优化和标准化微粒体的分离方法及其意义和应用

摘要

本发明涉及优化和标准化微粒体的分离方法及其意义和应用，包括先以3000g的离心速度于4℃下离心20min以清除血小板碎片，再以20000g的离心速度收获微粒体沉淀。本发明跟传统的微粒体分离方法明显不同，优化并标准化了微粒体的分离方法，重新定义获得微粒体的生理功能，澄清传统方法获得微粒体功能的某些错误认识，并将有助于对其特性和生理功能的重新进行深入研究，据此开发新的临床诊断标记。

说明书

技术领域

本发明属于生化分离领域，特别涉及优化和标准化血浆微粒体的分离方法及其意义和应用。

背景技术

微粒体是由多种细胞(如血小板、内皮细胞、白细胞和红细胞)在细胞活化或凋亡过程中通过细胞外膜出芽而产生的直径为50nm-1000nm的异质质膜囊泡。微粒体现在被认为是细胞间通讯的一种机制，可以为细胞交换蛋白质、脂质和遗传物质。因此，人们越来越相信微粒发挥多种功能：包括促凝血、血管重塑或新血管生成、促进细胞相互作用和信号传递、以及提供恶性细胞微环境等。近年来，尽管微粒体迅速成为许多领域的研究热门，但关于微粒的起源、生物发生、分泌、靶向，甚至微粒分离的方式，仍然存在很多困惑或未知。

因此，首先建立适当的微粒体标准化的分离方法具有重要价值。差速离心是微粒分离的基本方法，尽管已经对微粒进行了广泛的研究并发现它们的功能多种多样，但它们的分离方法缺乏公认的统一标准。尤其是去除细胞碎片的初始离心速度很少相同，导致其成分差异很大，但大多是血小板来源的，占70-90％。其组成成分的多样性自然导致其功能的多样性，甚至存在矛盾。为了澄清微粒体研究的这些困惑和不确定性，有必要系统地研究不同离心速度下微粒的组成，重新定义它们的生理功能。

血小板是源自巨核细胞的无核细胞成分，在调节止血和血栓形成、伤口修复和血栓形成疾病中发挥重要作用。微粒体首先被描述为源自正常血浆和血清中血小板的亚细胞物质，以前称为“血小板残渣”。长期以来，人们一直认为血浆中70-90％的微粒体来源于血小板。在健康个体中，血小板微粒体是最丰富的微粒亚型，占血液循环的95％。同时，还有报道它们在凝血、血管重塑或血管生成中的作用，所有这些都与血小板的功能相似。正如最近的研究所揭示的，除了这些众所周知的止血和炎症反应外，血小板活化还会导致血液中的微粒体形成，这正成为医学研究中越来越关注的焦点。因此，按照目前主流的微粒体方案(表1)，绝大多数微粒来源于血小板，其功能也依赖于血小板。这掩盖了许多其他细胞来源的微粒体的特征和功能，也干扰了微粒体研究的结果和结论。

表1不同参考文献报道的微粒体分离方法及其特征

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种优化和标准化微粒体的分离方法及其意义，该方法跟传统的微粒体分离方法明显不同，优化并标准化了微粒体的分离方法，重新定义获得微粒体的生理功能，澄清传统方法获得微粒体功能的某些错误认识，并将有助于对其特性和生理功能的重新进行深入研究，据此开发新的临床诊断标记。

本发明提供了一种优化和标准化微粒体的分离方法，包括：

先以3000g的离心速度于4℃下离心20min以清除血小板碎片，再以20000g的离心速度收获微粒体沉淀。

在3000g离心之前以1400g的离心速度于4℃下离心20min清除细胞碎片和血小板。

所述得到的微粒体血小板来源约占20％。

所述得到的微粒体沉淀大小均匀。

所述方法意义在于：重新定义获得的微粒体的生理功能，澄清传统方法获得微粒体功能的某些错误认识。

获得的微粒体由于其不同细胞来源成分的显著改变：由于血小板来源微粒体占比下降很多，导致其它细胞来源微粒体成分占比都上升3-6倍，这就有助于拓展了其在疾病临床诊断中的功能。

本发明系统地研究了不同离心速度区间的微粒体组成，发现3000g之后，无论是5000g、8000g、12000g还是20000g其组成成分都是相似的，也就是说不同细胞来源的微粒体比例相对稳定的。说明3000g后得到的微粒体可能是真正的微粒体。之后，通过电镜、DLS、免疫荧光结合流式细胞仪等进一步证实，3000g后其它细胞来源的微粒体比例非常稳定。

本发明通过电镜、DLS、免疫荧光结合流式细胞仪等进一步证实，3000g后其它细胞来源的微粒体比例非常稳定。还发现微粒体的抗凝、炎症免疫、细胞迁移和管形成功能可能需要重新定义，其中一些属于血小板而不是微粒体。本发明跟传统的微粒体分离方法明显不同，优化并标准化了微粒体的分离方法，重新定义获得微粒体的生理功能，澄清传统方法获得微粒体功能的某些错误认识，并将有助于对其特性和生理功能的重新进行深入研究，据此开发新的临床诊断标记。

附图说明

图1为检测不同离心速度获得不同细胞来源的微粒体。不同转速离心后，血小板来源的(CD41+)(a)、白细胞来源的(CD45+)(b)、血管内皮细胞来源的(CD144+)(c)、线粒体来源的(COX4+)(d)红细胞来源的(CD235a+)、(e)；以五种不同的离心速度获得的蛋白质量相对于总蛋白质的百分比(f)。

图2为检测不同离心速度获得微粒体的细胞来源。五种不同离心速度下血小板来源(CD41+)(a)、白细胞来源(CD45+)(b)和红细胞来源颗粒(Glycophorin)(c)的免疫荧光染色和流式细胞术分析的代表性图像。(d)为CD41、CD45等阳性微粒在不同离心速度下的统计分析。(e)为用针对CD41、CD36、Perilipin1、Glycophorin、CD45、Actin和Tom20的抗体对在不同离心速度下分离的颗粒进行Western Blot分析。

图3为三种不同方法收集血浆微粒体流程图。

图4为1400g-post和3000g-post离心获得的微粒体组成百分比和蛋白质量。血小板来源(CD41+)(a)、白细胞来源(CD45+)(b)、血管内皮细胞来源(CD144+)(c)、线粒体来源(COX4+)(d)和红细胞来源微粒体的百分比(CD235a+)(e)。(f)为3000g、3000g-post依次离心后蛋白质的百分比，总蛋白质等于1400g-post的蛋白质。

图5为微粒体的形态特征和尺寸。通过动态光散射(DLS)分析使用传统(1400g-post)(a)、3000g(b)和改进的3000g-post方法(c)获得的样品的微粒体大小分布图。(d)三种不同方法获得微粒体的大小分布图合并。(e)通过负染色透射电子显微镜(TEM)显示用于颗粒形态分析的代表性图像。(f)不同微粒体大小比例的统计分析。(g)定量分析三种不同的方法获得的微粒百分比。

图6为不同离心方案获得微粒体的组成成分。(a)为在传统(1400g-post)、3000g和改进的(3000g-post)离心方案下，免疫荧光染色和流式细胞仪分析来自不同细胞衍生标记物(如CD41、CD45(b)和Glycophorin(c))的微粒体。(d)不同离心速度下CD41、CD45和Glycophorin阳性微粒体百分比的统计分析。(e)使用针对CD36、CD45、Glycophorin、Perillipin1和细胞骨架蛋白Actin的Western blot分析。

图7为微粒体的促凝血活性。经微粒体处理添加10％FBS的正常细胞培养的DMEM培养基2分钟，然后用镊子取出凝块。

图8为促血管生成测定(a)在Matrigel中进行“管”形成检测，经微粒体处理2小时，并显示内皮细胞形成网格的代表性图像。(b)使用Image J量化网格特征，例如管节点的数量和管的总长度(c)。

图9为不同离心方案分离的微粒体对内皮细胞迁移的影响。(a)HUVEC细胞在分别与微粒体孵育24小时和48小时后细胞迁移的代表性照片。(b)使用image J软件对细胞迁移的无细胞初始区域(0h)的百分比进行量化。

图10为微粒体对癌细胞迁移的影响。(a)Hela细胞在分别与微粒体孵育24小时和48小时后细胞迁移的代表性图像。(b)使用Image J软件对细胞迁移的无细胞初始区域(0h)的百分比进行量化。

图11为微粒体对炎症反应的影响。(a)通过鼻饲灌输获得的ALI炎症小鼠模型。1天后从这些小鼠的血浆中分离出微粒体，然后在其他小鼠与LPS一起鼻饲灌输。1天后，用700ul PBS收获肺灌洗液。(b)量化来自不同处理的支气管肺泡灌洗液中的蛋白质量。(c)iBMDM细胞用100μg/ml LPS和不同的微粒体处理6小时后，收集样品并检测IL-1b和NLRP3(d)的mRNA水平。(e)iBMDM细胞处理6小时，然后收集样品进行蛋白质印迹以检测蛋白质水平。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

新方法获得全新的微粒体组分

1)以不同离心速度间隔分析微粒体的组成，发现低于3000g离心获得微粒体中血小板来源占到80％，而高于3000g离心获得的微粒体成分则维持比较稳定，血小板来源约占20％

尽管不同文献的初始离心速度有所不同，但大多数都是在1400g左右离心20分钟以去除细胞和细胞碎片，然后在20,000g，30分钟收获微粒体沉淀。为了研究微粒体分离的准确离心速度，在初始1400g后以不同的离心速度间隔分离样品：3000g、5000g、8000g、12000g和20000g，然后通过流式细胞仪进行分析。发现在3000g离心下，超过80％的颗粒样品是CD41+。然而，在所有其他离心速度间隔中，只有约20％的CD41+微粒体，且比例相当稳定(图1a)。表明3000g离心20分钟消除了小血小板和血小板碎裂，其余CD41+微粒似乎才是真正的血小板来源微粒体。相比之下，与在3000g时仅获得0.26％的CD45+(白细胞来源)微粒体，相反，3000g后从其他离心速度间隔中分离出的CD45+微粒的百分比约为2.2％，约为前者的10倍，并且保持相对稳定(图1b)。同样，在5000g和其他更高的离心速度下获得约3％的血管内皮衍生微粒(CD144+)，大约是3000g(0.5％)的6倍，并且也非常稳定(图1c)。更重要的是，由于大量颗粒的并不是真正的微粒体，3000g时，线粒体阳性微粒的比例非常低，而高于3000g时，则在3-7％左右的稳定比例，远高于在3000g下获得的速度(图1d)。这些数据都表明3000g是确定稳定微粒体组成的临界离心速度。有趣的是，在5000g下获得的红细胞来源微粒体(CD235a+)仅略高于在3000g，但没有显着差异(图1e)。但是，当离心超过5000g时，获得的CD235a+微粒体要高得多。考虑到其他细胞来源的微粒体在3000g以上离心时的比例相对一致，与3000g时的比例有显着差异。同时，与其他离心速度组相比，3000g以下的颗粒样品检测到的蛋白质浓度高出10倍，这意味着1400g后获得的大部分微粒蛋白是3000g(图1f)。这些发现表明，当以1400g去除完整细胞和血小板时，直接收集的微粒体含有许多不是由细胞生理过程产生的颗粒，而主要是血小板碎片或小血小板，以及一些红细胞碎片。3000g再离心20分钟后这些成分可以大部分被去除，此时得到的颗粒才是真正的血浆微粒体。因此，3000g速度对微粒体分离起关键作用。

2)结合免疫荧光和流式细胞仪检测分析微粒体进一步验证上述结论：3000g离心速度是微粒体成分差别的关键节点

为了进一步验证上述结论，结合免疫荧光和细胞流式的方法对不同离心速度获得的血浆中的微粒体组分进行深入研究。不同离心速度获得的微粒体利用不同细胞的检测抗体进行标记，二抗使用红色荧光。和上述结果一致，共聚焦显微镜直接观测的结果表明1400g之后3000g获得的血小板来源的微粒体占微粒体的绝大部分，显著高于其它细胞来源如白细胞和红细胞的微粒体(图2a-c)。相同的样品同时再次经过流式细胞定量分析，结果也和上述图1的类似(图2d)。此外，利用Western blotting的方法进一步验证相关结果，并发现3000g获得的样品中作为血小板的标记蛋白CD41和CD36的条带都远强于其它离心速度获得的样品。所以，结合免疫荧光和Western blotting的实验都再次证明3000g时获得微粒体大多数是来源于血小板的碎片，另有少数红细胞碎片，并非真正的微粒体。

3)对比传统的方法和经改进之后的离心方法获得的微粒体组成的显著差别

尽管初始离心速度因不同文献而异，但大多数都是在1400g左右离心20分钟以去除细胞和细胞碎片，然后在20,000g左右收获微粒沉淀30分钟。所以综合上述多种离心方法及我们优化后的离心方法总结如图3所示。为了检测初始离心速度如何确定比例微粒，分别比较了1400g(1400g-post)和3000g(3000g-post)作为去除细胞碎片的初始速度。正如预期的那样，1400g-post的样品中有超过70％的颗粒是血小板衍生的(CD41+)，如之前的报道一样(图4a)。然而，当它们3000-post收集时，仅发现约20％的血小板来源微粒体，这比1400g-post的低2-3倍。相反，所有其他细胞衍生的微粒，如白细胞(CD45+)(图4b)、血管内皮细胞(CD144+)(图4c)和线粒体来源的微粒体(Cox4+)(图4d)在3000g后都增加很多。有趣的是，在3000g后红细胞来源微粒体(CD235a+)中没有发现显着增加(图4e)，这很可能是因为在1400g后颗粒中仍然存在一些红细胞衍生碎片。此外，在3000g获得的微粒总蛋白的检测量是3000g-post的4倍左右，这意味着从3000g-post获得的微粒体蛋白量仅为1400g-post约20％，并且1400g-post中80％的蛋白质可以在3000g时去除(图4f)。这表明1400g-post获得的所谓“微粒”大部分主要来源于小血小板和血小板碎片，也有部分来源于红细胞碎片。这些结果进一步表明离心速度确实对微粒体组成起关键作用，3000g是微粒体分离的边界离心速度。

实施例2

新方法获得微粒体的大小比较均一，形态特征分布独特，显示出微粒体的独特性和确定性。而传统方法获得微粒体则大小和形态分布太广泛和不确定。

1)对比优化后与传统方法获得的微粒体的形态特征和大小

大小尺寸是微粒体的一个基本特征，目前大家比较认可的微粒体大小约为50-1000nm，范围非常广。为了进一步了解3000g-post所获得的微粒体大小，首先利用DLS对传统方法(1400g-post)，3000g和改进的方法(3000-post)三种不同方法获得微粒体的大小进行检测。数据表明传统方法获得的微粒体明显有两个峰，从数量占比看，主峰主要在150-500nm(85％)，另有一个较弱的主峰在600-1600nm左右(15％)(图5a)。而1400g后再低速3000g获得的“微粒体”则呈现多个峰，尤其是大于1000nm的“微粒体”则呈现一个约5％左右的平台峰直至20000nm以后(38.9％)(图5b)。尽管在100-500nm区域也有个峰，但是数量占比总共也就只有50％左右。500-800nm也有一个峰，其占比大约为11％(图5b)。更有意思的是，分离方法经过改进之后所获得的微粒体在100-500nm处具有唯一的一个主峰，其数量占比达到99％(图5c)。显示出改进之后方法获得的微粒体大小具有很好的均一性和分布的独特性，暗示改进之后的方法对于微粒体的定义极为优越，并不会造成混淆、广泛性和不确定性。将3种不同方法获得的颗粒进行重合，也体现出非常明显的差异(图5d)。

为了进一步比较直观地观察三种方法获得的颗粒，又利用透射电镜对其形态和大小进行分析。与DLS方法相一致，传统方法获得的微粒体既有很多大颗粒，也有很多小颗粒(图5e)，而3000g获得的微粒体则小颗粒大幅减少，经改进之后方法获得的大量颗粒则呈现出非常好的均一性和独特性。各种统计分析都表明其与传统方法的显著不同(图5f,g)。需要特别指出的是，用电镜观察到的微粒体大小比DLS方法检测到的要小的多，推测这主要是因为制备电镜样品时需要固定微粒体，并且经过负染后又经60度烤干，这就导致主要成分是膜结构的血浆颗粒发生收缩，从而导致观测到的样品大小明显变小，其实际尺寸应该以未经固定并且维持溶液状态的DLS方法测定为准。所以，真正微粒体的大小应该为100-500nm范围，并且绝大多数在200-350之间(85％)。

2)不同细胞来源微粒体的生化检测

为了进一步比较两种分离方法的差别，又利用免疫荧光并结合流式细胞的方法来进行验证。如前所述，传统的方法(1400g-post)和3000g离心下来的类似，其CD41阳性颗粒所占比例达到80％以上，远高于改进之后的办法(30％)(图6a)。此外，1400g-post和3000g所获得的颗粒比较多，并成团存在，而不像3000g-post的微粒体那样比较小且分散存在(图6a-c).同样，对于白细胞和红细胞来源的微粒体，两种分离方法并无显著差别，但是他们都显著多于3000g所获得阳性颗粒(图6d)。此外，又通过Western blotting的方法来对各种细胞来源的蛋白进行检测(来源于等体积的血清，其中modified和3000g来源于同一样品)，发现改良后分离的血小板来源的蛋白marker-CD31显著低于传统的方法和3000g，而其它的几种marker蛋白Perllipin1(lipid protein),glycophorin(RBC)和CD45(WBC)则相差不大，它们都显著多余3000g所获得的样品。更为重要的是，作为存在于细胞质中的细胞骨架蛋白Actin，无论是1400g-post还是3000g都远高于改良方法所获得的，这就表明其主要来自于细胞的碎片，而不是以膜结构为主的微粒体(图6e)。和前面的结果相一致，这些数据都表明，传统方法分离的微粒体其实大多数蛋白是血小板来源的颗粒，并且是血小板碎片而非微粒体。

实施例3

重新定义新方法获得微粒体的生理功能，澄清传统方法获得微粒体功能的某些错误认识。

1)促凝血功能属于血小板颗粒而非微粒体

促凝活性和血栓形成是众所周知的微粒体的重要功能。为了验证促凝血活性和血栓形成，将通过不同离心方案分离的微粒体添加到具有10％FBS的DMEM细胞培养基中。在包含以传统离心方法(1400g-post)或3000g离心速度获得的颗粒的培养基中迅速形成凝块。然而，当添加使用优化后的方案(3000g-post)收获的微粒体时，培养基一直保持澄清(图7)。这一数据表明，许多文献中1400g-post“微粒体”的促凝血功能很大程度上取决于大量血小板来源颗粒的存在，这些颗粒在3000g时可以分离出来，而不是需要更高离心速度分离的微粒体的真正功能。

2)促进血管生成但抑制细胞迁移

据报道，微粒体可以通过促进毛细血管样结构的形成而表现出促血管生成活。为了研究微粒体的促血管生成作用，在经过不同方案分离的微粒体处理情况下，对在Matrigel中培养的HUVEC细胞的“管”形成进行测定。在将HUVEC细胞在Matrigel上培养2小时后对管状结构的形成进行成像(图8a)。有趣的是，与对照组和3000g组相比，传统和改良方案组的”小管”更密集，一些小管颜色更深，3000g-post(优化)微粒体更好(图8a)。分析了网格的特征信息，以量化和比较各组之间的血管生成潜力。与以前的报道一致，用改良和传统方法分离的微粒处理的组在节点数量和总长度方面具有更多的网格(图8b，c)。优化后获得微粒体处理的“管”形成最好，但3000g微粒处理的“管”的特性与未处理的对照组相似(图8b，c)。这些结果表明，真正的微粒体确实促进了血管生成，但血小板来源的较大颗粒并没有或弱得多。因此，这表明先前报道的促血管生成功能是微粒体本身的功能。

一些研究报告说，微粒可以抑制细胞迁移。因此，进行划痕迁移测定以研究微粒对迁移的影响。结果表明，与用3000g颗粒处理和未处理相比，通过改良和传统方法获得的微粒显着抑制了细胞迁移的无细胞区域(图9，10)。因此，与促进血管生成类似，抑制细胞迁移的功能可能更多属于其他细胞来源的微粒体，而不是血小板来源的颗粒。

3)抑制而不是促进炎症反应

尽管Garnier,Y.等人报道从镰状患者血浆中分离出的微粒体可能引发ECs的促炎表型，大多数其他研究发现微粒体可以抑制炎症反应。为了确定不同方法获得的颗粒对炎症反应的影响，首先利用LPS造炎症小鼠模型，1天后通过静脉注射对照，3000g，1400g-post和3000g-post以观测不同方法分离的微粒体对炎症反应的效果。结果发现，相比对照小鼠，经注射微粒体的小鼠，其灌洗液颜色明显变浅，说明其中的血红蛋白含量显著下降，尤其是较高速度离心的传统和改善的方法效果更好(图11a)。检测灌洗液中蛋白的浓度，也发现注射有微粒体或者细胞碎片处理组的蛋白含量都显著低于对照组(图11b)。这就表明，所有注射微粒体的炎症小鼠其炎症都有所减低，尤其是传统方法和本发明改善方法获得微粒体处理对炎症的抑制效应非常显著。所以，无论是来自于血小板的大颗粒，还是较小的微粒体都可以显著抑制炎症反应。

此外，为了进一步检测其对炎症反应的影响，又用LPS体外刺激巨噬细胞并检测相关炎症因子的表达。意外的是，发现经微粒体刺激后，炎症因子IL-1b和NLRP3的RNA水平都上升非常明显，尤其是IL-1b,其上升比阳性对照LPS刺激还要高得多(图11c,d)。为此，又进一步检测了不同处理后相关炎症因子蛋白水平的变化。结果发现，经微粒体处理后，IL-1b的蛋白水平确实上升，但是升高的只是其前体形式，对于其发挥功能的成熟形式IL-1b却显著低于对照组和LPS处理组，NLRP3也是同样如此(图11e)。此外，还检测了其它几种和炎症反应密切相关的蛋白，如：iNOS,TNFa和cleaved Caspase9,经微粒体和低速离心所获得的血小板大颗粒处理后，其蛋白水平都显著下降(图11e)。这些结果都进一步证明了无论是微粒体还是血小板来源的颗粒都可以显著抑制细胞和小鼠的炎症反应，而且这种抑制效应可能主要是来源于血小板的微粒体所发挥功能的。