一种检测人MTHFR基因多态性的引物和探针组合及其试剂盒

摘要

本发明提供一种检测人MTHFR基因多态性的引物和探针组合及其试剂盒，所述检测人MTHFR基因多态性的引物和探针组合包括：MTHFR上游引物、MTHFR下游引物，MTHFR 677野生型探针，和MTHFR 677突变型探针。本发明设计的特异性引物对和探针，可检测人MTHFR基因的多态性，引物与探针设计合理，使其在进行扩增反应时，保证了退火温度，使其对样品的扩增效果良好；同时引物与探针具有高特异性，野生型和突变型样本、突变型探针和野生型样本间不存在交叉反应，结果不会产生误判，准确性高。

说明书

技术领域

本发明属于体外诊断领域，具体涉及检测人MTHFR基因多态性的引物和探针组合及其试剂盒。

背景技术

人MTHFR基因具有遗传多样性，C677T是最常见的多态性位点，引起酶分子热稳定性和活性下降。MTHFR基因编码的亚甲基四氢叶酸还原酶是同型半胱氨酸代谢过程中的关键酶，催化5,10-亚甲基四氢叶酸为5-甲基四氢叶酸，后者提供甲基给Hcy合成甲硫氨酸和四氢叶酸。研究表明，MTHFR酶活性降低是血Hcy水平升高的原因之一，而血Hcy水平升高则是心脑血管事件的独立危险因素，与心脑血管事件风险呈正相关。

Taqman-MGB探针法同时综合了5’端核酸酶活性和荧光等技术，其在反应过程使用4条寡核苷酸链，其中两条为等位基因特异性探针，两条为PCR引物。两条探针可分别与突变型和野生型模板互补，其两端分别应用含报告基团和淬灭基团的染料进行标记，两条探针的报告基团荧光染料不一样。在进行SNP检测时，PCR扩增的退火过程导致探针与模板杂交结合，当引物延伸至探针处时，DNA聚合酶的5’端外切酶活性将探针的5’端报告基团从探针上切除，使之与淬灭基团分离，从而释放出相对应的荧光，而没有配对的探针仍然保持完整而不会发荧光。不同的等位基因探针由于标记的荧光染料不同，因此所发荧光信号不同，可通过对荧光信号的检测判断样本的基因型。

Taqman-MGB探针法由于具有更高特异性、更快捷简便的操作以及更好的普及性，已成为最受商业化SNP检测试剂盒青睐的SNP检测技术。然而，现有的基于实时荧光PCR法设计的人MTHFR基因测试引物以及Taqman-MGB探针难以在扩增效果和测试准确率上实现兼顾。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种检测人MTHFR基因多态性的引物和探针组合及其试剂盒，旨在提供一种测试准确率高、特异性好及可重复性强的检测试剂。

为达到上述目的，本发明提供一种检测人MTHFR基因多态性的引物和探针组合，所述检测人MTHFR基因多态性的引物和探针组合包括：

MTHFR上游引物，所述MTHFR上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

MTHFR下游引物，所述MTHFR上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

MTHFR 677野生型探针，所述MTHFR 677野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

及

MTHFR 677突变型探针，所述MTHFR 677突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

可选地，所述MTHFR 677野生型探针连接有锁核酸；和/或，

所述MTHFR 677突变型探针连接有锁核酸；和/或，

所述MTHFR 677野生型探针连接有小沟化合物；和/或，

所述MTHFR 677突变型探针连接有小沟化合物。

可选地，所述MTHFR 677野生型探针的第七位核苷酸连接有锁核酸；和/或，

所述MTHFR 677突变型探针的第七位核苷酸连接有锁核酸；和/或，

所述MTHFR 677野生型探针的3’端连接有小沟化合物；和/或，

所述MTHFR 677突变型探针的3’端连接有小沟化合物。

可选地，所述MTHFR 677野生型探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有非荧光淬灭基团；和/或，

所述MTHFR 677突变型探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有非荧光淬灭基团。

可选地，所述检测人MTHFR基因多态性的引物和探针组合还包括：

内标上游引物，所述内标上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

内标下游引物，所述内标下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；及，

内标探针，所述内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

此外，本发明还提供一种检测人MTHFR基因多态性的试剂盒，所述检测人MTHFR基因多态性的试剂盒包括DNA聚合酶、dNTPs以及上述的检测人MTHFR基因多态性的引物和探针组合。

可选地，所述dNTPs包括dATP、dUTP、dCTP及dGTP，所述检测人MTHFR基因多态性的试剂盒还包括UDG酶。

可选地，所述检测人MTHFR基因多态性的试剂盒还包括阳性对照品和/或阴性对照品。

可选地，所述检测人MTHFR基因多态性的试剂盒中，所述dNTPs的浓度为0.1～0.5μM；和/或，

所述MTHFR 677上游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，

所述MTHFR 677下游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，

所述MTHFR 677野生型探针的浓度为0.05～0.5μM；和/或，

所述MTHFR 677突变型探针的浓度为0.05～0.5μM；和/或，

所述DNA聚合酶为Taq酶；和/或，

所述DNA聚合酶的酶活为0.5～2U。

此外，一种检测人MTHFR基因多态性的试剂盒的方法，所述检测人MTHFR基因多态性的试剂盒的方法的包括以下步骤：

获取测试样品；

采用上述的检测人MTHFR基因多态性的试剂盒对所述测试样品进行PCR反应；

根据PCR反应结果判定基因型。

可选地，所述采用所述检测人MTHFR基因多态性的试剂盒对所述测试样品进行PCR反应的同时，对阴性对照品和阳性对照品采用所述检测人MTHFR基因多态性的试剂盒进行PCR反应。

本发明设计的特异性引物对和探针，可检测人MTHFR基因的多态性，引物与探针设计合理，使其在进行扩增反应时，保证了退火温度，使其对样品的扩增效果良好；同时引物与探针具有高特异性，野生型和突变型样本、突变型探针和野生型样本间不存在交叉反应，结果不会产生误判，准确性高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例2野生型样本检测结果图；

图2为实施例2突变型样本检测结果图；

图3为实施例2杂合型样本检测结果图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

针对背景技术中提出的现有的基于实时荧光PCR法设计的人MTHFR基因测试引物以及Taqman-MGB探针难以在扩增效果和测试准确率上实现兼顾，本发明提供一种检测人MTHFR基因多态性的引物和探针组合，所述检测人MTHFR基因多态性的引物和探针组合包括：MTHFR上游引物，所述MTHFR上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；MTHFR下游引物，所述MTHFR下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；MTHFR 677野生型探针，所述MTHFR 677野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；及，MTHFR 677突变型探针，所述MTHFR 677突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明设计的特异性引物对和探针，可检测人MTHFR基因的多态性，引物与探针设计合理，使其在进行扩增反应时，保证了退火温度，使其对样品的扩增效果良好；同时引物与探针具有高特异性，野生型和突变型样本、突变型探针和野生型样本间不存在交叉反应，结果不会产生误判，准确性高。

在一些实施例中，所述MTHFR 677野生型探针连接有锁核酸；所述MTHFR 677突变型探针连接有锁核酸。通过分别在MTHFR 677野生型探针和所述MTHFR 677突变型探针上分别连接有锁核酸，提高退火温度，进而提高其热稳定性和杂交特异性，且可增强对人MTHFR基因多态位点的识别，进而提高测试准确率。

需要说明的是，本申请中的含有的锁核酸选自现有普通核酸，是一种核酸类似物，它和普通核酸分子区别在于在其碱基碳环的2'氧原子和4'碳原子位置有亚甲基桥而成锁状结构，包含A,C,G,T,U,mC六种碱基。

具体地，在一些实施例中，所述MTHFR 677野生型探针的第七位核苷酸连接有锁核酸；所述MTHFR 677突变型探针的第七位核苷酸连接有锁核酸。

本发明研究团队发现，在所述MTHFR 677野生型探针的第七位核苷酸以及所述MTHFR 677突变型探针的第七位核苷酸分别连接有锁核酸，可以进一步提高测试准确率。

在一些实施例中，所述MTHFR 677野生型探针连接有小沟化合物；所述MTHFR 677突变型探针连接有小沟化合物。通过在所述MTHFR 677野生型探针和所述MTHFR 677突变型探针连接有小沟化合物，可以提高其与模板的结合稳定性大大增加，提高Tm值的同时，MGB的加入缩短了分型探针的长度，更适合进行单核苷酸的分型。不影响测试准确率。在此前提下，小沟化合物可从现有小沟化合物做任意选择，例如：CC-1065类似物，偏端霉素，纺锤菌素，贝尼尔，多卡米星，喷他脒，4,6-二氨基-2-苯基吲哚和吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮和DPI3等等。

在一些实施例中，所述MTHFR 677野生型探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有非荧光淬灭基团；所述MTHFR 677突变型探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有非荧光淬灭基团。通过在探针引物份5’端和3’端分别标记有荧光基团和非荧光淬灭基团，可以通过荧光信号反应扩增效果。

在一些实施例中，所述MTHFR 677野生型探针的3’端同时连接有小沟化合物和荧光淬灭基团；所述MTHFR 677突变型探针的3’端连接有小沟化合物和荧光淬灭基团。通过将所述小沟化合物设计在探针3'端淬灭基团旁边时，能够实现比较理想的分型能力。

在一些实施例中，所述检测人MTHFR基因多态性的引物和探针组合还包括：内标上游引物，所述内标上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；内标下游引物，所述内标下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；及，内标探针，所述内标探针的核苷酸序列如SEQID NO：7所示。

本发明通过使用上述内标系统监测该荧光PCR反应是否存在抑制，由于待检测的样本中的某些成分可能含有导致PCR出现部分或完全抑制；此外，扩增仪可能存在高于允许范围的孔间差，导致不同管间扩增效率差异，另外人为加样错误也可能导致假阴性结果的出现，因此本发明实施例中采用内标系统来消除上述隐患，保证了检测结果的准确性。

进一步，所述内标探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有荧光淬灭基团。以此，可以通过荧光信号判定内标探针信号。

需要说明的是，在本发明中，所述MTHFR 677野生型探针、所述MTHFR 677突变型探针和所述内标探针标记的荧光基团均不相同，以此可以通过不同的信号进行辨别不同的扩增产物。

此外，本发明还提供一种检测人MTHFR基因多态性的试剂盒，所述检测人MTHFR基因多态性的试剂盒包括PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs以及上述的检测人MTHFR基因多态性的引物和探针组合。

本发明通过上述引物和探针组合与DNA聚合酶、dNTPs和PCR反应缓冲液复配，可以对人MTHFR基因多态性进行准确、快速的检测。

在一些实施例中，所述dNTPs包括dATP、dUTP、dCTP及dGTP，所述检测人MTHFR基因多态性的试剂盒还包括UDG酶。本发明通过在反应体系中使用dUTP替代dTTP，使得产物中含有尿嘧啶，将UDG酶加入到扩增反应体系中，可切除任何污染扩增产物的尿嘧啶，从而避免假阳性的形成。

在一些实施例中，所述检测人MTHFR基因多态性的试剂盒还包括阳性对照品和/或阴性对照品。本发明通过在试剂盒体系中引进阴性对照品以及阳性对照品，以其组成试剂盒的质控系统对检测全过程进行有效的质量控制，包括试剂及仪器性能、可能的扩增反应抑制物(管内抑制)、交叉污染等因素造成的假阴性或假阳性结果。

进一步，所述检测人MTHFR基因多态性的试剂盒中，所述dNTPs的浓度为0.1～0.5μM；所述MTHFR 677上游引物的浓度为0.1～1μM；所述MTHFR 677下游引物的浓度为0.1～1μM；所述MTHFR 677野生型探针的浓度为0.05～0.5μM；所述MTHFR 677突变型探针的浓度为0.05～0.5μM；所述DNA聚合酶为Taq酶；所述DNA聚合酶的酶活为0.5～2U。将试剂盒的组分控制在上述浓度范围，有利于提高信号的强度，以此提高灵敏度和特异性。

进一步，所述检测人MTHFR基因多态性的试剂盒包括一个或多个PCR反应体系，各所述PCR反应体系均包括PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs以及上述的检测人MTHFR基因多态性的引物和探针组合。通过设置多组PCR反应体系可以满足多样品测试。

具体地，各所述PCR反应体系中的PCR反应缓冲液的含量是2.5～5μL。通过将所述PCR反应体系中的PCR反应缓冲液控制在该范围，可以确保其PCR反应扩增效果，利于信号强度。

在一些实施例中，各所述PCR反应体系中所述内标上游引物的浓度为0.1～1μM；所述内标下游引物的浓度为0.1～1μM；所述内标探针的浓度为0.05～0.5μM。通过在内标体系各组分控制在该范围，可以进一步提高品控效果。

在一些实施例中，各所述PCR反应体系中所述UDG酶的酶活为0.1～0.5U。通过将所述UDG酶的酶活控制在该范围，可以进一步控制产品的抗污染效果。

此外，一种检测人MTHFR基因多态性的试剂盒的方法，所述检测人MTHFR基因多态性的试剂盒的方法的包括以下步骤：

步骤S10：获取测试样品；

步骤S20：采用上述的检测人MTHFR基因多态性的试剂盒对所述测试样品进行PCR反应；

步骤S30：根据PCR反应结果判定基因型。

所述步骤S10包括从采集样本中获取基因组DNA，得到所述测试样品，所述采集样本可具体血液或咽拭子等样本。

步骤S20包括以下步骤：

步骤S201：将2μL测试样品与一个所述PCR反应体系进行扩增；采用上述体系对测试样品进行PCR反应时，有利于进一步的提高反应信号强度。

在本发明中，所述采用所述检测人MTHFR基因多态性的试剂盒对所述测试样品进行PCR反应的同时，对阴性对照品和阳性对照品采用所述检测人MTHFR基因多态性的试剂盒进行PCR反应，具体包括：

步骤S202：将2μL阳性对照品与一个所述PCR反应体系进行扩增；

步骤S203：将2μL阳性对照品与一个所述PCR反应体系进行扩增。

采用品控体系对测试样品进行PCR反应时，有利于进一步的提高反应信号强度，进而加强品控效果。

进一步，扩增反应程序为：

1阶段，50℃处理2分钟；

2阶段，95℃预变性3分钟；

3阶段，按95℃15秒和59℃40秒的条件循环40s。

通过将扩增反应程序控制在上述范围时，有利于进一步提高反应效果，增强信号强度。

步骤S30包括以下步骤：

步骤S301，实验有效性判定，所述实验有效性判定判定的标准为：

阳性对照：在野生型对应荧光通道、突变型对应荧光通道、内标对应荧光通道扩增曲线有明显的指数增长期，且22≤Ct值≤27；

阴性对照：在野生型对应荧光通道、突变型对应荧光通道、内标对应荧光通道通道无扩增曲线，或者扩增曲线为直线或倾斜线，无指数增长期，无Ct值或Ct值＞36；

内标基因：所有样本检测中，内标对应荧光通道扩增曲线有明显的指数增长期，Ct值≤36。

步骤S302，基因型判定，所述基因型判定包括：

在实验有效的情况下根据下表对样本检测结果进行判定，确定样本MTHFR基因的多态性。

通过上述方法进行结果判断，可以对其进行结果判断，确保结果的可靠性。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本实施例提供一种检测人MTHFR基因多态性的试剂盒，包括24份PCR反应体系，与每份PCR反应体系中对应配套的阴性对照品和阳性对照品，其中，阳性对照品中含有MTHFR677C质粒(委托通用生物系统(安徽)有限公司合成)和MTHFR 677T质粒(委托通用生物系统(安徽)有限公司合成)，阴性对照品为TE缓冲液，每份PCR反应体系具体包括PCR反应缓冲液、dNTPs、MTHFR 677上游引物、MTHFR 677下游引物、MTHFR野生型探针、MTHFR突变型探针、内标上游引物、内标下游引物、酶活为1U的Taq酶和酶活为0.5U的UDG酶，部分组分含量如下表所示：

上表中，MTHFR上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，MTHFR下游引物，MTHFR下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；MTHFR 677野生型探针的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示，其第七位碱基连接有锁核酸，5’端标记有FAM荧光基团，3’端同时连接有小沟化合物和非荧光淬灭基团NFQ；MTHFR 677突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，其第七位碱基连接有锁核酸，5’端标记有FAM荧光基团，3’端同时连接有小沟化合物和非荧光淬灭基团NFQ；内标上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示、内标下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示、内标探针核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。dNTPs包括dATP、dUTP、dCTP及dGTP，PCR反应缓冲液为购买自菲鹏生物股份有限公司Anstart Taq Polymerase。

实施例2

本实施例提供实施例1试剂盒对15例血液待测血液样品的检测实验，具体操作如下：

提取试剂：购买自天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒DP348

1.血液样品基因组DNA提取

往200μL新鲜抗凝血样本中加入2.5倍体积的细胞裂解液CL，缓慢上下颠倒混匀20次；10000rpm离心1min收集细胞核沉淀，弃净红色上清；往沉淀中加入200μL缓冲液GB、20μL蛋白酶K(20mg/mL)，涡旋混匀，56℃孵育10min；加入350μL缓冲液BD充分颠倒混匀；将混合液加入到吸附柱CG2中，12000rpm离心离心30sec，弃滤液；加500μL缓冲液GDB到吸附柱CG2中，12000rpm离心30sec，弃滤液；加600μL漂洗液PWB到吸附柱CG2中，12000rpm离心30sec，弃去收集管中的滤液，将吸附柱CG2放回收集管中；重复上一操作步骤；12000rpm离心2min，以除尽残留的漂洗液PWB。将吸附柱CG2置于新的、灭菌的1.5mL EP管中，敞开盖子室温放置2min。加入50μL洗脱缓冲液TB到吸附柱CG2滤膜中央，室温静置2min，12000rpm离心2min；收集产物(即为纯化的基因组DNA)，-20℃保存。

2.试剂准备

按照待测样本数15个加1个阳性对照和1个阴性对照，取试剂盒中对应数量的PCR反应体系23μL/孔×17，充分混匀后每个扩增反应管分装23μL，分别加入阳性对照品、阴性对照品、以及处理好的15个样本2μL，使得总反应以及为25μL，盖好盖子并转移至PCR扩增室。

3.PCR扩增

按如下程序进行PCR扩增反应：50℃处理2分钟，95℃预变性3分钟，预变性后按照以下程序进行40个循环：95℃15秒，59℃40秒。

4.15例样本检测结果如下：

MTHFR 677C/C纯合野生样本8例，其中一个检测结果如图1所示，图1中，1为野生型信号，2为内标信号；

MTHFR 677T/T纯合突变样本3例，其中一个检测结果如图2所示，图2中，1为内标信号，2为突变型信号；

MTHFR 677C/T杂合突变样本4例，其中一个检测结果如图3所示，图3中，1为内标信号，2为野生型信号，3为突变型信号。

同时，上述15例样本采用金标测序法进行检测，结果一致率为100％，说明本发明检测方法结果准确可靠，操作简单便捷，更有利于临床应用和大规模推广。

实施例3

本实施例提供一种检测人MTHFR基因多态性的试剂盒，其组分与实施例1大体一致，唯一不同的是，MTHFR 677野生型探针的第八位碱基连接有锁核酸，MTHFR 677突变型探针的第八位碱基连接有锁核酸，锁核酸(LNA)是一种含有桥接双环糖基(bridged,bicyclicsugar moiety)的合成核酸类似物。在2'-O-和4'-位之间添加的亚甲基基团将呋喃核糖环“锁定”为3'-内构象。将本实施例试剂盒按实施例2所述的方法采用将实施例2中的15例样本进行检测，检测结果如下：

与金标测试一致的MTHFR 677C/C纯合野生样本8例；

与金标测试一致的MTHFR 677T/T纯合突变样本3例；

与金标测试一致的MTHFR 677C/T杂合突变样本3例，其总一致率为93％。

对比例1

本对比例提供一种检测人MTHFR基因多态性的试剂盒，其组分与实施例1大体一致，不同的是，MTHFR 677引物对序列如SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:9所示，探针3'端处都加上MGB小沟结合物，在探针上的第七位碱基都连接锁核酸，锁核酸(LNA)是一种含有桥接双环糖基(bridged,bicyclic sugar moiety)的合成核酸类似物。在2'-O-和4'-位之间添加的亚甲基基团将呋喃核糖环“锁定”为3'-内构象。；本对比例试剂盒按实施例2所述的方法采用将实施例2中的15例样本进行检测，检测结果如下：

与金标测序法一致的MTHFR 677C/C纯合野生样本7例；

与金标测序法一致的MTHFR 677T/T纯合突变样本3例；

与金标测序法一致的MTHFR 677C/T杂合突变样本3例；

对比例显示的结果一致率为87％。

从上述结果可以看出，本实施例试剂盒相较于对比例1而言，其引物设计不同，实施例的测试准确率达到93％以上，另外，发明人研究团队发现，在探针上的第七位碱基连接锁核酸，以及在3’端连接小沟结合物，可以进一步提高测试准确率至100％。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 深圳市国赛生物技术有限公司

<120> 一种检测人MTHFR基因多态性的引物和探针组合及其试剂盒

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cctcaaagaa aagctgcgtg at 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccttcacaa agcggaagaa 20

<210> 3

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggagccga ttt 13

<210> 4

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgggagtcga tt 12

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctcactcct tttgcagacc ac 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agtagaggca gggatgatgt tct 23

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tggatggccc ctccgggaaa ct 22

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaaggtgtct gcgggagc 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agaaggtgtc tgcgggatc 19