一种琼胶酶突变体及其编码基因和应用

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种琼胶酶突变体及其编码基因，含有该编码基因的重组载体和细胞，以及该琼胶酶突变体的制备方法与应用。通过理性设计对野生琼胶酶点突变获得一种琼胶酶突变体E122W，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该琼胶酶突变体的酶活力和热稳定均有明显提高，可以高效催化降解琼胶制备琼胶寡糖，且琼胶寡糖收率较高，满足工业化生产需要，为琼胶酶在生物化工、食品、医药等领域的研究应用和琼胶寡糖的工业化生产奠定基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种琼胶酶突变体及其编码基因和应用，属于生物技术领域。

背景技术

琼胶酶是一类特异性降解琼胶多糖的酶，根据琼胶酶作用方式的不同，可将琼胶酶分为 α-琼胶酶和β-琼胶酶两类，α-琼胶酶作用于琼脂糖的α-1，3糖苷键，产生以3，6-内醚-α- L-半乳糖为还原端的琼寡糖(Agarooligosaccharides，AOS)；β-琼胶酶作用于β-1，4糖苷键， 产生以β-D-半乳糖为还原端的新琼寡糖(Neoagarooligosaccharides，NAOS)。糖生物学研究 表明琼胶寡糖具有抗氧化、抗肿瘤、美白保湿等多种生理活性，在化工、保健食品和医药领 域具有重要的应用价值。

酶法制备是生产琼胶寡糖主要方法之一，但是由于琼胶结构较复杂，由(1-3)-β-D-半 乳糖和(1-4)-3、6-内醚-α-L-半乳糖等组成，且凝点和熔点的温度相差较大，往往需要较高 的温度才能使琼脂处于溶胶状态，使得在实际应用中对酶的耐受温度及温度稳定性要求较高； 而现阶段研究中所报道的琼胶酶的热稳定性较差，大部分琼胶酶在高温下作用较短时间后便 丧失大部分酶活性，严重限制了琼胶酶及琼胶寡糖的开发应用。

酶的改造是提高酶的催化效率、改善酶学性质，提高耐受温度和温度稳定性的一种重要 技术手段。据本发明人通过查阅资料、文献检索所知，曲雯雯等发表了通过易错PCR技术 对嗜琼胶卵链菌(Catenovulumagarivorans)的β-琼胶酶YM01-3进行随机突变，研究影响β-琼 胶酶YM01-3酶活力的关键位点(曲雯雯，微生物学通报，2018,45(9):2000-2005)；郭玉 浙等发表了通过理性设计，重叠延伸PCR技术对产微球茎菌AG1的琼胶酶进行定点突变， 获得酶热稳定性高的琼胶酶突变体D136N(郭玉浙，中国食品学报，2019，19(12):83-88)； Lu等发表了一种Pseudoalteromonassp.CY24来源的β琼胶酶AgaA，通过定点突变研究了β 琼胶酶AgaA的关键催化位点(X Lu，Biotechnol Lett(2009)31:1565–1570)；Xu等发表了 Thalassomonas sp.LD5来源的新型α-琼胶酶AgaE，并通过定点突变研究发现天冬氨酸对α- 琼胶酶AgaE的催化活性起到关键作用(Jingnan Xu，InternationalJournal of Biological Macromolecules，194(2022)50–57)。专利《一种定点突变改造热稳定性提高的琼胶酶突变 体》(CN 109207459 B)公开了一种通过定点突变提高稳定性的弧菌Vibrio sp.来源的琼胶酶 及其制备琼胶寡糖的应用。本发明在前期获得一种酶活力和稳定性较为优良的琼胶酶，通过 分子改造进一步提高其温度稳定性，满足工业化生产的需要，推动琼胶酶及琼胶寡糖工业发 展。

发明内容

针对现有技术问题，本发明提供了一种琼胶酶突变体及其编码基因和应用。本发明对野 生琼胶酶的氨基酸进行点突变得到琼胶酶突变体，该突变体酶活力热稳定性明显提高，可以 高效催化降解琼胶制备琼胶寡糖，满足工业化生产需要。

为解决现有技术问题，本发明采用如下技术方案实施：

本发明首先提供一种琼胶酶突变体，在野生琼胶酶的氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上 进行点突变获得的琼胶酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列SEQ ID NO.1所示琼胶酶的第 122位由谷氨酸(E)突变为色氨酸(W)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述野生琼胶酶来源于Pseudoalteromonassp.QM222。

在本发明的一种实施方式中，所述野生琼胶酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明还提供了一种琼胶酶突变体编码基因，编码所述琼胶酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，当所述的琼胶酶突变体为E122W时，其编码基因的核苷 酸序列如SEQ ID NO.10所示。

发明还提供了一种重组载体，包含上述琼胶酶突变体的编码基因的载体。

在本发明的一种实施方式中，上述重组载体的质粒为大肠杆菌pProEXHTA质粒。

本发明还提供一种重组细胞，其包含上述琼胶酶突变体编码基因或重组载体。

在本发明的一种实施方式中，上述重组细胞由包含琼胶酶基因的重组载体经转化宿主细 胞而得。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞BL21(DE3)。

本发明还提供一种制备琼胶酶突变体的方法，包括以下步骤：

(1)构建野生琼胶酶重组载体：提取菌株Pseudoalteromonas sp.QM222(保藏编号： CCTCC NO.M2018744)基因组，克隆获得野生琼胶酶基因，将野生琼胶酶基因与大肠杆菌 质粒连接，获得野生琼胶酶重组载体；

(2)构建琼胶酶突变体重组载体：以步骤(1)中的野生琼胶酶重组载体为模板，经点 突变获得琼胶酶突变体重组载体；

(3)构建琼胶酶突变体重组细胞：将步骤(2)中的琼胶酶突变体重组载体转化至大肠 杆菌得到琼胶酶突变体重组细胞；

(4)：琼胶酶突变体表达与纯化：将步骤(3)中琼胶酶突变体重组细胞进行培养，诱导表达重组蛋白，分离、纯化得琼胶酶突变体。

本发明还提供了琼胶酶突变体、琼胶酶突变体编码基因、重组载体、重组细胞或上述制 备方法制备的琼胶酶突变体在降解琼胶或制备新琼寡糖上的应用。

与现有技术对比，本发明的优点和有益效果：

本发明提供的琼胶酶突变体与野生琼胶酶相比，突变体E122W发酵酶活力提高47.0％， 在45℃，50℃下处理1小时，突变体E122W相对酶活为79.75％和55.15％，比野生琼胶酶 分别提高27％和35.14％，突变体E122W在45℃下的酶活半衰期是野生琼胶酶的1.3倍，说 明琼胶酶突变体在酶活力和热稳定性方面均有明显提高。

本发明提供的琼胶酶突变体耐热性明显提高，可以在较高温度下催化降解琼胶制备琼胶 寡糖，高温利于琼胶形成溶胶状态，避免凝结，高效催化降解琼胶产生琼胶寡糖，提高琼胶 寡糖回收率，降低生产成本，利于工业化应用。

本发明提供的琼胶酶突变体具有酶活力高，热稳定好，催化效率高的优良性状，突破琼 胶酶酶活力低、热稳定性差等技术壁垒，可以显著提高降解效率和琼胶寡糖回收率，满足工 业生产需要，在生物化工、饲料、食品、医药等领域具有广泛的应用前景。

本发明所涉及术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技 术人员通常所了解相同的含义。

本文中出现的各种氨基酸序列中的氨基酸是根据它们公知的三字母或单字母缩写来表示 的，如赖氨酸三字母缩写为Lys，单字母缩写为K。出现在各种DNA片段中的核苷酸，是用 本领域常规使用的标准的单字母标识来表示的。

术语“核苷酸”意指脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制， 否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的 结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。

术语“突变”和“突变体”指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存在的或引入的 变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。

术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明核苷酸或多肽、蛋白的细胞。外 源性核苷酸可保持为非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

术语“转化”指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。

保藏信息：假交替单胞菌QM222Pseudoalteromonas sp.QM222，该菌株于2018年11月05 日保藏于中国典型培养物菌种保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，假交替单胞菌QM222 Pseudoalteromonas sp.QM222的保藏编号为：CCTCC NO：M 2018744。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，其中：

图1：琼胶酶突变体在不同温度的稳定性。其中横坐标为琼胶酶突变体，纵坐标为相对 酶活。

图2：琼胶酶突变体的热失活曲线。其中，横坐标为时间，纵坐标为相对酶活。

图3：琼胶寡糖的质谱图谱。横坐标为m/z，纵坐标为离子流强度。

图4：琼胶寡糖的

具体实施方式

本发明提供了一种琼胶酶突变体、琼胶酶突变体制备方法与应用、编码该琼胶酶突变体 的核苷酸序列、载体、宿主细胞，实现了琼胶酶突变体的工程化表达。下面结合具体实施例， 进一步阐明本发明的技术方案，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明 的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等 编著，分子克隆实验指南，第四版，科学出版社，2017中所述的条件或按照制造厂商所建 议的条件。

1.菌株、载体及试剂盒

大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)、载体pProEX HTA购自Invitrogen公司。

PCR酶及连接酶购买自Takara公司。

DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，无缝克隆试剂盒购自诺唯赞公司，纯化试剂盒、质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购自Omega公司。

2.培养基

LB液体培养基：0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，1％NaCl，pH 7.0。

LB固体培养基：0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，1％NaCl，琼脂2％，pH 7.0。

发酵培养基：0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，1％NaCl，0.25％磷酸氢二钾，0.1％硫酸 镁，0.5％葡萄糖(单独灭菌)，pH 7.0。

补料培养基：50％葡萄糖，1％酵母浸粉，2％胰蛋白胨，1％硫酸镁。

3.琼胶酶活力测定方法

采用3，5-二硝基水杨酸法测定酶活力。用0.02mol/L Na

酶活力单位(U)定义为在实验条件下，每分钟催化底物产生1μg还原糖所需的酶量。 发酵液酶活力单位定义为每毫升发酵液含酶活单位(U/mL)。

实施例1.野生琼胶酶基因克隆与载体构建

根据TIAamp Bacteria DNA Kit(TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO.,LTD)试剂盒的操作说明提取对数生长期假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.QM222(保藏编号：CCTCCNO.M2018744)的基因组，经1％琼脂糖凝胶电泳结果显示DNA条带均一性良好，将提取 的基因组样品进行基因测序(北京诺禾致源科技股份有限公司)。

以Pseudoalteromonas sp.QM222基因组为模板，根据测序结果和功能基因分析，以含 有限制性内切酶酶切位点的引物EcoR I-F和Kpn I-R扩增琼胶酶基因AgaZ537(不含信号 肽)：

EcoR I-F：

CCG

Kpn I-R：

CGG

其中，

采用PCR进行基因扩增，构建50uL扩增反应体系：模板DNA，1μL；F(10μM)，1μL； R(10μM)，1μL；dNTP(各2.5mM)，4μL；Taq(2U/μL)，1μL；10×Taq buffer，5μL；ddH2O， 补至50μL。

PCR扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，循环扩增35次，72℃终延伸5min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检验为单一特异性条带后测序，核苷酸序列如序列表 SEQ.ID.NO.9所示，将SEQ.ID.NO.9所示基因序列与全基因组序列比对，与全基因组中功能 基因序列一致，得到基因长度为1281bp的琼胶酶基因AgaZ537。该基因编码一个由426个氨基酸组成的蛋白质，氨基酸序列如序列表SEQ.ID.NO.1所示。

对pProEXHTa空载质粒和PCR产物利用限制性内切酶EcoR I，Kpn I进行双酶切，按照胶回收试剂盒(OMEGA Bio-Tek Co.)操作说明回收线性质粒，按照Cycle-Pure Kit(OMEGA Bio-Tek Co.)试剂盒操作说明进行AgaZ537基因纯化。利用T4 DNA连接酶对线 性化质粒及AgaZ537基因进行连接，连接体系为：线性化pProEXHTa质粒，8μL；AgaZ537 基因，2μL；T4 DNA Ligase，1μL；10×buffer T4 DNA Liagse，2μL；ddH2O，补至20μL。 连接条件为：16℃连接12h。

经T4 DNA连接酶连接后的重组载体pProEXHTa-AgaZ537经热激转化(42℃，60s)转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有100μg/mL氨苄青霉素钠的LB固体平板上37℃培 养12h，LB固体平板生长菌株经PCR筛选突变阳性转化子，将阳性转化子接种至20mL LB 液体培养基中于37℃160rpm培养10h，利用Plasmid Mini Kit(OMEGA Bio-Tek Co.,LTD) 进行质粒提取，获得野生琼胶酶重组表达载体pProEXHTa-AgaZ537。

实施例2.琼胶酶突变体基因克隆与载体构建

基于大数据统计软件Alphafold2和野生琼胶酶氨基酸序列预测其三维结构，通过野生琼 胶酶氨基酸序列的表面电荷及底物-酶相互作用分析筛选，影响野生琼胶酶热稳定性关键氨 基酸为Glu

E122W-F：CAATGAC

E122W-R：TCTCTCG

E122V-F：CAATGAC

E122V-R：TCTCTCG

E122R-F：CAATGAC

E122R-R：TCTCTCG

E122L-F：CAATGAC

E122L-R：TCTCTCG

E122N-F：CAATGAC

E122N-R：TCTCTCG

E122Q-F：CAATGAC

E122Q-R：TCTCTCG

E122I-F：CAATGAC

E122I-R：TCTCTCG

以野生琼胶酶重组载体pProEXHTa-AgaZ537为模板，利用引物SEQ ID NO.19-SEQID NO.32，进行PCR扩增表达载体全长，构建50μL扩增反应体系：质粒DNA模板，1μL；2×Phanta Max Buffer，25μL；dNTP Mix(10mM each)，1μL；F(10μM)，2μL；R (10μM)，2μL；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，1μL；ddH

上述PCR产物利用Dpn I酶在37℃下酶解2h以对野生琼胶酶重组表达载体模板进行消 化，消化体系为：PCR产物，50μL；Dpn I，2μL；Fastdigest Buffer，6μL；ddH

将纯化产物按照

无缝克隆连接后的重组载体经热激转化(42℃，60s)转入大肠杆菌DH5α感受态细胞 中，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上37℃培养12h，LB固体平板生长菌株经PCR筛选突变阳性转化子，对PCR产物进行测序鉴定，突变体核苷酸序列如SEQ ID NO.10-16所示，对应突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.8所示。将突变阳性转 化子接种至含有100μg/mL氨苄青霉素钠的LB液体培养基中37℃，160rpm培养10h，利用 PlasmidMini Kit(OMEGA Bio-Tek Co.)进行质粒提取，获得重组表达载体 pProEXHTa-E122W、pProEXHTa-E122V、pProEXHTa-E122R、pProEXHTa-E122L、 pProEXHTa-E122N、pProEXHTa-E122Q和pProEXHTa-E122I。

表1突变体氨基酸序列

实施例3.琼胶酶突变体制备

重组细胞构建

野生琼胶酶重组表达载体pProEXHTa-AgaZ537及重组突变表达载体pProEXHTa-E122W、 pProEXHTa-E122V、pProEXHTa-E122R、pProEXHTa-E122L、pProEXHTa-E122N、pProEXHTa-E122Q和pProEXHTa-E122I经热激转化(42℃，60s)转入大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞中，在含有100μg/mL氨苄青霉素钠的LB固体平板上37℃培养12h，经PCR筛 选野生琼胶酶重组细胞BL21(DE3)-pProEXHTa-AgaZ537和琼胶酶突变体重组细胞 BL21(DE3)-pProEXHTa-E122W、BL21(DE3)-pProEXHTa-E122V、BL21(DE3)-pProEXHTa- E122R、BL21(DE3)-pProEXHTa-E122L、BL21(DE3)-pProEXHTa-E122N、BL21(DE3)- pProEXHTa-E122Q和BL21(DE3)-pProEXHTa-E122I。

摇瓶发酵

将野生型重组细胞和突变重组细胞分别接种至含100μg/mL氨苄青霉素钠的LB液体培 养基中，37℃，160r/min培养10h得种子液。然后按照2％接种量将种子液接种至含有100μg/mL氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，37℃，160r/min培养至OD

分别将野生型琼胶酶发酵液和琼胶酶突变体发酵液在4℃，8000r/min离心10min，收集 菌体，用pH＝7.5，20mM磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤菌体，然后用发酵液相同体积PBS缓冲液重悬菌体，冰浴下破碎细胞，将破碎后的菌液在4℃，8000r/min离心10min，收集上 清液。按照酶活测定方法测定酶活力，酶活力结果见表2。野生琼胶酶WT(AgaZ537)发 酵酶活力为3320U/mL，突变体酶活力在4410U/mL～4880U/mL，比野生琼胶酶酶活力提高 32.8％～47.0％，其中突变体E122W酶活力最高为4880U/mL，比野生琼胶酶提高47％。结果 表明通过理性设计可以提高琼胶酶突变体酶活力。

表2琼胶酶突变体酶活力

发酵罐发酵

将BL21(DE3)-pProEXHTa-E122W接种于含100μg/mL氨苄青霉素钠的LB液体培养基中， 37℃，160r/min培养10h得种子液。按照2％接种量接种于装有2L发酵培养基的5L发酵罐 中，控制培养温度37℃，pH7.2，通气量2vvm，溶氧控制在20～30％与转速关联，初始培养基中的糖耗尽后，流加补料培养基至发酵液OD

实施例4.琼胶酶突变体的温度稳定性

将实施例3摇瓶发酵的菌体上清液(共8种)分别用镍柱亲和层析进行初步分离纯化， 收集初步分离纯化产物；然后用QFF-

将上述纯化野生琼胶酶和琼胶酶突变体调节到相同酶活力，分别在40℃，45℃和50℃ 保温1小时，按照酶活测定方法测定酶活，将未经温度处理的酶活力定义为100％，以相对 酶活做图，实验结果见附图1，结果表明野生琼胶酶与琼胶酶突变体在40℃、45℃均具有良 好的稳定稳定性，保温1小时相对酶活均大于50％，在50℃下温度稳定性有所降低。在40℃ ～50℃范围内，琼胶酶突变体温度稳定性均优于野生琼胶酶，如在45℃下野生琼胶酶相对酶 活为52.75％，而琼胶酶突变体的相对酶活为55.54％～79.75％。突变体E122W温度稳定性最 好，在40℃、45℃、50℃相对酶活分别为97.22％，79.75％，55.15％，分别是野生琼胶酶相 对酶活的131％，151％和276％，表明温度越高，突变体温度稳定性优势越明显。

进一步将纯化野生琼胶酶与琼胶酶突变体分别在45℃下保温360分钟，每隔60分钟取 样按照酶活测定方法测定酶活，将未经温度处理的酶活力定义为100％以相对酶活做图，结 果见附图2，结果表明突变体在45℃下的稳定性均优于野生琼胶酶，其中突变体E122W最 好。根据Arrhenius方程计算琼胶酶的热失活动力学参数：失活速率常数(k)和半衰期 (t

表3琼胶酶热失活动力学参数

实施例5.琼胶酶突变体降解琼胶制备琼胶寡糖

用纯化水配制浓度为0.5％的琼胶溶液1L，加热到95～100℃至琼胶完全溶解，冷却并保 温至42±1℃，调节pH 7.5，按照加酶量1U:50mg加入纯化的琼胶酶突变体E122W，42±1℃ 保温反应6小时，加热到95～100℃保温10分钟灭酶8000r/min离心10min，收集上清液。 向上清液中加入2倍体积的无水乙醇，静置沉淀未降解的大分子琼胶，8000r/min离心10min，收集上清液，继续向上清液中加入6倍体积的无水乙醇至8倍体积的无水乙醇，干 燥得到琼胶寡糖样品。共制备干燥琼胶寡糖样品3.42g，产品收率68.4％。

对酶解产物进行ESI-MS分析，采用负离子电离模式，扫描范围质核比(m/z)：100-3000，质谱图谱见附图3，ESI-MS扫描结果表明：酶解6h的样品中主要有m/z为629.2、665.2、935.3和971.4四种离子峰，分别代表琼胶四糖(m/z:629.2)、琼胶四糖氯化物 (m/z:665.2)、琼胶六糖(m/z:935.3)、琼胶六糖氯化物(m/z:971.4)，表明琼胶酶突变体降 解琼胶产生以琼胶四糖和琼胶六糖为主要组分的琼胶寡糖。

琼胶寡糖与新琼寡糖具有不同的还原性末端，通过分析琼胶寡糖还原性末端的异头物的 C1位的化学位移可判断产物为琼胶寡糖还是新琼寡糖。琼胶寡糖的

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对 本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所表述 的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使 相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛海洋生物医药研究院股份有限公司

<120> 一种琼胶酶突变体及其编码基因和应用

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 426

<212> PRT

<213> Pseudoalteromonas sp.

<400> 1

Asn Asp Trp Asp Ser Ile Pro Leu Pro Val Thr Pro Gly Asp Gly Lys

1 5 10 15

Val Trp Gln Leu Gln Glu Thr Tyr Ser Asp Ser Phe Asn Tyr Thr Gly

20 25 30

Lys Pro Ala Ala Phe Thr Ser Lys Trp Asn Asp Thr Tyr Phe Asn Ser

35 40 45

Trp Thr Gly Pro Gly Leu Thr Tyr Trp Gln Gln Asp Glu Ser Trp Val

50 55 60

Ser Asp Gly Asn Leu Ile Ile Ser Ala Ser Arg Arg Ala Gly Thr Asp

65 70 75 80

Lys Val Asn Ala Gly Val Ile Thr Ser Lys Thr Lys Val Ser Phe Pro

85 90 95

Ile Phe Leu Glu Ala Asn Ile Lys Val Ser Asn Leu Glu Leu Ser Ser

100 105 110

Asn Phe Trp Leu Leu Ser Asp Asn Asp Glu Arg Glu Ile Asp Val Leu

115 120 125

Glu Val Tyr Gly Gly Ala Arg Asp Asp Trp Phe Ala Lys Asn Met Ser

130 135 140

Thr Asn Phe His Val Phe Ile Arg Asp Gln Gln Ser Asn Gln Ile Ile

145 150 155 160

Ser Asp Tyr Asn Asp Gln Thr His Asn Thr Pro Ser Trp Gly Thr Tyr

165 170 175

Trp Arg Glu Gly Phe His Arg Phe Gly Val Tyr Trp Lys Ser Pro Thr

180 185 190

Glu Val Thr Phe Tyr Ile Asp Gly Gln Gln Thr Pro Asp Gly Ser Trp

195 200 205

Ala Gln Val Val Met Lys Asp Lys Asp Tyr Thr Gly Ala Thr Leu Asn

210 215 220

Lys Asn Thr His Asn Met Asp Gln Ser Ala Tyr Ile Ile Ile Asp Thr

225 230 235 240

Glu Asp His Asp Trp Arg Ser Glu Ala Gly Asn Ile Ala Thr Asp Ala

245 250 255

Asp Leu Ala Asp Gly Ser Lys Asn Lys Met Tyr Val Asp Trp Val Arg

260 265 270

Val Tyr Lys Pro Val Asn Ala Ser Asn Thr Asn Ser Val Ser Asn Gly

275 280 285

Ala Gln Ile Lys Ala Lys His Ser Gln Lys Cys Ile Asp Ile Thr Ala

290 295 300

Gly Ala Met Ser Asn Gly Ser Tyr Tyr Gln Gln Trp Gly Cys Gly Ser

305 310 315 320

Asp Asn Ala Asn Gln Gln Phe Asn Leu Val Glu Leu Ser Asn Asn Glu

325 330 335

Tyr Ala Ile Ser Ser Gln Leu Ser Gly Leu Cys Met Gln Ile Glu Asn

340 345 350

Ala Ser Thr Ser Asn Gly Ala Lys Leu Glu Gln Trp Val Cys Asp His

355 360 365

Ala Lys Ala Ser Gln Arg Phe Thr Leu Asn Ser Thr Gly Asp Gly Tyr

370 375 380

Phe Glu Leu Lys Ser Ser Leu Ser Asn Lys Cys Val Asp Ile Ala Gly

385 390 395 400

Lys Leu Gln Thr Asp Gly Ala Asp Ile Val Gln Trp Gln Cys Tyr Asn

405 410 415

Gly Asp Asn Gln Arg Phe Gln Phe Ile Glu

420 425

<210> 2

<211> 426

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asn Asp Trp Asp Ser Ile Pro Leu Pro Val Thr Pro Gly Asp Gly Lys

1 5 10 15

Val Trp Gln Leu Gln Glu Thr Tyr Ser Asp Ser Phe Asn Tyr Thr Gly

20 25 30

Lys Pro Ala Ala Phe Thr Ser Lys Trp Asn Asp Thr Tyr Phe Asn Ser

35 40 45

Trp Thr Gly Pro Gly Leu Thr Tyr Trp Gln Gln Asp Glu Ser Trp Val

50 55 60

Ser Asp Gly Asn Leu Ile Ile Ser Ala Ser Arg Arg Ala Gly Thr Asp

65 70 75 80

Lys Val Asn Ala Gly Val Ile Thr Ser Lys Thr Lys Val Ser Phe Pro

85 90 95

Ile Phe Leu Glu Ala Asn Ile Lys Val Ser Asn Leu Glu Leu Ser Ser

100 105 110

Asn Phe Trp Leu Leu Ser Asp Asn Asp Trp Arg Glu Ile Asp Val Leu

115 120 125

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tcacagttaa gtggcttgtg catgcagatt gaaaacgcca gtacaagtaa tggcgctaag 1080

ttggagcagt gggtttgtga tcatgcaaaa gccagtcaac gctttactct caatagcacg 1140

ggtgatggct acttcgagct caaatcaagt ttaagtaata aatgtgttga tatcgcaggt 1200

aaactgcaaa cagatggtgc tgatattgta cagtggcagt gttataacgg cgacaatcaa 1260

cgttttcaat ttattgaata a 1281

<210> 12

<211> 1281

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aatgattggg actcaattcc tttaccggtt actcccggtg atggcaaagt ctggcagcta 60

caagaaacat actcagactc atttaattac actggtaaac ctgctgcatt taccagtaaa 120

tggaatgata cttactttaa tagttggaca ggcccaggtt taacctattg gcaacaagat 180

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gatataacag ctggcgctat gagtaatggc tcttattatc agcagtgggg ttgtggctct 960

gataatgcta accaacaatt taaccttgtt gagttaagta ataatgaata tgcaattagc 1020

tcacagttaa gtggcttgtg catgcagatt gaaaacgcca gtacaagtaa tggcgctaag 1080

ttggagcagt gggtttgtga tcatgcaaaa gccagtcaac gctttactct caatagcacg 1140

ggtgatggct acttcgagct caaatcaagt ttaagtaata aatgtgttga tatcgcaggt 1200

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gcgacgttaa acaagaacac acataatatg gatcaatccg cttatatcat tattgataca 720

gaagatcacg attggcgttc agaggcggga aatattgcta cagatgccga tttggctgac 780

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