S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜制备及其在防治口腔龋齿方面的应用

摘要

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及S‑(6‑己醇)‑L‑半胱氨酸亚砜制备及其在防治口腔龋齿方面的应用。S‑(6‑己醇)‑L‑半胱氨酸亚砜具有椰奶香味，与半胱氨酸亚砜裂解酶作用后将产生同样具有椰奶香味的二己醇硫代亚磺酸酯，二己醇硫代亚磺酸酯具有杀灭变异链球菌的生物活性，而变异链球会导致龋齿，由此将半胱氨酸亚砜裂解酶与S‑(6‑己醇)‑L‑半胱氨酸亚砜联用用于防治龋齿。将半胱氨酸亚砜裂解酶干酶粉与S‑(6‑己醇)‑L‑半胱氨酸亚砜加入奶粉等复配成奶片，奶片溶解后具有良好的抑制变异链球菌活性，在口腔龋病防治上具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜制备及其在防治口腔龋齿方面的应用。

背景技术

儿童龋齿俗称虫牙，是儿童常见的口腔疾病。儿童龋病发病率高居儿童疾病的首位，患病率在儿童中可高达90％以上，是继心血管疾病和癌症之后，被世界卫生组织列为重点防治的第三大疾病。龋齿的主要临床表现为牙齿硬组织进行性病损，包括无机质脱矿和有机质的分解，随病程发展而从色泽改变到形成实质性病损的演变过程。龋病不能自体修复，龋齿一旦对牙齿造成损伤，必须通过修复治疗手段恢复。当龋齿龋蚀达到牙本质深层接近牙髓，或已影响牙髓的时候，容易引起牙髓炎或根管炎，此时无药可治，只能进行根管治疗。

龋齿的日常防治非常重要。研究表明，口腔主要的龋齿致病菌为变异链球菌。变异链球菌能够利用蔗糖等化合物生长产生葡聚糖并粘附病原菌形成菌斑，在菌斑深层产酸侵袭牙齿，使牙齿硬组织脱矿溶解，产生龋洞。目前关于变异链球菌或者龋齿的防治产品主要分为化学和生物产品两类。如含生物酶、中药成分、含氟牙膏、漱口水，或益生菌含片等。由于儿童龋齿发病年龄小且为龋齿防治的关键期，牙膏等产品的使用在幼儿中存在较大的局限性，导致龋齿防治效果不佳，益生菌发挥作用需要一定的生长条件，因此存在起效慢的缺陷。

S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜经过半胱氨酸亚砜裂解酶的生物催化作用，产生的产物二烯丙基硫代亚磺酸酯对于变异链球菌具有很好的抑制作用，按照底物S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜来计算MIC值仅为0.65μg/ml，在口腔龋齿防治产品的开发应用中表现有很好的应用前景。然而，产物二烯丙基硫代亚磺酸酯具有辛辣的味道且历久不散，这导致有效成分二烯丙基硫代亚磺酸酯虽然具有很好的抑菌效果，但是不适合用于口腔蛀牙防治。因此，开发一种底物，经酶催化产生具有香气、温和不刺激的硫代亚磺酸酯类杀菌物质，对于口腔龋齿防治具有重要应用价值。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中的问题，提供S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜制备及其在防治口腔龋齿方面的应用。合成出一种具有椰奶香味的半胱氨酸-S-共轭物，通过半胱氨酸亚砜裂解酶、底物、添加剂等复合生产奶片，在口腔中原位生物催化合成一种香味抑菌硫代亚磺酸酯物质，实现对口腔变异链球菌等病原菌的安全快速和有效防治。

本发明的技术方案是：

S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜制备：

原料为L-半胱氨酸，取代基为6-溴-1-己醇或6-氯-1-己醇，制备方法包括取代反应和氧化反应两步；取代反应体系的加样顺序为：乙醇水溶液、氢氧化钠、L-半胱氨酸、取代基；在所述取代反应过程中，在所述乙醇水溶液中加入氢氧化钠，溶解；加入L-半胱氨酸，溶解；加入取代基，搅拌至溶液透明澄清，搅拌8～12h；将溶液pH(例如用乙酸)调节至4～6之间，使白色的S-(6-己醇)-L-半胱氨酸固体析出；其中乙醇：水为(4：1)～(5：1)，氢氧化钠0.8～4.5mol/L，L-半胱氨酸添加量为0.4～2.5mol/L，取代基添加量与L-半胱氨酸添加量的摩尔数一致，最终获得S-(6-己醇)-L-半胱氨酸；氧化反应氧化剂为30％的双氧水，30％双氧水与S-(6-己醇)-L-半胱氨酸投料比为：(2：1)～(5：1)(V/m)，氧化反应的终点为S-(6-己醇)-L-半胱氨酸完全溶解，停止放热，最终获得S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜。

此步的原理是S-(6-己醇)-L-半胱氨酸很难溶于水，但是S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜却易溶于水，双氧水可以将S-(6-己醇)-L-半胱氨酸氧化为S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜，反应过程放热。最终制备出的S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜具有椰奶香味。

作为一种优选的技术方案，所述S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜分子量为237.32，化学式为C

作为一种优选的技术方案，取代基为6-溴-1-己醇。

作为一种优选的技术方案，氢氧化钠添加量为1.375mol/L，L-半胱氨酸添加量为0.6875mol/L。

化学合成法所合成的S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜具有椰香或椰奶香味，S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜被半胱氨酸亚砜裂解酶β位裂解产生二己醇硫代亚磺酸酯，二己醇硫代亚磺酸酯的分子量为282.46，化学式为C

二己醇硫代亚磺酸酯具有杀菌活性，同时仍然具有椰奶香味。

基于二己醇硫代亚磺酸酯的抑菌机理及活性抑菌基团，分析确定应用于口腔蛀牙防治的有效物质仍然为硫代亚磺酸酯类物质，硫代亚磺酸酯类物质可由细菌源的半胱氨酸亚砜裂解酶LCC1与其底物半胱氨酸亚砜-S-共轭物作用产生。因此想要得到具有香味的硫代亚磺酸酯类物质首先需要得到一种具有香味的半胱氨酸亚砜-S-共轭物。在葡萄中存在一种具有香气的半胱氨酸-S-共轭物(3MH-cys)即S-(3-己醇)-L-半胱氨酸。当利用酵母发酵制作葡萄酒时，酵母中的C-S裂解酶会使其β位裂解为3-巯基己醇，这是一种具有挥发性葡萄柚香气的物质。因此，若将S-(3-己醇)-L-半胱氨酸氧化为S-(3-己醇)-L-半胱氨酸亚砜，再用细菌源半胱氨酸亚砜裂解酶LCC1与之作用，理论上将产生二(3-己醇)硫代亚磺酸酯，这种物质很可能具有香味。若使用化学合成法合成此底物，合成S-(3-己醇)-L-半胱氨酸亚砜的关键是以3-溴己醇作为取代基与半胱氨酸进行取代反应。然而3-溴己醇并不常见，市面上未见批号，目前可用的取代基只有6-溴-1-己醇，此取代基与L-半胱氨酸取代之后将形成S-(3-己醇)-L-半胱氨酸的同分异构体S-(6-己醇)-L-半胱氨酸，将其氧化之后将形成S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜。S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜的分子式和分子量与S-(3-己醇)-L-半胱氨酸亚砜完全一致，化学式均为C

所用半胱氨酸亚砜裂解酶LCC1的氨基酸序列为：

MRDSAAAQRLQAIREAMPATTAHTYLNTGTFGPLPRCVIEAMQERLQEEWREGRLGAEAHAALLSHYREARQRCAELFHADIEEIALTDNTGEGLNIIAFGLNWREGGEVITTNHEHISALAPLYQLRERYGIRLRIADLGERGERPAEEEIARLITPRTRLIVLSHVSFMTGARFDVSAVTALGRRHGLPVLVDGAQAAGAIAVDVQELDVDFYAFPMQKWLCGPDGTGGLYVRRTALGQVQSTYVGYYSLKHEHSGVWELQETAQRFELGGRQTAALVGQSRALRWLAEEVGHRWLQERIASLNRYAAELLSEVPGVKILTPQPGASGLLSFTFARAEPEAVVRRLAEEHNVLIRSIHERQALRLSTGFYNTEEELERVAAILRSWP，

S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜与半胱氨酸亚砜裂解酶在有H

S-烷基-L-半胱氨酸亚砜裂解酶LCC1为一种细菌来源的半胱氨酸亚砜裂解酶，此酶具有植物半胱氨酸亚砜裂解酶的功能，即可以β位C-S裂解半胱氨酸亚砜-S-共轭物，产生R基次磺酸，随后R基次磺酸将自发脱水缩合生成“二R基硫代亚磺酸酯”，当此酶作用的底物为S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜时，将生成产物二己醇硫代亚磺酸酯。该产物能够有效抑制口腔病原菌如变异链球菌的生长。

将S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜复配成奶片用于防治龋齿，奶片原料为S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜、毕赤酵母异源表达的LCC1喷雾干燥酶粉，奶粉和木糖醇。S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜：LCC1干酶粉的质量比例为(1：1)～(1：5)，每片奶片含有S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜0.1～1mg。奶粉与木糖醇的质量比为20：1，每片奶片含有奶粉2～5g。

使用细菌半胱氨酸亚砜裂解酶可以将S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜裂解生成二己醇硫代亚磺酸酯。可以使用DNPH法测定酶活以及副产物丙酮酸的量，当完全反应后可以闻到产物仍然具有椰奶香味，进行酶与底物的96孔板原位抑菌实验发现且具有抑菌活性。经过HPLC-MS检测发现制备的S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜分子量大小正确，单一峰，纯度高。

由于用大肠杆菌作为酶的表达体系会引入内毒素，而内毒素的去除过程成本高且繁琐，这样便限制了酶的应用，所以选择不产生内毒素的毕赤酵母作为表达体系。通过构建的毕赤酵母大量表达半胱氨酸亚砜裂解酶LCC1，此酶存在于发酵上清液中，在上清液中加入15％的麦芽糊精充分溶解后可以实现半胱氨酸亚砜裂解酶的喷雾干燥，得到半胱氨酸亚砜裂解酶干酶粉。

将自制的S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜与喷雾干燥酶粉以及奶粉木糖醇等混合可以复配成口腔抑菌防蛀牙奶片。每片奶片中的成分为，0.1～1mg的底物S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜、0.1～5mg的半胱氨酸亚砜裂解酶干酶粉、2～5g奶粉以及0.1g的木糖醇。将奶片溶解后用于抑制龋齿主要致病菌变异链球菌，可以发现仍然具有较好的抑菌活性。奶片不仅具有显著的抑菌效果，味道好且方便儿童使用，能够实现龋齿的有效防治。

本发明的有益效果为：

(1)本发明通过S-烷基-L-半胱氨酸亚砜裂解酶LCC1及新型化合物S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜作为底物，生物催化合成一种椰奶香味化合物二己醇硫代亚磺酸酯。

(2)S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜与S-烷基-L-半胱氨酸亚砜裂解酶原位反应，按照S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜计算，对于变异链球菌MIC值达到46μg/ml，具有显著的抑菌功能。

(3)做成的奶片味道奶香且抑菌能力强，对于变异链球菌的MIC值达到184μg/ml，能够实现龋齿的有效防治。

(4)底物S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜的制备方法简便且纯度高。

(5)底物S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜制备的试剂成本较低，1g底物的试剂成本为低于5元，可以添加到4000片奶片中。

附图说明

图1为底物S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜以及椰奶香味具有抑菌活性的二己醇硫代亚磺酸酯结构式；

图2为自制S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜的HPLC-MS图谱；

图3为抑菌结果；

图4为抑菌奶片具体设计方案示意图。

具体实施方式

为了使本发明的技术手段、技术特征、发明目的与技术效果易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

实施例1：

底物制备

底物为S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜，底物与产物结构式如图1所示，制备方法共分为两步。第一步为S-(6-己醇)-L-半胱氨酸的合成，第二步为S-(6-己醇)-L-半胱氨酸的氧化。首先进行第一步，将乙醇和水按照5：1的体积比配置成240ml的体系，随后加入氢氧化钠固体0.7mol，搅拌至完全溶解后，加入L-半胱氨酸0.3mol，再次搅拌至完全溶解。随后加入6-溴-1-己醇0.3mol，搅拌至溶液透明澄清之后，盖上封口膜继续搅拌过夜12h。将溶液pH用乙酸调节至5.0，使白色的S-(6-己醇)-L-半胱氨酸固体大量析出，静置一会，然后过滤收集固体，65℃烘干，产物的产率按照产物与L-半胱氨酸的比重来计算，本步的产率为150％。第二步反应的过程如下，取第一步所制备的S-(6-己醇)-L-半胱氨酸固体2g，加入5ml 30％的过氧化氢溶液氧化，此反应伴随着放热，反应终点是固体完全溶解且不再放热，这时应该形成透明澄清的溶液，加入冷乙醇后立即沉淀出大量白色固体。收集过滤出白色固体并于65℃烘干，此产物即为S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜，本步的转化率为75％，综合产率为112.5％。

实施例2：

自制底物的HPLC-MS验证

将自制的S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜配置成0.5mg/ml的30％甲醇水溶液，之后送测LCMS鉴定，进样量为5ul，检测波长为214nm，色谱柱为C18柱，流速为0.8ml/min，离子源为ESI正离子。质谱结果如图2所示，S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜分子量为237.32，正离子轰击则为238.32。可见分子量正确，质谱结果为单峰，且随着箭头移动此峰的各个位置分子量均为，因此物质纯度高。

实施例3：

奶片制备

如图4所示，为抑菌奶片具体设计方案示意图。口腔抑制变异链球菌的奶片成分为，奶粉(脱脂奶粉更优)、木糖醇、半胱氨酸亚砜裂解酶干酶粉以及底物S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜。半胱氨酸亚砜裂解酶的氨基酸序列为：MRDSAAAQRLQAIREAMPATTAHTYLNTGTFGPLPRCVIEAMQERLQEEWREGRLGAEAHAALLSHYREARQRCAELFHADIEEIALTDNTGEGLNIIAFGLNWREGGEVITTNHEHISALAPLYQLRERYGIRLRIADLGERGERPAEEEIARLITPRTRLIVLSHVSFMTGARFDVSAVTALGRRHGLPVLVDGAQAAGAIAVDVQELDVDFYAFPMQKWLCGPDGTGGLYVRRTALGQVQSTYVGYYSLKHEHSGVWELQETAQRFELGGRQTAALVGQSRALRWLAEEVGHRWLQERIASLNRYAAELLSEVPGVKILTPQPGASGLLSFTFARAEPEAVVRRLAEEHNVLIRSIHERQALRLSTGFYNTEEELERVAAILRSWP，

每一片奶片中含有奶粉2g，木糖醇0.1g，半胱氨酸亚砜裂解酶干酶粉1.5mg以及底物0.3mg。将以上原料预混，然后使用压片机压实制成片状。制备全程保持无水干燥。因为在有水的条件下酶与底物会反应，而本产品被期望在口腔环境中原位反应产生二己醇硫代亚磺酸酯。本品的食用方法为慢慢含化。

实施例4：

抑菌实验

采用96孔板二倍稀释法确定MIC值。将受试的变异链球菌菌液用灭菌生理盐水调节至在625nm波长检测吸光值为0.090～0.10(用UV-1700紫外可见分光光度计检测)，然后用灭菌的BHI肉汤按1:200稀释，在96孔板中加入含菌BHI肉汤，加入底物和半胱氨酸亚砜裂解酶酶液，以及溶解后的奶片，使底物S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜终浓度1-11孔成为23552、11776、5888、2944、1472、736、368、184、92、46、23μg/ml等系列浓度第12孔为空白对照，以氨苄青霉素(Amp)作为对标，使Amp的初始浓度为250μg/ml,37℃静置培养。(校正过的菌液应在30min内接种完，校正过的菌液放置时间过长会影响检测结果)

结果的判定为37℃培养16h～18h，先观察阳性对照应有细菌生长，阴性对照(空白BHI肉汤)应无细菌生长，然后观察供试样品，肉眼可见细菌生长为混浊，无肉眼可见生长为澄清，澄清试管中对应的最低试样浓度判定为MIC值。如图3所示，96孔板中上行为S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜与S-烷基-L-半胱氨酸亚砜裂解酶原位反应抑制变异链球菌。中行为S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜与S-烷基-L-半胱氨酸亚砜裂解酶压制成的奶片，将奶片溶解后抑制变异链球菌。下行为Amp的抑制变异链球菌。

此原位反应的抑菌的MIC值按照S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜的浓度来计算，S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜与S-烷基-L-半胱氨酸亚砜裂解酶原位反应抑制变异链球菌的MIC为46μg/ml，中行S-(6-己醇)-L-半胱氨酸亚砜与S-烷基-L-半胱氨酸亚砜裂解酶压制成的奶片，将奶片溶解后抑制变异链球菌的MIC为184μg/ml。下行的Amp对于变异链球菌的MIC为0.976μg/ml。

MIC值应看最后一个澄清的孔对应的药物浓度，前几孔虽有浑浊但无菌体生长，原因是底物浓度过高造成了沉淀。

综上所述仅为本发明较佳的实施例，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化及修饰，皆应属于本发明的技术范畴。