血红素加氧酶-1（HO-1）参与免疫调控，具有抗炎、抗过敏、抗凋亡等作用，从而提出机体保护性基因HO-1减轻肝脏缺血再灌注损伤的可能途径：抑制肥大细胞脱颗粒。以大鼠肝脏缺血再灌注损伤为研究对象，运用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、western blot 等技术检测肝脏HO-1核酸水平、蛋白水平的变化，常规检测外周血中谷丙转氨酶、谷草转氨酶的变化等指标，甲苯胺蓝染色检测肝脏中肥大细胞性状和数量的变化，HE染色检测肝脏组织损伤变化，免疫组化技术检测Kupffer细胞功能变化，综合评价上述变化对肝脏缺血再灌注损伤的影响，在体验证上述理论推测，为阐明HO-1与肥大细胞在肝脏I/RI中的作用机制，并为临床防治肝脏缺血再灌注损伤提供新的调控靶点。本研究分为三个部分：　　 第一部分：HO-1表达和肥大细胞脱颗粒在肝脏缺血再灌注损伤中的变化观察。　　 目的：研究肝脏缺血再灌注损伤过程中大鼠肝脏保护性基因血红素加氧酶-1（HO-1）的表达以及肥大细胞脱颗粒的变化。　　 方法：将实验雄性SD大鼠随机分为8组，每组5只：假手术组(Sham组)、1h组、2h组、4h组、6h组、8h组、12h组、24h组。实验动物经麻醉消毒开腹后，暴露肝门部，采用无损伤血管夹夹闭左中叶肝蒂1h后放开，分别于再灌注后1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h取外周血标本和肝脏组织标本，Sham组只开腹不做其他处理。RT-PCR法检测肝组织中HO-1 mRNA的表达变化；采用Western blot法检测肝组织中HO-1蛋白表达变化；常规检测外周血中转氨酶水平的变化。病理切片染色检测肝脏中肥大细胞性状和数量的变化。　　 结果：肝脏缺血再灌注后，实验组HO-1 mRNA表达、HO-1蛋白表达、外周血转氨酶水平以及肥大细胞脱颗粒数明显高于Sham组，其中6h组和8h组HO-1 mRNA表达、蛋白表达以及外周血转氨酶水平最高，其差别有统计学意义,P <0.05；而2h组肥大细胞脱颗粒数量最多，其差异具有统计学意义,P <0.05。　　 结论;本实验结果表明肝脏HO-1表达随着再灌注时间的增加成抛物线趋势，再灌注6-8h表达最高；肝脏缺血再灌注损伤过程中有肥大细胞发生脱颗粒，并且再灌注2h脱颗粒数量最多，这部分实验为后续探讨HO-1与肥大细胞脱颗粒之间的关系提供了时间依据。　　 第二部分：上调HO-1表达抑制肥大细胞脱颗粒减轻肝脏缺血再灌注损伤。　　 目的：缺血再灌注损伤(I/RI)是许多肝脏手术后造成器官损害的原因之一。探索肝脏I/RI的机制，减轻或防止再灌注损伤的发生，是肝脏疾病防治中亟待解决的重要课题。为了阐明HO-1与肥大细胞在肝脏I/RI中的作用机制，利用大鼠肝脏I/RI模型，深入探讨肝脏中HO-1减轻肝脏I/RI的可能途径：抑制肥大细胞脱颗粒作用。　　 方法：将实验雄性SD大鼠随机分为4组(n=5)： （1）假手术组（Sham组），（2）缺血再灌注损伤组（I/RI组），（3）HO-1诱导剂钴原卟啉组（CoPP组），（4）HO-1抑制剂锌原卟啉组（ZnPP组）。实验动物经麻醉消毒开腹后，暴露肝门部，采用无损伤血管夹夹闭左中叶肝蒂1h后放开，分别于再灌注后2h取外周血标本和肝脏组织标本。RT-PCR法检测肝组织中HO-1 mRNA的表达变化；采用Western blot法检测肝组织中HO-1蛋白表达变化；常规检测外周血中转氨酶水平；病理切片甲苯胺蓝染色检测肝脏中肥大细胞性状和数量的变化；HE染色检测肝脏细胞损伤情况。　　 结果：与Sham组相比，I/RI组、CoPP组、ZnPP组肝脏组织HO-1mRNA表达增加，血清ALT、AST水平升高，肥大细胞脱颗粒数量增多，肝脏细胞损伤加重。与I/RI组相比，CoPP组HO-1mRNA表达增加，血清ALT、AST水平减低，肥大细胞脱颗粒数量减少，肝细胞损伤减轻；ZnPP组HO-1mRNA表达减少，血清ALT、AST水平升高，肥大细胞脱颗粒数量增多、肝细胞损伤严重。组间比较差异具有统计学意义,P <0.05。　　 结论：本实验结果表明预先提高肝脏HO-1的表达能减轻缺血再灌注损伤，其作用的可能途径是抑制肝脏中肥大细胞脱颗粒。　　 第三部分：HO-1在肝脏中减轻缺血再灌注损伤的细胞定位研究。　　 目的：正常状态下的肝脏组织HO-1的表达量总是比其他实质性脏器为高。深入探讨HO-1在肝脏中减轻缺血再灌注损伤的细胞来源对于肝脏缺血性相关疾病提供治疗靶点具有重要意义。　　 方法：将实验雄性SD大鼠随机分为4组(n=5)：假手术组(Sham组)、缺血再灌注损伤组(I/RI组)、GdCL3组、GdCL3+HO-1诱导剂钴原卟啉组（GdCL3+CoPP组）。实验动物经麻醉消毒开腹后，暴露肝门部，采用无损伤血管夹夹闭左中叶肝蒂1h后放开，分别于再灌注2h后取外周血标本和肝脏组织标本。免疫组化检测ED2抗原的表达，RT-PCR法检测肝组织中HO-1 mRNA的表达变化；采用Western blot法检测肝组织中HO-1蛋白表达变化；病理切片甲苯胺蓝染色检测肝脏中肥大细胞性状和数量的变化。HE染色检测肝脏细胞损伤情况。　　 结果：GdCL3组、GdCL3+CoPP组ED2抗原表达明显减少，HO-1 mRNA表达、蛋白表达明显降低，肥大细胞脱颗粒增多，肝脏损伤加重。与缺血再灌注损伤组相比，其差异具有统计学意义，P<0.05。　　 结论：本实验结果表明HO-1表达来源于库弗细胞，并且库弗细胞参与肝脏的缺血再灌注损伤过程。

目录

绪论

第1部分 HO-1表达和肥大细胞脱颗粒在肝脏缺血再灌注损伤中的变化观察

第2部分 上调HO-1表达抑制肥大细胞脱颗粒减轻肝脏缺血再灌注损伤

第3部分 HO-1在肝脏中减轻缺血再灌注损伤的细胞定位研究

全文结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表学术论文目录

综述 1:树突状细胞在器官移植中诱导移植耐受的研究进展

综述 2:嵌合诱导移植耐受的研究进展

论文说明:缩略语表

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