一种人心脏瓣膜间质细胞系的永生化构建方法

摘要

本发明涉及一种人心脏瓣膜间质细胞系的永生化构建方法，通过永生化处理人原代主动脉瓣膜间质细胞提高其增殖能力，从而建立主动脉瓣钙化研究的稳定细胞模型，永生化主动脉瓣膜间质细胞与人主动脉瓣原代细胞相比，间质细胞表型无明显差异，而增殖能力明显提高，可连续传代超过40代细胞，能够连续稳定大量地为人类心脏瓣膜疾病研究提供细胞模型，不需要反复提取人类瓣膜组织，极大地节约社会资源，推动人类心脏瓣膜疾病的研究。

说明书

技术领域：

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种人心脏瓣膜间质细胞系的永生化构建方法。

背景技术：

目前认为永生化是一个多步骤的过程，包括一系列细胞周期的调节基因(如Rb和p53)失活和对细胞端粒酶的调控。在构建永生化细胞系时最常用的是SV40 LT基因，该基因的产物大T抗原是由sv40病毒早期编码区编码的一种多功能磷酸蛋白，在病毒复制过程中发挥着重要作用。SV40大t抗原具有活化宿主细胞核糖体基因、诱导DNA合成、修饰蛋白质合成起始因子等作用，能结合、调控某些关键性的细胞调控蛋白，如视网膜母细胞瘤蛋白家族成员(如prb)、肿瘤抑制因子p53等，并可诱导感染细胞的端粒酶活性，诱导多种细胞的永生化。构建的永生化细胞能保留原始细胞的许多分化表型，具有相对稳定的增殖特性和功能状态。SV40大T抗原是由SV40病毒早期编码区编码的一种多功能磷酸蛋白，在病毒复制过程中发挥着重要作用。SV40大T抗原具有活化宿主细胞核糖体基因、诱导DNA合成、修饰蛋白质合成起始因子等作用，并且能结合、调控某些关键性的细胞调控蛋白，如视网膜母细胞瘤蛋白家族成员(如pRB)、肿瘤抑制因子p53等，并可诱导感染细胞的端粒酶活性，诱导多种细胞的永生化。目前科学家已应用SV40 LT基因构建了多种永生化细胞系，包括人血管内皮细胞系和人皮肤成纤维细胞系等。如专利申请号为CN202011578249.2的专利提供了一种原代分离培养土狗多个组织来源的成纤维细胞及其永生化的构建方法，以土狗的心脏组织、肺尖部或腿部肌肉组织为材料经过胰酶和/或胶原酶II的酶解，分离，获得的具有典型的成纤维细胞形态学特征的心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞、成肌纤维细胞。将原代分离培养的心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞、成肌纤维细胞经SV40T病毒液转染后经过嘌呤霉素筛选培养和传代，得到永生化心肌成纤维细胞、肺成纤维细胞、成肌纤维细胞。与原代培养的细胞相比，永生化构建的细胞增长速度更快、活力显著提高，为犬类在科学研究、疾病研究等方面提供材料基础。由于人心脏瓣膜原代细胞的增殖能力有限，通常仅能传代增殖至第5代细胞，无法长时间获取大量细胞，需要多次反复获取人类新鲜心脏瓣膜组织进行消化提取，极大的影响了人类心脏瓣膜疾病的研究，目前尚无代替的相关细胞系存在。

发明内容：

(一)解决的技术问题

针对上述背景，本发明提出了一种人心脏瓣膜间质细胞系的永生化构建方法，通过永生化处理人原代主动脉瓣膜间质细胞提高其增殖能力，从而建立主动脉瓣钙化研究的稳定细胞模型，永生化主动脉瓣膜间质细胞与人主动脉瓣原代细胞相比，间质细胞表型无明显差异，而增殖能力明显提高，可连续传代超过40代细胞，能够连续稳定大量地为人类心脏瓣膜疾病研究提供细胞模型，不需要反复提取人类瓣膜组织，极大地节约社会资源，推动人类心脏瓣膜疾病的研究。

(二)技术方案

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种人心脏瓣膜间质细胞系的永生化构建方法，应用慢病毒pGMLV-SV40T-PURO对人原代瓣膜间质细胞进行感染，经过嘌呤霉素筛选后得到稳定表达SV40T基因的细胞系，经过传代培养和增殖能力检测，得到稳定的永生化人心脏瓣膜间质细胞系。

进一步地，所述方法的具体步骤如下：

S1、将P2代原代人心脏瓣膜间质细胞用无菌PBS清洗3次，加入0.25％胰酶于37℃培养箱中消化3分钟，应用H-DMEM+10％FBS+1％双抗的完全培养基终止消化，用所述完全培养基重悬所述细胞并将其均匀铺于6cm培养皿中；

S2、当所述细胞生长至50％汇合度时，应用慢病毒pGMLV-SV40T-PURO感染所述细胞，将所述细胞置于37℃、5％CO2培养箱中8小时；

S3、所述慢病毒pGMLV-SV40T-PURO感染所述细胞24小时后换液，然后再持续培养4天，每2天继续换液；

S4、感染5天后，在细胞完全培养液中添加1ug/mL嘌呤霉素Puromycin，持续培养96h；

S5、将所述完全培养基更换为无抗生素的正常培养基进行培养，当所述细胞生长融合后，形成永生化人心脏瓣膜间质细胞，后续对所述永生化人心脏瓣膜间质细胞进行常规传代培养。

进一步地，所述慢病毒pGMLV-SV40T-PURO的用量为MOI＝80，含5ug/mLPolybrene，以增强慢病毒感染效率。

进一步地，所述传代培养的步骤如下：

S1、将6cm培养皿中所述永生化人心脏瓣膜间质细胞用PBS清洗1次；

S2、用1ml 0.25％胰酶将所述永生化人心脏瓣膜间质细胞在37℃培养箱中消化3分钟，然后用等体积H-DMEM+10％FBS+1％双抗的完全培养基终止消化；

S3、1000r/min离心5分钟后吸除上清液，最后用所述完全培养基重悬细胞沉淀；

S4、将细胞悬液1：2传代铺于6cm培养皿中；

S5、补足所述完全培养基，完成所述传代培养。

进一步地，所述双抗为青霉素和链霉素。

(三)有益效果

本发明产生的有益效果是：

1.通过本发明所提供的技术方案，可以快速有效地构建能在体外无限培养的永生化人心脏瓣膜间质细胞系，可使技术人员免于反复分离原代人心脏瓣膜间质细胞，极大地节约资源和经济成本；

2.应用本发明提供的技术方案构建的人心脏瓣膜间质细胞系，能够稳定传代超过40代，为人心脏瓣膜疾病的科学研究提供了充足的细胞来源，所构建的永生化细胞系和原代心脏瓣膜间质细胞相比，增殖能力强，细胞形态和功能大体相同，能够满足生命科学基础研究的要求；

3.由于永生化细胞系的遗传背景一致，各代数之间的细胞表型稳定，在基础科研中的生物学重复较原代细胞好，在人心脏瓣膜病的研究中稳定性强，具有明显优势；

4.应用本发明提供的技术方案构建的人心脏瓣膜间质细胞系，能够应用Crispr/Cas9基因编辑技术进行特定基因的敲除、插入、点突变等精准编辑，可应用于研究某个特定基因在人心脏瓣膜病中的具体作用机制，而原代细胞由于传代数量有限，无法进行基因编辑。

附图说明：

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为人心脏瓣膜间质细胞系的永生化构建流程图；

图2为人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞成克隆实验结晶紫染色、免疫荧光染色图；

图3为人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞成骨诱导培养后成骨蛋白表达量测定及染色结果图；

其中，A为人细胞蛋白免疫印迹灰度图，B、C、D为蛋白免疫印迹结果统计图，E为茜素红染色结果图；

图4为人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞增殖和迁移能力检测图；

其中，A为不同时间点人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞划痕实验图，B为划痕实验统计结果图，C为CCK8检测细胞增殖结果统计图；

图5为人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞凋亡诱导流式分析图；

图6为人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞钙化诱导培养后RNA-seq分析结果图；

其中，A为钙化诱导后人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞上调基因分析图，B为钙化诱导后下调基因分析图，C为人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞信号通路表达富集图；

具体实施方式：

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

本发明实施例的所述实验中所用到的培养基包括为：DMEM(Gibco，#C11995500BT),FBS(Vivacell,#C38010050),双抗(Hyclone，#SV30010.01)

实施例一、人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞，成克隆实验结晶紫染色，免疫荧光染色

(1)分别将正常培养的P2代人原代心脏瓣膜间质细胞和P20代人永生化心脏瓣膜间质细胞应用PBS(Hyclone，#SH30256.01B)洗一遍，加入0.25％胰酶(Hyclone，#SH30042.01)于37℃消化3分钟，加入等量的完全培养基(DMEM，10％FBS，1％P/S)终止消化；

(2)用无菌1ml枪头吹打细胞制成细胞悬液，1200rpm室温离心5分钟后，弃上清，用1ml完全培养基重悬细胞，应用细胞计数板计数并计算细胞浓度；

(3)分别将1000个原代和永生化人心脏瓣膜间质细胞种入6孔板，摇匀后放入细胞培养箱进行培养(37℃，5％CO2)；

(4)正常培养10天后，将细胞取出，吸弃培养基，用PBS洗一遍后应用4％多聚甲醛固定，交由武汉赛维尔公司进行结晶紫染色，结果如图2所示。

(5)与上述(1)(2)步骤相同，分别将人原代和永生化瓣膜间质细胞种入共聚焦皿(Biosharp，#BS-20-GJM)，放入培养箱正常培养；

(6)待细胞达到60％汇合度时，将细胞取出，用PBS洗一遍后应用4％多聚甲醛固定10分钟；

(7)PBS洗三遍后，用5％浓度山羊血清封闭1小时；

(8)PBS洗一遍后，加入1:200稀释的anti-vimentin(abcam，#ab8979)一抗4℃孵育过夜；

(9)PBS洗三遍后，加入1:1000稀释的荧光二抗(CST，#4408)室温孵育1小时。

(10)PBS洗三遍后，应用含DAPI的封片剂(碧云天，#P0131)封片，应用共聚焦显微镜拍照，如图2所示。实验结果显示，人原代和永生化瓣膜间质细胞都表达间质细胞特异性标志物vimentin，永生化处理并不会改变细胞的间质表型。结晶紫染色提示人原代心脏瓣膜间质细胞在稀释培养后由于增殖能力有限，无法形成单克隆细胞群，而永生化瓣膜间质细胞能形成明显的单克隆细胞群体，提示永生化瓣膜间质细胞的增殖能力更强。

实施例二、人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞成骨诱导培养，成骨蛋白表达量测定

(1)分别将正常培养的P2代人原代心脏瓣膜间质细胞和P20代人永生化心脏瓣膜间质细胞种入6孔板中，设置对照组和成骨培养诱导组；

(2)待细胞达到70％汇合度时开始干预，对照组细胞更换为含2％FBS的培养基，成骨培养诱导组更换为OM培养基(β-glycerol-phosphate 10mmol/l,L-Ascorbic acid10ug/ml,dexamethasone 10nmol/l)干预；

(3)干预6天后，将细胞取出，吸弃培养基，用冷PBS洗一遍，加入RIPA细胞裂解液(碧云天，#P0013B)，提取细胞总蛋白后，应用BCA试剂盒(碧云天，#P0010S)测定样品的蛋白浓度；

(4)将所有样品以30ug蛋白/孔上样。电泳结束后，使用半干电转将蛋白转印至PVDF膜(Cytiva，#10600001)上，转移条件为30mA/100min。使用封闭液封闭转印膜1小时,用1×TBST洗涤10分钟；

(5)将封闭好的膜按照相应分子量大小，裁成长条形，与相应的一抗进行孵育，4℃孵育过夜，第二天，用1×TBST洗涤3次，每次10分钟；

(6)应用ECL发光底物(碧云天，#P0018S)曝光显影；

(7)对于曝光结果，应用imageJ和graphpad进行统计分析作图，结果如图3所示。

(8)与上述(1)(2)步骤相同，分别将人原代和永生化瓣膜间质细胞进行钙化培养，连续培养21天后，将细胞取出，吸弃培养基，用PBS洗一遍后应用4％多聚甲醛固定，交由武汉赛维尔公司进行茜素红染色，结果如图3所示。实验结果显示人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞，分别应用钙化培养基诱导后，成骨细胞标志物Runx2、BMP2、OCN的表达均上升，同时连续钙化培养21天后应用茜素红染色，结果显示人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞均能形成明显的钙化结节，这些结果表明人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞都能向成骨细胞分化。

实施例三、人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞增殖和迁移能力检测

准备工作：所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min(超净台内)。

(1)先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀地划横线，大约每隔0.5-1cm一道，横穿过孔，每孔至少穿过5条线；

(2)分别在孔中加入人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞，数量约5X105个细胞每孔；

(3)正常培养数天，待细胞长满时开始干预，用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不要倾斜；

(4)用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基；

(5)放入37℃，5％CO2培养箱培养，按0、24、48、72小时拍照，用imageJ处理统计结果，如图4所示。实验结果显示人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞的迁移能力无明显差异。

(6)在96孔板中分别种入人原代和永生化瓣膜间质细胞，每孔种4X104个细胞，将培养板在培养箱中先培养过夜至细胞贴壁(37℃,5％CO2)；

(7)取不同时间点(0、24、48、72、96小时)在相应孔中加入10ul的CCK8试剂(biosharp，#BS350B)，37℃孵育1小时后，应用酶标仪在450nm处读取相应孔的OD值，应用graphpad软件进行统计分析作图，如图4所示。实验结果显示实验结果显示人永生化心脏瓣膜间质细胞的增殖能力明显增强。

实施例四、人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞凋亡诱导流式分析

(1)分别将人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞种入6孔板中，待细胞长至70％汇合度时开始干预；

(2)对照组应用正常完全培养基培养，干预组在培养基中加入H2O2(200uM)干预4小时，用胰酶消化收取每个孔的细胞；

(3)应用凋亡试剂盒(联科生物，#AP101C)对每个孔的细胞进行染色，最后流式上机分析；

(4)应用flowjo软件对结果进行分析作图，结果如图5所示。

实验结果显示人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞在应用H2O2进行干预后，均能诱导其发生细胞凋亡，人永生化瓣膜间质细胞能满足一些细胞死亡方面的实验研究。

实施例五、人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞增殖和迁移能力检测

(1)分别将正常培养的P2代人原代心脏瓣膜间质细胞和P20代人永生化心脏瓣膜间质细胞种入6孔板中，设置对照组和成骨培养诱导组；

(2)待细胞达到70％汇合度时开始干预，对照组细胞更换为含2％FBS的培养基，成骨培养诱导组更换为OM培养基(β-glycerol-phosphate 10mmol/l,L-Ascorbic acid10ug/ml,dexamethasone 10nmol/l)干预；

(3)干预6天后，将细胞取出，吸弃培养基，用冷PBS洗一遍，每个孔加入1ml Trizol(Invitrogen，#15596018)，将样品-80℃冰箱保存，后续交由深圳华大基因公司进行RNA-seq二代测序分析，结果如图6所示。

实验结果显示，人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞在转录组水平无明显差异，但永生化细胞在增殖等信号通路方面被明显激活。在钙化诱导后，人原代和永生化心脏瓣膜间质细胞有215个共同上调的基因和73个共同下调的基因，共同上调的基因都集中在成骨分化信号通路，下调基因都集中在细胞结构和细胞外基质重塑。测序结果表明两种细胞除了在增殖方面有差异，其他细胞功能方面无明显差异，两种细胞在钙化诱导后都能激活成骨信号通路。

综上所述，本发明提出的一种人心脏瓣膜间质细胞系的永生化构建方法，通过永生化处理人原代主动脉瓣膜间质细胞提高其增殖能力，从而建立主动脉瓣钙化研究的稳定细胞模型，所构建的永生化主动脉瓣膜间质细胞系可连续传代超过40代细胞，能够连续稳定大量地为人类心脏瓣膜疾病研究提供细胞模型，不需要反复提取人类瓣膜组织，极大地节约社会资源，推动人类心脏瓣膜疾病的研究。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的保护范围。另外，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改或变型，所有的这些等价形式同样属于本申请所要求限定的保护范围之内。