高效液相色谱串联质谱法检测血浆中CMPF含量的方法

摘要

本发明提供一种高效液相色谱串联质谱法检测血浆中CMPF含量的方法，包括血浆样本前处理及采用高效液相色谱串联质谱法检测经过前处理的血浆样本中的CMPF含量，具体先利用高效液相色谱将CMPF分离，再利用质谱同位素内标法进行定量，以目标化合物与其同位素内标的浓度比为X轴，目标化合物与其同位素内标的峰面积比为Y轴，建立校正曲线，计算血浆中CMPF的含量。本申请在样本前处理过程中通过蛋白沉淀板和有机溶剂的组合，使蛋白沉淀更为完全，能有效去除杂质，降低基质效应，不仅提高了沉淀效率，大大缩短了样本前处理和检测时间，同时在样本前处理中加入含有CMPF同位素内标的有机溶剂，能有效克服因样本个体间基质差异引起的干扰。

说明书

技术领域

本发明涉及血浆中CMPF检测技术领域，具体涉及一种高效液相色谱串联质谱法检测血浆中CMPF含量的方法。

背景技术

CMPF又称3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(3-carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furanpropanoic acid)是呋喃脂肪酸代谢产生的内源性代谢产物，是一种主要的尿毒症毒素。近来相关研究发现，妊娠期糖尿病(GDM)、2型糖尿病(T2DM)、糖尿病前期以及2型糖尿病一级亲属(FDRs)人群中血清CMPF水平均显著升高，而CMPF含量浓度的增加，可诱导葡萄糖耐受不良(glucose intolerance)，损坏葡萄糖刺激的胰岛素分泌，并降低葡萄糖的利用，从而导致胰腺中β细胞(亦称胰岛B细胞)的胰岛素分泌下降，导致糖尿病的进一步发展，因此CMPF可用于糖尿病监控的生化指标。研究表明，CMPF与IGT、GDM、T2DM、FDRs有着密切的关联，但CMPF糖代谢的关联仍未完全清楚，因此临床上需要准确检测CMPF的方法，进一步研究CMPF对胰岛B细胞的确切作用及其具体的调节机制，可为糖尿病的治疗提供新的方向，具有深远的意义和广阔的临床应用前景。

目前，CMPF的检测方法主要有均相酶免疫法、化学免疫法、高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)。而本申请的发明人经过临床研究发现，均相酶免疫法和化学免疫法存在以下缺陷：一是灵敏度低，当样本浓度很低时，需要较大的样本量富集、纯化；二是适用性差，待测物的抗体易与结构相似的内源性物质或代谢产物产生交叉反应，造成假阳性结果；三是分析效率低，样本处理步骤复杂。高效液相色谱-串联质谱法能够避免前述均相酶免疫法和化学免疫法存在的缺陷，但是目前采用UPLC-MS/MS检测CMPF的样本时，一方面样本前处理时间和检测时间较长，而较长的前处理时间会限制临床上的应用；另一方面样本未使用同位素内标，未能有效克服因样本个体间的基质差异引起的干扰。

发明内容

针对现有UPLC-MS/MS检测CMPF样本时，一方面样本前处理时间和检测时间较长而限制临床应用，另一方面样本未使用同位素内标未能有效克服因样本个体间的基质差异引起干扰的技术问题，本发明提供高效液相色谱串联质谱法检测血浆中CMPF含量的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：

高效液相色谱串联质谱法检测血浆中CMPF含量的方法，包括以下步骤：

血浆样本前处理：准确移取100μL血浆样本置于96孔蛋白沉淀板，加入含有CMPF同位素内标的有机溶剂，置于恒温振荡仪中，700rpm振荡3min，置于正压装置上，调节流量至40psi下，接取过滤液，作为液相色谱串联质谱检测样本备用；

采用高效液相色谱串联质谱法检测经过前处理的血浆样本中的CMPF含量：先利用高效液相色谱将CMPF分离，再利用质谱同位素内标法进行定量，以CMPF目标化合物与CMPF同位素内标的浓度比为X轴，CMPF目标化合物与CMPF同位素内标的峰面积比为Y轴，建立校正曲线，计算血浆中CMPF的含量，具体仪器条件为：

(1)高效液相色谱条件：

流动相A：5mM甲酸铵水；

流动相B：0.1％甲酸+甲醇；

色谱柱型号：Waters UPLC HSS C18SB 2.1mm×50mm,1.8μm

柱温为40℃±5℃，进样量为10μL，进样盘温度为10℃±5℃，流速为0.4mL/min；

采用梯度洗脱方式，见下表1：

表1梯度洗脱程序

(2)质谱条件：

离子化模式：在电喷雾正离子模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为4.0kV；离子源温度为150℃；去溶剂气温度为650℃；去溶剂气流速为650L/Hr；同时监测目标化合物以及同位素内标；

多反应监测模式，离子参数：CMPF：239.1596>151.114，锥孔电压为32V，碰撞能量为16V；CMPF-d3：242.1596>154.173，锥孔电压为32V，碰撞能量为18V。

进一步，所述血浆样本前处理中加入含有CMPF同位素内标的有机溶剂按以下方法制备：以甲醇为溶剂配制1mg/ml的CMPF-d3标准品储备液，然后用甲醇制备出含1.0μg/mLCMPF-d3的有机溶剂。

进一步，所述CMPF目标化合物按以下方法配制：以甲醇为溶剂配制1mg/ml的CMPF标准品储备液，然后用5％m/v BSA溶液制备CMPF浓度分别为0.02μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、50μg/mL共7个梯度的混合标准品溶液分装于1.5mL棕色瓶中，置于-20℃保存备用。

与现有技术相比，本发明提供的高效液相色谱串联质谱法检测血浆中CMPF含量的方法具有以下优点：

1、本发明通过对样本前处理和高效液相色谱串联质谱条件进行优化，建立了一种快速、高通量检测血浆样本中CMPF含量的方法，是一种样本前处理简单、通量高、结果可靠的检测方法。

2、本发明提供的样本前处理过程中，通过蛋白沉淀板和有机溶剂的组合，相对于单纯用有机溶剂作为沉淀剂，蛋白沉淀更为完全，能有效去除杂质，降低基质效应，不仅提高了沉淀效率，而且大大缩短了样本前处理和检测时间，达到10min可完成96份样本的处理时间，2min内完成单个样本的分析，可快速灵敏检测出CMPF含量。

3、本发明的样本前处理中，在有机溶剂中添加了化学性质与CMPF基本一致的同位素内标，由此一方面同位素内标的氘代位置对CMPF的准确定量不造成干扰，另一方面能有效克服因样本个体间基质差异引起的干扰。

附图说明

图1是本发明提供的标准品中CMPF及其内标标准品的离子流图。

图2是本发明提供的采用同位素内标定量法建立的CMPF线性图。

图3是本发明提供的实际血浆样本中CMPF及其同位素内标离子流图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

本发明提供一种高效液相色谱串联质谱法检测血浆中CMPF含量的方法，包括以下步骤：

(1)CMPF目标化合物配制：以甲醇为溶剂配制1mg/ml的CMPF标准品储备液，然后用5％m/v BSA(牛血清白蛋白)溶液制备CMPF浓度分别为0.02μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、50μg/mL共7个梯度的混合标准品溶液分装于1.5mL棕色瓶中，置于-20℃保存备用。

(2)有机溶剂制备：以甲醇为溶剂配制1mg/ml的CMPF-d3标准品储备液，然后用甲醇制备出含1.0μg/mL CMPF-d3的有机溶剂。

(3)血浆样本前处理：准确移取100μL血浆样本置于96孔蛋白沉淀板，加入含有CMPF同位素内标的有机溶剂，置于恒温振荡仪中，700rpm振荡3min，置于正压装置上，调节流量至40psi下，接取过滤液，作为液相色谱串联质谱检测样本备用，即为液相色谱串联质谱检测做准备。

(4)采用高效液相色谱串联质谱法检测经过前处理的血浆样本中的CMPF含量：先利用高效液相色谱将CMPF分离，再利用质谱同位素内标法进行定量，以CMPF目标化合物与CMPF同位素内标的浓度比为X轴，CMPF目标化合物与CMPF同位素内标的峰面积比为Y轴，建立校正曲线，计算血浆中CMPF的含量，具体仪器条件为：

高效液相色谱条件：

流动相A：5mM甲酸铵水；

流动相B：0.1％甲酸+甲醇；

色谱柱型号：Waters UPLC HSS C18SB 2.1mm×50mm,1.8μm

柱温为40℃±5℃，进样量为10μL，进样盘温度为10℃±5℃，流速为0.4mL/min；

采用梯度洗脱方式，见下表1：

表1梯度洗脱程序

其中，上表1中Curve是指曲线类型，即流动相比例按照线性方式递增；

质谱条件：

离子化模式：在电喷雾正离子模式下，采用多反应监测(Multiple ReactionMonitoring，MRM)的质谱扫描模式，毛细管电压(Capillary)为4.0kV；离子源温度为150℃；去溶剂气温度(Desolvation Temp)为650℃；去溶剂气流速(Desolvation)为650L/Hr；同时监测目标化合物以及同位素内标，再分别对各目标物的锥孔电压和碰撞电压进行了优化，以便达到更高的稳定性和灵敏度；

多反应监测(MRM)模式，离子参数：CMPF：239.1596>151.114(定量离子对)，锥孔电压为32V，碰撞能量为16V；CMPF-d3(IS)：242.1596>154.173，锥孔电压为32V，碰撞能量为18V。

(5)样本测试结果：

(6)产品性能测试数据：

第一、标准品及样本中CMPF及其同位素内标的总离子流图：CMPF的标准品和血浆样本的峰型比较对称，在浓度不大于50μg/mL时基本没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，具体参见图1和图3所示。

第二、校正曲线：采用同位素内标定量法，利用现有MasstLynx软件以CMPF目标化合物(标准物)与CMPF同位素内标(内标物)的浓度比为X轴，CMPF目标化合物(标准物)与CMPF同位素内标(内标物)的峰面积比为Y轴，建立校正曲线，并计算血浆中待测物的浓度。CMPF在对应浓度范围内线性拟合方程线性良好，相关系数在0.995以上，满足定量要求，具体参见图2所示。

第三、加标回收率实验：收集低浓度混合人血浆，取10μL标准溶液+90μL混合血浆，配制成理论浓度为100ng/mL、500ng/mL、5000ng/mL、10000ng/mL样本，平行6份；涡旋混匀后按前述样本前处理步骤进行操作，测定结果见下表：

由上表可知，各加标浓度对应的加标回收率(Recovery)在80％～120％之间，相对标准偏差(RSD)在3％以内，重复性良好。

与现有技术相比，本发明提供的高效液相色谱串联质谱法检测血浆中CMPF含量的方法具有以下优点：

1、本发明通过对样本前处理和高效液相色谱串联质谱条件进行优化，建立了一种快速、高通量检测血浆样本中CMPF含量的方法，是一种样本前处理简单、通量高、结果可靠的检测方法。

2、本发明提供的样本前处理过程中，通过蛋白沉淀板和有机溶剂的组合，相对于单纯用有机溶剂作为沉淀剂，蛋白沉淀更为完全，能有效去除杂质，降低基质效应，不仅提高了沉淀效率，而且大大缩短了样本前处理和检测时间，达到10min可完成96份样本的处理时间，2min内完成单个样本的分析，可快速灵敏检测出CMPF含量。

3、本发明的样本前处理中，在有机溶剂中添加了化学性质与CMPF基本一致的同位素内标，由此一方面同位素内标的氘代位置对CMPF的准确定量不造成干扰，另一方面能有效克服因样本个体间基质差异引起的干扰。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。