一种猪胎盘转移因子的制备方法

摘要

本发明公开了一种猪胎盘转移因子的制备方法，1）将注射用水与绞碎后的猪胎盘混合，匀浆获得匀浆液；2）匀浆液经细胞破碎后，离心，收集上清液并进行切向流过滤，收集透过物；3）将透过物用截留孔径分子量不同的滤膜逐级进行切向流过滤，获得所需的不同分子量范围的猪胎盘转移因子粗制品；4）将步骤3）中至少一种分子量范围的猪胎盘转移因子粗制品混合，获得初制品；5）对初制品除病毒后，调节pH和渗透压，过滤除菌，获得猪胎盘转移因子。本发明采用逐级切向流过滤，建立了精确有效的猪胎盘转移因子分离浓缩技术、小分子纯化技术，选取截留孔径分子量不同的滤膜按照不同的工艺技术流程可按需制备出各种不同分子量范围的猪胎盘转移因子。

说明书

技术领域

本发明属于生物制品领域，具体涉及一种猪胎盘转移因子的制备方法。

背景技术

转移因子(Transfer factor,TF)是由具有免疫活性的T淋巴细胞释放的一种细胞因子，由多肽和低聚核苷酸组成，分子量小于10千道尔顿(Kilodalton,kDa)，不含蛋白，无种属特异性、无抗原性、无毒副作用，是一种新型免疫佐剂。TF具有广泛的免疫调节活性，一方面具有非特异性，从无特定抗原刺激的供体可分离获得非特异性TF(Nonspecific TF,NTF)，NTF可通过影响受体IFN-γ、IL-2、IL-4、TLR-2、TLR-4和cAMP的表达，进而增强同种或异种受体动物的非特异性免疫力；另一方面具有特异性，从受抗原刺激的供体可分离获得特异性TF(Specific TF,STF)，STF可通过抗原特异性T淋巴细胞受体β链的一部分、肽序列和S100A9蛋白等致敏淋巴细胞的特异性免疫信息，介导激活受体的巨噬细胞和抑制性T淋巴细胞，进而将供体特异性细胞免疫功能转移给同种或异种受体动物，激发特异性免疫，其反应强度与机体二次接触同类病原所产生的免疫反应相当，如：抗乙型肝炎猪脾TF。TF对于目前抗体或者抗生素无法有效控制的传染病及免疫缺陷疾病的预防起到重要作用。

TF是具有生物学活性的分子量范围分布广泛的非均一性小分子混合物，有学者认为TF是具有约44个氨基酸长度的蛋白质，通常具有约3kDa至约5kDa的分子量，但是TF分子可能具有该范围外的分子量，并且还认为TF包括三个功能部分(诱导部分、免疫抑制部分和抗原特异性部分)，其中每个部分包括不同分子量的TF分子。也有许多学者认为TF还包括核苷部分，其可以连接蛋白分子或与其分开，该核苷部分可以提高TF诱导动物免疫系统二次免疫应答的能力，也可以是TF的诱导部分或抑制部分中的一部分。另有学者研究显示TF主要包含至少581种不同分子量的多肽、核糖、Na、Zn、K、Mg、Ca等金属元素和游离氨基酸等。

TF来源于动物脾脏和胎盘。胎盘又称紫河车、胞衣、衣胞、胎衣，包含多肽、核糖、磷脂、糖、钙、维生素、干扰素、酶类、免疫因子、红细胞生成素、雌性激素、助孕酮、类固醇激素、促性腺激素、促肾上腺皮质激素等。动物胎盘是畜牧生产的废弃物，原料来源广泛。动物胎盘的资源化利用，具有重要的现实意义和极广的应用开发前景。

目前，关于猪胎盘转移因子的制备方法存在以下不足：

(1)TF是具有生物学活性的分子量小于10kDa且分子量范围分布广泛的非均一性小分子混合物，包括三个功能部分(诱导部分、免疫抑制部分和抗原特异性部分)，其中每个部分包括不同分子量的TF分子。不同分子量的TF具有不同的生物学活性，因此，TF的组份分子量不同，其生物学活性、制备质量、使用剂量、临床应用均有不同。现有TF制造技术缺乏有效的TF分离浓缩技术、小分子纯化技术，不具备不同分子量TF的制备方法，导致无法获得不同分子量组成的TF。这些限制了TF的生物学活性研究、作用机理研究及有效临床应用。

(2)TF来源于动物脾脏和胎盘，因此动物病毒也可经TF传播。其中，牛病毒性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒及非洲猪瘟病毒均是严重危害我国养猪业的重要疫病。要保证猪胎盘TF的安全性，必须对猪胎盘加以检验选择。现有TF制造技术缺乏对猪胎盘进行严格系统的外源病毒检验，尤其是缺少对我国新发猪病非洲猪瘟病毒的检验，导致所制备猪胎盘TF存在较大的病毒安全风险。

(3)由于技术水平的限制，目前还可能存在着未能发现或了解其特性的猪源病毒。在猪胎盘TF的制备中，猪胎盘中潜在的未知病毒依然使猪胎盘TF面临病毒安全风险。因此，去除/灭活病毒工艺是保证猪胎盘TF安全性的重要、必要手段。现有TF制造技术多采用5-10kDa超滤膜超滤或透析袋透析后直接获得猪胎盘TF成品，工艺流程没有采用去除/灭活病毒方法处理，而超滤膜超滤和透析袋透析尽管都具有一定程度的截留去除病毒作用，但是限于超滤膜和透析袋的滤膜结构特点和过滤工艺性质，超滤膜超滤和透析袋透析均不是安全可靠和容易验证的去除/灭活病毒方法，导致所制备猪胎盘TF存在较大的病毒安全风险。此外，另有TF制造技术仅采用一种去除/灭活病毒方法，如：多采用甲醛灭活法或β-丙内酯灭活法，由于单一病毒去除/灭活方式的局限性，存在对有些病毒不能完全去除的可能性，不能绝对保证猪胎盘TF的安全。

(4)要保证猪胎盘TF的安全性，除了对猪胎盘加以检验选择，对猪胎盘TF进行去除/灭活病毒处理等措施外，对所制备的猪胎盘TF进行严格系统的外源病毒检验，同样是保证猪胎盘TF安全性的重要环节。现有TF制造技术缺乏对猪胎盘TF进行严格系统的外源病毒检验，尤其是缺少对我国新发猪病非洲猪瘟病毒的检验，导致所制备猪胎盘TF存在较大的病毒安全风险。

(5)尽管猪胎盘是畜牧生产的废弃物，但是猪胎盘依然不属于无限供应的原料资源。现有猪胎盘TF制造技术对猪胎盘的使用效率较差，仅在匀浆液离心后选取离心上清液用于制备猪胎盘TF，而舍弃了离心沉淀物。此外，现有猪胎盘TF制造技术缺乏渗透压调节工艺，无法获得等渗猪胎盘TF，限制了猪胎盘TF的应用效果和使用范围。

发明内容

本发明的目的在于克服背景技术的不足，提供一种无病毒安全风险的猪胎盘转移因子的制备方法，该方法可以获得特定分子量的猪胎盘转移因子。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种猪胎盘转移因子的制备方法，包括以下步骤：

1)选取健康母猪的胎盘，去除猪胎盘表面的筋膜、结缔组织膜，用注射用水洗净后，经切肉机切碎后再经绞肉机绞碎，将注射用水或经乙酸调节pH值为3.5-6.5的注射用水与绞碎后的猪胎盘混合，经胶体磨匀浆获得匀浆液。

2)匀浆液经细胞破碎后，进行离心分别获得一次离心上清液和一次离心沉淀物。

进一步将一次离心沉淀物与经乙酸调节pH值为3.5-5.5的注射用水混合，经胶体磨匀浆获得匀浆液，进行细胞破碎，离心获得二次离心上清液。将一次离心液和二次离心液合并，然后采用0.22-0.45μm滤膜进行切向流过滤，收集透过物。

3)小于10kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤2)中透过物采用10kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于10kDa猪胎盘转移因子粗制品。

4)小于8kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤2)中透过物采用8kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于8kDa猪胎盘转移因子粗制品。

5)小于5kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤2)中透过物采用5kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于5kDa猪胎盘转移因子粗制品。

6)8至10kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤3)中小于10kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用8KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为8至10kDa猪胎盘转移因子粗制品。

7)5至10kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤3)中小于10kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用5KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为5至10kDa猪胎盘转移因子粗制品。

8)3至10kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤3)中小于10kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用3KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为3至10kDa猪胎盘转移因子粗制品。

9)1至10kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤3)中小于10kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用1KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为1至10kDa猪胎盘转移因子粗制品。

10)5至8kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤4)中小于8kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用5KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为5至8kDa猪胎盘转移因子粗制品；

或者，将步骤7)中5至10kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用8KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为5至8kDa猪胎盘转移因子粗制品。

11)3至8kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤4)中小于8kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用3KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为3至8kDa猪胎盘转移因子粗制品；

或者，将步骤8)中3至10kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用8KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为3至8kDa猪胎盘转移因子粗制品。

12)1至8kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤4)中小于8kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用1KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为1至8kDa猪胎盘转移因子粗制品；

或者，将步骤9)中1至10kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用8KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为1至8kDa猪胎盘转移因子粗制品。

13)3至5kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤5)中小于5kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用3KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为3至5kDa猪胎盘转移因子粗制品；

或者，将步骤8)中3至10kDa猪胎盘转移因子粗制品或步骤11)中3至8kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用5KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为3至5kDa猪胎盘转移因子粗制品。

14)1至5kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤5)中小于5kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用1KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为1至5kDa猪胎盘转移因子粗制品；

或者，将步骤9)中1至10kDa猪胎盘转移因子粗制品或步骤12)中1至8kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用5KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为1至5kDa猪胎盘转移因子粗制品。

15)小于3kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤3)中小于10kDa猪胎盘转移因子粗制品、步骤4)中小于8kDa猪胎盘转移因子粗制品、或步骤5)中小于5kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用3KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于3kDa猪胎盘转移因子粗制品；

或者，将步骤2)中透过物采用30-1000kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物并采用3KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于3kDa猪胎盘转移因子粗制品。

16)1至3kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤15)中小于3kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用1KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为1至3kDa猪胎盘转移因子粗制品；

或者，将步骤9)中1至10kDa猪胎盘转移因子粗制品、步骤12)中1至8kDa猪胎盘转移因子粗制品或步骤14)中1至5kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用3KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为1至3kDa猪胎盘转移因子粗制品。

17)小于1kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤3)中小于10kDa猪胎盘转移因子粗制品、步骤4)中小于8kDa猪胎盘转移因子粗制品、步骤5)中小于5kDa猪胎盘转移因子粗制品或步骤15)中小于3kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用1KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于1kDa猪胎盘转移因子粗制品；

或者，将步骤2)中透过物采用30-500kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物并采用1KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于1kDa猪胎盘转移因子粗制品。

18)将步骤3)至步骤17)中至少一种分子量范围的猪胎盘转移因子粗制品混合，即为猪胎盘转移因子初制品。

19)对猪胎盘转移因子初制品，采用去除/灭活病毒方法进行除病毒后，调节pH至6.5-7.5，渗透压调节至280-320mosm/kg，采用0.1-0.22μm除菌过滤器除菌，即获得猪胎盘转移因子。

进一步地，步骤1)中，健康母猪经疫苗免疫或抗原刺激后抗体阳性，则步骤19)获得该疫苗或抗原特异性的猪胎盘转移因子。反之，健康母猪未经疫苗免疫或抗原刺激而抗体阴性，则步骤19)获得非特异性的猪胎盘转移因子。

进一步地，步骤1)中，猪胎盘应无牛病毒性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒及非洲猪瘟病毒污染，外源病毒检验法详见附注一。

进一步地，步骤2)中，细胞破碎方法包括至少一种下述方法：①反复冻融破碎；②高压均质机破碎；③超声波细胞破碎仪破碎。

进一步地，步骤19)中，去除/灭活病毒方法包括至少两种下述方法：①低pH孵放法(pH 2.0-4.0时4-25℃反应2h-1d)；②膜过滤法(15-45nm除病毒过滤器过滤)；③β-丙内酯灭活法(0.001％-0.025％浓度时4℃灭活6-24h后37℃水解2-8h)；④甲醛灭活法(0.01％-0.05％浓度时37℃灭活6-12h)。

进一步地，步骤19)中，猪胎盘转移因子应无牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒及非洲猪瘟病毒污染，外源病毒检验法详见附注一。

制备的猪胎盘转移因子成品中，分子量小于3kDa的猪胎盘转移因子体积比为30％-60％时，适合用于提高猪体液免疫功能。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.本发明采用逐级切向流过滤，建立了精确有效的猪胎盘TF分离浓缩技术、小分子纯化技术，选取截留孔径分子量不同的滤膜按照不同的工艺技术流程可制备出小于10kDa猪胎盘转移因子粗制品、小于8kDa猪胎盘转移因子粗制品、小于5kDa猪胎盘转移因子粗制品、8至10kDa猪胎盘转移因子粗制品、5至10kDa猪胎盘转移因子粗制品、3至10kDa猪胎盘转移因子粗制品、1至10kDa猪胎盘转移因子粗制品、5至8kDa猪胎盘转移因子粗制品、3至8kDa猪胎盘转移因子粗制品、1至8kDa猪胎盘转移因子粗制品、3至5kDa猪胎盘转移因子粗制品、1至5kDa猪胎盘转移因子粗制品、小于3kDa猪胎盘转移因子粗制品、1至3kDa猪胎盘转移因子粗制品、小于1kDa猪胎盘转移因子粗制品，将至少一种上述分子量范围的猪胎盘转移因子粗制品按不同比例混合，进行去除/灭活病毒处理、PH和渗透压调节后除菌，即获得猪胎盘转移因子。

不同分子量的转移因子具有不同的生物学活性。对比现有转移因子制造技术所制备猪胎盘转移因子，本发明所制备猪胎盘转移因子的分子量组份的占比不同，包含不同体积比例的小于10kDa、小于8kDa、小于5kDa、8至10kDa、5至10kDa、3至10kDa、1至10kDa、5至8kDa、3至8kDa、1至8kDa、3至5kDa、1至5kDa、小于3kDa、1至3kDa或小于1kDa猪胎盘转移因子。本发明所制备不同分子量组份组成的猪胎盘转移因子，在诱导功能、免疫抑制功能和抗原特异性功能等主要功能方面具有不同的生物学活性，使用剂量和临床效果也不同，为TF的生物学活性研究、作用机理研究及有效临床应用提供了技术基础。

2.猪胎盘的质量是猪胎盘转移因子的首要制约因素，外源病毒感染将严重影响猪胎盘转移因子的质量及安全，猪胎盘是否有外源病毒感染是猪胎盘转移因子正式制备前最主要的质量监测，对猪胎盘的质量监控是制造合格猪胎盘转移因子的前提条件，对制造出安全有效的产品有着重要的作用。现有猪胎盘转移因子制造技术缺乏对猪胎盘进行严格系统的外源病毒检验。对比现有猪胎盘转移因子制造技术，本发明围绕牛病毒性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒及非洲猪瘟病毒建立了严格系统的原料猪胎盘外源病毒检验方法，尤其是对我国新发猪病非洲猪瘟病毒新增了原料猪胎盘的外源病毒检验，对猪胎盘加以严格检验筛选，保证了猪胎盘TF的安全性，严格控制了所制备猪胎盘TF的病毒安全风险。

3.猪胎盘经过外源病毒检验筛选、切向流过滤等工艺过程制得猪胎盘转移因子粗制品，猪胎盘转移因子粗制品仍然有可能被误入的外源病毒或潜在的未知病毒污染。为了排除猪胎盘转移因子粗制品可能存留的外源病毒，防止病毒进入猪胎盘转移因子成品，须对猪胎盘转移因子粗制品进行去除/灭活病毒方法处理。现有猪胎盘转移因子制造技术多采用安全可靠性不足且较难验证的超滤膜超滤或透析袋透析截留去除病毒，或者至多采用单一病毒去除/灭活方式(如：多采用甲醛灭活法或β-丙内酯灭活法)，存在对有些病毒不能完全去除的可能性，不能绝对保证猪胎盘TF的安全，导致所制备猪胎盘TF存在较大的病毒安全风险。本发明通过对猪胎盘TF的去除/灭活病毒方法进行验证与评价研究，从巴斯德消毒法、干热法、有机溶剂/去污剂(S/D)处理法、膜过滤法、低pH孵放法、β-丙内酯灭活法、甲醛灭活法、二乙烯亚胺灭活法、辛酸处理法、光化学法、深度过滤、色谱技术等方法中筛选并建立了灭活病毒范围广、效果好、验证合格且可保持猪胎盘TF效力和稳定性的去除/灭活病毒方法。对比现有猪胎盘转移因子制造技术，本发明包括至少两种下述去除/灭活病毒方法：①低pH孵放法(pH 2.0-4.0时4-25℃反应2h-1d)；②膜过滤法(15-45nm除病毒过滤器过滤)；③β-丙内酯灭活法(0.001％-0.025％浓度时4℃灭活6-24h后37℃水解2-8h)；④甲醛灭活法(0.01％-0.05％浓度时37℃灭活6-12h)。明确了在猪胎盘TF生产过程中，必须分别采用两种或两种以上不同机理的去除/灭活病毒方法，共同保证病毒的彻底灭活/去除，以保证猪胎盘TF的安全。

4.外源病毒污染将严重影响TF的质量及安全，任何一种动物来源的TF都不允许存在外源病毒。因此，对所制备的猪胎盘TF进行严格系统的外源病毒检验是保证猪胎盘TF安全性的重要环节。现有TF制造技术缺乏对猪胎盘TF进行严格系统的外源病毒检验，尤其是缺少对我国新发猪病非洲猪瘟病毒的检验，导致所制备猪胎盘TF存在较大的病毒安全风险。本发明首先对原料猪胎盘进行外源病毒检验，保证原料猪胎盘无外源病毒污染。还使用了5-10KD滤膜进行切向流超滤，进一步保障了猪胎盘转移因子粗制品的安全性。随后，采用至少两种去除/灭活病毒方法灭活病毒，灭活可能存在的病毒。对比现有猪胎盘转移因子制造技术，本发明围绕牛病毒性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒及非洲猪瘟病毒建立了严格系统的猪胎盘TF外源病毒检验方法，尤其是对我国新发猪病非洲猪瘟病毒新增了猪胎盘TF的外源病毒检验，确实保障了猪胎盘TF无外源病毒污染。

5.尽管猪胎盘是畜牧生产的废弃物，但是猪胎盘依然不属于无限供应的原料资源。现有猪胎盘TF制造技术对猪胎盘的使用效率较差，仅在匀浆液离心后选取离心上清液用于制备猪胎盘TF，而舍弃了离心沉淀物。本发明中，对离心沉淀物进行了二次提取：进一步将离心沉淀物与经乙酸调节pH值为3.5-5.5的注射用水混合，经胶体磨匀浆获得匀浆液，进行细胞破碎，离心获得离心上清液，用于制备猪胎盘TF。本发明利用了乙酸的腐蚀性，制成乙酸溶液用于与猪胎盘组织的混合、匀浆，尤其是在对离心沉淀物的二次提取时提高了乙酸溶液中乙酸的浓度，有利于猪胎盘TF的高效率提取，实现了离心沉淀物的二次提取，提高了猪胎盘TF的收获率。此外，猪胎盘具有较好的韧性，较难切碎。因此，本发明对猪胎盘先采用切肉机切碎后，再经绞肉机绞碎，最后再经胶体磨匀浆获得匀浆液。相比现有猪胎盘TF制造技术，本发明更好地破碎了胎盘，提高了猪胎盘TF的收获率。

6.现有猪胎盘TF制造技术缺乏渗透压调节工艺，无法获得等渗猪胎盘TF，无法与弱毒疫苗联合免疫、联合冻干和同针注射，限制了猪胎盘TF的应用效果和使用范围。本发明实现了渗透压调节技术工艺，对猪胎盘TF粗制品进行渗透压调节至等渗溶液(280-320mosm/kg)，实现了猪胎盘TF与弱毒疫苗的联合免疫、联合冻干和同针注射，提升了猪胎盘TF的应用效果，扩大了猪胎盘TF的使用范围。

附图说明

图1是对比例3中猪细小病毒检验结果。

具体实施方式

实施例1

一种猪胎盘转移因子的制备方法，包括以下步骤：

1)选取健康母猪的胎盘，猪胎盘无牛病毒性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒及非洲猪瘟病毒污染，去除猪胎盘表面的筋膜、结缔组织膜，用注射用水洗净后，经切肉机切碎后再经绞肉机绞碎，将注射用水与绞碎后的猪胎盘混合，经胶体磨匀浆获得匀浆液。

2)匀浆液经细胞破碎后，进行离心分别获得一次离心上清液和一次离心沉淀物。进一步将一次离心沉淀物与经乙酸调节pH值为4.5的注射用水混合，经胶体磨匀浆获得匀浆液，进行细胞破碎，离心获得二次离心上清液。合并一次和二次离心液，将收获的离心上清液采用0.45μm滤膜进行切向流过滤，收集透过物。

其中，细胞破碎方法为：第一次细胞破碎采用超声波细胞破碎仪破碎，第二次细胞破碎采用高压均质机破碎。

3)小于10kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤2)中透过物采用10kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于10kDa猪胎盘转移因子粗制品。

4)小于8kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤2)中透过物采用8kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于8kDa猪胎盘转移因子粗制品。

5)5至8kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤4)中小于8kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用5KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为5至8kDa猪胎盘转移因子粗制品。

6)小于3kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤2)中透过物采用1000kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物并采用3KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于3kDa猪胎盘转移因子粗制品。

7)将步骤3)至步骤6)中所制备不同分子量的猪胎盘转移因子粗制品混合，混合比例为：小于10kDa猪胎盘转移因子粗制品占混合液体积比40％，5至8kDa猪胎盘转移因子粗制品占混合液体积比30％，小于3kDa猪胎盘转移因子粗制品占混合液体积比30％，即为猪胎盘转移因子初制品。

8)对猪胎盘转移因子初制品，采用去除/灭活病毒方法进行除病毒后(先后为以下两种：低pH孵放法：pH 3.0时25℃反应1d；甲醛灭活法：0.05％浓度时37℃灭活12h)，调节PH至7.5，渗透压调节至283mosm/kg，采用0.22μm除菌过滤器除菌，即获得猪胎盘转移因子。该猪胎盘转移因子无牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒及非洲猪瘟病毒污染。该产品尤其适用于提高猪体液免疫功能(分子量小于3kDa的猪胎盘转移因子体积比为30％-60％)。

步骤1)中，健康母猪未经特定疫苗免疫或特定抗原刺激而抗体阴性，因此，步骤8)获得的是非特异性的猪胎盘转移因子。

实施例2

一种猪胎盘转移因子的制备方法，包括以下步骤：

1)选取健康母猪的胎盘，猪胎盘无牛病毒性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒及非洲猪瘟病毒污染，去除猪胎盘表面的筋膜、结缔组织膜，用注射用水洗净后，经切肉机切碎后再经绞肉机绞碎，将经乙酸调节pH值为3.5的注射用水与绞碎后的猪胎盘混合，经胶体磨匀浆获得匀浆液。

2)匀浆液经细胞破碎后，进行离心分别获得一次离心上清液和一次离心沉淀物。进一步将一次离心沉淀物与经乙酸调节pH值为5.5的注射用水混合，经胶体磨匀浆获得匀浆液，进行细胞破碎，离心获得二次离心上清液。合并一次离心上清液和二次离心上清液，将收获的离心上清液采用0.22μm滤膜进行切向流过滤，收集透过物。

细胞破碎方法为：第一次细胞破碎采用反复冻融破碎，第二次细胞破碎采用超声波细胞破碎仪破碎。

3)小于10kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤2)中透过物采用10kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于10kDa猪胎盘转移因子粗制品。

4)8至10kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤3)中小于10kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用8KD滤膜进行切向流过滤，收集截留物，即为8至10kDa猪胎盘转移因子粗制品。

5)小于3kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤3)中小于10kDa猪胎盘转移因子粗制品，采用3KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于3kDa猪胎盘转移因子粗制品。

6)将步骤4)至步骤5)中所制备不同分子量范围的猪胎盘转移因子粗制品混合，混合比例为：8至10kDa猪胎盘转移因子粗制品占混合液体积比40％，小于3kDa猪胎盘转移因子粗制品占混合液体积比60％，即为猪胎盘转移因子初制品。

7)对猪胎盘转移因子初制品，采用去除/灭活病毒方法进行除病毒后(先后为以下两种：β-丙内酯灭活法：0.025％浓度时4℃灭活24h后37℃水解2h；膜过滤法：采用45nm除病毒过滤器过滤)，调节PH至6.5，渗透压调节至320mosm/kg，采用0.1μm除菌过滤器除菌，即获得猪胎盘转移因子。该猪胎盘转移因子无牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒及非洲猪瘟病毒污染。该产品尤其适用于提高猪体液免疫功能(分子量小于3kDa的猪胎盘转移因子体积比为30％-60％)。

步骤1)中，健康母猪未经特定疫苗免疫或特定抗原刺激而抗体阴性，因此，步骤7)获得的是非特异性的猪胎盘转移因子。

实施例3

一种猪胎盘转移因子的制备方法，其包括以下步骤：

1)选取健康母猪的胎盘，猪胎盘无牛病毒性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒及非洲猪瘟病毒污染。去除猪胎盘表面的筋膜、结缔组织膜，用注射用水洗净后，经切肉机切碎后再经绞肉机绞碎，将经乙酸调节pH值为6.5的注射用水与绞碎后的猪胎盘混合，经胶体磨匀浆获得匀浆液。

2)匀浆液经细胞破碎后(反复冻融破碎)，进行离心分别获得离心上清液和离心沉淀物。将收获的离心上清液采用0.45μm滤膜进行切向流过滤，收集透过物。

3)小于10kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤2)中透过物采用10kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于10kDa猪胎盘转移因子粗制品。

4)小于5kDa猪胎盘转移因子粗制品的制备：将步骤2)中透过物采用5kDa滤膜进行切向流过滤，收集透过物，即为小于5kDa猪胎盘转移因子粗制品。

5)将步骤3)至步骤4)中所制备的不同分子量范围的猪胎盘转移因子粗制品混合，混合比例为：小于10kDa猪胎盘转移因子粗制品占混合液体积比70％，小于5kDa猪胎盘转移因子粗制品占混合液体积比30％，即为猪胎盘转移因子初制品。

6)对猪胎盘转移因子初制品，采用去除/灭活病毒方法进行除病毒后(先后为以下两种：低pH孵放法：pH 4.0时4℃反应2h；β-丙内酯灭活法：0.001％浓度时4℃灭活6h后37℃水解2h)，调节PH至7.2，渗透压调节至290mosm/kg，采用0.22μm除菌过滤器除菌，即获得猪胎盘转移因子。所获得的猪胎盘转移因子无牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒及非洲猪瘟病毒污染。

步骤1)中，健康母猪经猪细小病毒疫苗免疫后猪细小病毒抗体阳性，因此，步骤6)获得的是猪细小病毒特异性的猪胎盘转移因子。

以下通过对比例1-3，将本发明制备的猪胎盘转移因子与现有猪胎盘转移因子进行对比试验。

对比例1

本发明实施例1制备的猪胎盘转移因子与现有猪胎盘转移因子对猪B淋巴细胞EAC花环结合率影响的对比实验

本试验中所用到的现有猪胎盘转移因子制备方法如下：

将猪胎盘匀浆，反复冻融6次后，与pH值为4的盐酸溶液混合，4℃下搅拌浸提12h后，依次以200目和300目滤网进行双层过滤，得到分离液和沉淀，将分离液与壳聚糖(体积与质量比100:2)混合后，离心获得上清液，依次进行0.22μm滤膜微滤、6KD滤膜超滤，收集透过物，pH调节至6.9，渗透压调节至282mosm/kg，0.22μm除菌过滤器除菌，即为现有猪胎盘转移因子。

EAC花环(Erythrocyte-Antibody-Complement)形成试验法是通过检测B淋巴细胞活性从而反映机体体液免疫水平的一种常用试验方法。其原理是当红细胞(Erythrocyte，E)与相应的抗体(Antibody，A)溶血素结合形成抗原抗体复合物(EA)，EA激活补体的经典途径从而产生活化的补体3(Complement component 3，C3)，EA与活化的C3结合形成EAC，EAC上的C3能与B淋巴细胞膜上的补体3受体(Complement Receptor 3，C3-R)结合，形成EAC花环。而T淋巴细胞膜上无C3-R，因此不能形成花环。

1试验材料

1.1动物 健康成年公绵羊、健康育肥猪。

1.2试剂 淋巴细胞分离液、冻干补体、溶血素、戊二醛、甘油、甲醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠、碳酸氢钠、枸橼酸、枸橼酸钠、葡萄糖、姬姆萨染料。

1.3仪器 离心机、光学显微镜、水浴锅。

2试验方法

将本发明实施例1制备的猪胎盘转移因子与现有猪胎盘转移因子，分别按照EAC花环试验法进行检验，操作法具体如下：

2.1试剂配制

2.1.1 Hank’s液 将0.3％磷酸二氢钾溶液，0.76％磷酸氢二钠溶液，2％氯化钾溶液及20％氯化钠溶液依次按20:20:20:40比例混合，加葡萄糖1.0g，溶解混匀，用水稀释至1000ml，并用4％碳酸氢钠溶液调节pH值至7.2～7.3(临用时配制)。

2.1.2阿氏液 取氯化钠0.420g，枸橼酸0.055g，枸橼酸钠0.766g，葡萄糖2.05g，加水溶解并稀释至100ml，灭菌。

2.1.3分离液 为淋巴细胞分离液。

2.1.4羊血 取绵羊静脉血5.0ml，加入5.0ml阿氏液中，冰箱保存。

2.1.5固定液 取25％戊二醛溶液，3.5％碳酸氢钠溶液及Hank’s液依次按1:1:38比例混合。

2.1.6姬姆萨染色液原液 取姬姆萨染料0.5g，加甘油33ml，55～60℃加热至姬姆萨染料溶解，冷至室温，加入33ml甲醇，室温放置24h后，用滤纸过滤，滤液即为原液。密封室温保存。

2.1.7染色液 取姬姆萨染色液原液2.0ml，加Hank’s液6.0ml，摇匀，以1500r/min离心10min，取上清液待用。

2.1.8积压绵羊红细胞溶液(SRBC)的制备取绵羊静脉血5.0ml，加入5.0ml阿氏液中，用适量生理盐水液洗涤细胞，1500r/min离心10min，弃去上清，洗涤三次(操作同前)。加入适量生理盐水液重悬沉淀细胞，2000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀细胞即为积压SRBC。

2.1.9 4％SRBC的制备 取积压SRBC 40μl，加Hank’s液至1ml，即为4％SRBC。

2.1.10补体 取1ml生理盐水溶解冻干补体，至补体完全溶解时用Hank’s液1:100稀释后放置4℃备用。

2.1.11溶血素(1：4000) 取1μl溶血素，加Hank’s液至4ml。

2.2待检样品溶液的制备 取本发明实施例1制备的猪胎盘转移因子与现有猪胎盘转移因子，分别用Hank’s液稀释成每1.0ml中含1.0mg多肽的待检样品溶液。

2.3操作法

2.3.1脾脏B淋巴细胞的制备 取新鲜猪脾脏，放置75％酒精中消毒后用Hank’s液清洗数次，去除表面层组织后剪碎，加入Hank’s液研磨后经100目筛过滤，用适量Hank’s液洗涤细胞，1500r/min离心3～5min，弃去上清液，洗涤三次(操作同前)。用适量Hank’s液重悬沉淀细胞，将此溶液加入已含有分离液的离心管中，以2000r/min离心20min，小心吸出中间层的淋巴细胞，放入另一离心管中，加适量Hank’s液洗涤三次(操作同前)，再用适量Hank’s液重悬沉淀细胞，分成两份，一份用Hank’s液适当稀释并计数，使最终浓度为每1.0ml约为4×10

2.3.2脱C3-R脾脏B淋巴细胞悬液的制备取另一份脾脏B淋巴细胞，置45℃恒温水浴保温30min(每隔10min振摇一次)，1500r/min离心3～5min，弃上清液并用适量Hank’s液重悬细胞，放置45℃恒温水浴保温30min，取出后以1500r/min转离心3～5min，弃去上清液。用Hank’s液洗涤三次(操作同前)，再用Hank’s液适当稀释并计数，使最终浓度为每1.0ml约为4×10

2.3.3 4％EAC复合物的制备 取1ml 4％积压SRBC，加入等量溶血素(1:4000)，混匀，置于37℃水浴15min，800r/min离心5min，弃上清液，用Hank’s液洗涤2次(操作同前)，再加入Hank’s液恢复至2ml，同时加入2ml补体，混匀，置于37℃水浴15min，800r/min离心5min，弃上清液，用Hank’s液洗涤2次(操作同前)，再加入Hank’s液恢复至2ml，即为4％EAC复合物。

2.3.4试验设计 试验分成实验组1、实验组2、对照组及空白组共4组(如表1)。其中，实验组1和实验组2分别加入本发明实施例1猪胎盘转移因子待检样品0.1ml与现有猪胎盘转移因子待检样品0.1ml，再分别加入脱C3-R脾脏B淋巴细胞悬液0.2ml；对照组加入Hank’s液0.1ml和脱C3-R脾脏B淋巴细胞悬液0.2ml；空白组加入Hank’s液0.1ml和脾脏B淋巴细胞悬液0.2ml。每组各做3个重复管。37℃温浴1.0h后，各加EAC复合物0.2ml，摇匀，以500r/min离心3min，放入4℃冰箱过夜。次日取出，弃去上清液，每管中各加入固定液一滴，轻轻摇匀，静置10min，加入染色液2滴并摇匀，静置15min后开始计数。

表1试验设计

2.3.5测定 数计数板64个大方格上所有淋巴细胞的个数(不少于200个)，统计其中的EAC花环结形成的细胞数(结合不少于3个绵羊红细胞的淋巴细胞)，求得3个平行管EAC花环结合率，取平均值。

2.3.6数据处理所得数据用单因素方差分析和最小显著性差异法(LSD)分析，P<0.01为差异极显著。

3结果

3.1温浴脱C3-R受体对花环结合率的影响

结果显示(如表2)，空白组EAC花环结合率(60.7％)极显著高于对照组(31.7％)(P<0.01)，空白组EAC花环结合率比对照组提高了29.0％，说明45℃水浴对B淋巴细胞膜C3-R有脱落的作用，显著降低了EAC花环结合率。

表2温浴脱C3-R受体对花环结合率影响结果

注：差值＝空白组均值(％)-对照组均值(％)；上标不同的小写字母表示差异极显著(P<0.01)。

3.2猪胎盘转移因子对EAC花环结合率的影响

结果显示(如表3)，实验组1和实验组2的EAC花环结合率(53.4％和44.0％)均极显著高于对照组(31.7％)(P<0.01)，分别提高了21.7％和12.3％。实验组1的EAC花环结合率极显著高于实验组2(P<0.01)，提高了9.4％。

结果表明，猪胎盘转移因子对脱C3-R B淋巴细胞有恢复C3-R功能的作用，可提高C3-R对抗原、抗体及补体三者形成复合物的结合能力。其中，本发明实施例1猪胎盘转移因子的效力显著高于现有猪胎盘转移因子。

表3猪胎盘转移因子对EAC花环结合率的影响

注：差值＝实验组均值(％)-对照组均值(％)；上标不同的小写字母表示差异极显著(P<0.01)。

对比例2

本发明实施例2制备的猪胎盘转移因子与现有猪胎盘转移因子对猪B淋巴细胞活性影响的对比实验

本试验中所用到的现有猪胎盘转移因子制备方法如下：

将猪胎盘绞碎后，与pH值为3.5的盐酸溶液混合匀浆，反复冻融6次，离心得到分离液和沉淀，将分离液依次进行0.22μm滤膜微滤、5KD滤膜超滤，收集透过物，pH调节至7.0，渗透压调节至290mosm/kg，0.22μm除菌过滤器除菌，即为现有猪胎盘转移因子。

定量溶血分光光度法(Quantitative Hemolysis Spectrophotometry，QHS)通过测定由B细胞分泌产生的抗体裂解红细胞所释放的血红蛋白，并以光密度(OpticalDensity，OD)表示，从而反映猪胎盘转移因子在提高机体体液免疫方面的生物活性。

1试验材料

1.1动物 3周龄的健康仔猪、健康成年公绵羊。

1.2试剂 凝血酶、冻干补体、RPMI-1640培养液、青霉素链霉素溶液-双抗、新生牛血清、淋巴细胞分离液、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠、碳酸氢钠、枸橼酸、枸橼酸钠、葡萄糖、台盼蓝。

1.3材料 尼龙棉、一次性使用无菌注射器。

1.4仪器 离心机、CO

2试剂配制

2.1Hank’s液 将0.3％磷酸二氢钾溶液，0.76％磷酸氢二钠溶液，2％氯化钾溶液及20％氯化钠溶液依次按20:20:20:40比例混合，加葡萄糖1.0g，溶解混匀，用水稀释至1000ml，并用4％碳酸氢钠溶液调节pH值至7.2～7.3(临用时配制)。

2.2阿氏液 取氯化钠0.420g，枸橼酸0.055g，枸橼酸钠0.766g，葡萄糖2.05g，加水溶解并稀释至100ml，灭菌。

2.3分离液 为淋巴细胞分离液。

2.4羊血 取绵羊静脉血5.0ml，加入5.0ml阿氏液中，冰箱保存。

2.5积压绵羊红细胞溶液(SRBC)的制备取绵羊静脉血5.0ml，加入5.0ml阿氏液中，用适量Hank’s液洗涤细胞，1500r/min离心10min，弃去上清，洗涤三次(操作同前)。加入适量Hank’s液重悬沉淀细胞，2000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀细胞即为积压SRBC。

2.6 10％ SRBC悬液的制备取积压SRBC，用RPMI 1640培养液将其稀释成10％SRBC悬液。

2.7补体 取1ml生理盐水溶解冻干补体，放置4℃备用。

2.8 0.2％SRBC悬液的制备将补体和积压SRBC按10：1的比例混合，放置4℃30min后，加入生理盐水配成0.2％SRBC悬液(临用时配制)。

2.9RPMI 1640培养液取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L)，加800ml水和3.75g碳酸氢钠，放置4℃搅拌溶解，4h后，加青霉素10

2.10维持培养基 取新生牛血清2ml，加RPMI 1640培养液至100ml，4℃保存备用。

2.11完全培养基 取新生牛血清20ml，加RPMI 1640培养液至100ml，4℃保存备用。

2.12尼龙棉处理 将尼龙棉浸湿于0.2ml/L盐酸溶液1000ml数小时后，用蒸馏水5000ml冲洗，37℃烘干。

2.13尼龙棉柱的制备 称取0.3g尼龙棉，细致的撕开，使其松散而均匀，放于盛Hank’s液的平皿中完全浸透，以小镊子填塞于5ml注射器中，边装边排气泡，使尼龙棉在注射器内疏松并均匀分布(所有操作均在无菌条件下进行)。

3试验方法

3.1试验设计

选取健康仔猪18头，随机分成3组，每组6头。其中，实验组1和实验组2猪分别颈部肌肉注射本发明实施例2猪胎盘转移因子与现有猪胎盘转移因子，注射剂量均为2.0ml/头，同时设立不注射的空白组，如表1。各组分别于注射后第5d和10d采血，提取B淋巴细胞，通过定量溶血分光光度法，检测猪胎盘转移因子对猪体液免疫功能的影响。

表4试验设计

3.2试验步骤

3.2.2操作法

3.2.2.1猪单个核细胞悬液制备 取猪抗凝血，加等量Hank’s液稀释成细胞悬液后轻轻加入到已含有等量分离液的离心管中。以2000r/min离心20min，小心吸出中间层的单个核细胞，放入另一离心管中，加适量Hank’s液洗涤，摇匀，以1500r/min离心3～5min，弃去上清，再洗涤一次后，用Hank’s液适当稀释，用台盼蓝染色并计数(计数活细胞数>95％)，使最终单个核细胞浓度为(2×10

3.2.2.2去除血小板 在每毫升上述细胞悬液中加入凝血酶一滴，加盖，来回摇动2min，直至出现肉眼可见的乳白色血小板絮状凝块。立即在水平式离心机中1000r/min离心30s，管底沉淀为血小板。吸上层，即淋巴细胞悬液，数管合并，以1000r/min离心10min，弃上清，用完全培养液使细胞终浓度为5×10

3.2.2.3细胞过柱 取出尼龙棉柱，拔出针头，使原有管中的Hank’s液流出，用预温至37℃的完全培养液5ml洗柱，洗毕后将针头塞好。取上述淋巴细胞悬液滴入尼龙棉柱中，约10滴/min。平放尼龙棉柱，以细长的滴管伸入柱内近尼龙棉的界面。加0.5ml完全培养液封口。37℃平放培育1～2h取出，以37℃预温的完全培养液分次洗柱，洗下的悬液即为T淋巴细胞悬液。

3.2.2.4 B淋巴细胞悬液收集 取室温完全培养液分次加入尼龙棉柱内，每加一次，轻轻捏挤尼龙面，使尼龙棉内粘附的B淋巴细胞洗脱，收集B淋巴细胞悬液，计数并用维持培养液将细胞浓度为稀释至(1×10

3.2.2.5 铺板 取48孔细胞培养板，分别加入500μl B淋巴细胞悬液和15μl 10％SRBC悬液，每份猪血样做4个重复孔。于37℃、5％CO

3.2.2.6检测 每孔分别加入现配500μl 0.2％SRBC悬液，放置37℃、5％CO

3.2.3数据处理 计算每组OD

活力＝(实验组OD

其中：OD

4结果

结果显示(如表5)，注射猪胎盘转移因子后第5d，各组的OD

结果表明，猪胎盘转移因子可提高猪体液免疫功能，且本发明实施例2猪胎盘转移因子的提高作用显著高于现有猪胎盘转移因子。

表5猪胎盘转移因子对猪效力检验的结果

注：上标不同的字母表示具有显著差异(P<0.05)。

对比例3

将本发明实施例3制备的猪胎盘转移因子与现有猪胎盘转移因子进行外源病毒检验的对比实验

本试验中所用到的现有猪胎盘转移因子制备方法如下：

将猪胎盘绞碎后，与注射用水混合匀浆，反复冻融6次后，离心得到分离液和沉淀，将分离液依次经0.22μm滤膜、300kDa滤膜、1KD滤膜进行切向流过滤，收集透过物，pH调节至7.1，渗透压调节至295mosm/kg，0.1μm除菌过滤器除菌，即为现有猪胎盘转移因子。

1试验材料

1.1病毒检测试剂盒 牛病毒性腹泻病毒间接免疫荧光检测试剂盒，猪细小病毒间接免疫荧光检测试剂盒，猪瘟病毒间接免疫荧光检测试剂盒，猪圆环病毒2型间接免疫荧光检测试剂盒，猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型RT-PCR检测试剂盒，猪伪狂犬病毒PCR检测试剂盒，口蹄疫病毒多重RT-PCR检测试剂盒。

1.2毒株 牛病毒性腹泻病毒(NADL株)，猪细小病毒(NADL-2株)，猪瘟病毒(法国Thiverval株)，猪圆环病毒2型(DBN-SX07株)。

1.3细胞 MDBK细胞、ST细胞、Vero细胞及PK-15细胞。

1.4试剂 姬姆萨染料、甲醇、丙酮、豚鼠红细胞、鸡红细胞、非洲猪瘟P72基因重组质粒、DNA提取试剂盒、10×Taq buffer(含25mmol/L Mg

1.5仪器 CO

2试验方法

本发明实施例3制备的猪胎盘转移因子、现有猪胎盘转移因子各取3瓶分别对应混合，作为被检样品，用于开展下面试验。

2.1牛病毒性腹泻病毒、猪细小病毒及猪瘟病毒检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验。

2.2猪繁殖与呼吸综合征病毒检验

按照“附注一外源病毒检验法”开展试验。

2.3口蹄疫病毒检验

按照“附注一外源病毒检验法”开展试验。

2.4伪狂犬病病毒检验

按照“附注一外源病毒检验法”开展试验。

2.5猪圆环病毒2型检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验。

2.6非洲猪瘟病毒检验

按农业农村部公告第172号《猪用生物制品及相关猪源原辅材料中非洲猪瘟病毒核酸检测方法》附件中“普通PCR检测法”进行检验。3结果

3.1牛病毒性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒检验结果

3.1.1荧光抗体检查法

采用荧光抗体检查法，先后对本发明实施例3制备的猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子，进行牛病毒性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒检验。

在细胞培养期内，细胞培养物的观察结果显示，接种本发明实施例3制备的猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子的F1代和F2代细胞均正常生长，未出现异常的变圆、空泡、聚堆、颗粒增多、萎缩、脱落等现象。

荧光抗体检查结果显示，阳性对照孔均出现典型的特异性黄绿色荧光，阴性对照孔均未出现特异性黄绿色荧光，试验成立。其中，在牛病毒性腹泻病毒和猪瘟病毒检验中，接种本发明实施例3猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子的待检细胞孔均未出现特异性黄绿色荧光，判为阴性。在猪细小病毒检验中，接种本发明实施例3猪胎盘转移因子的待检细胞孔未出现特异性黄绿色荧光，判为阴性；而接种现有猪胎盘转移因子的待检细胞孔出现典型的特异性黄绿色荧光，判为阳性。

结果表明，本发明实施例3制备的猪胎盘转移因子无牛病毒性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒污染。现有猪胎盘转移因子无牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒污染，但是存在猪细小病毒污染。

3.1.2致细胞病变检验和红细胞吸附性外源病毒检验结果

采用致细胞病变检查法和红细胞吸附性外源病毒检验法，对本发明实施例3制备的猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子进行外源病毒检验，检验结果显示，本发明实施例3制备的猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子的待检样品均未见由外源病毒引起的特异性CPE，且均未出现外源病毒所致的红细胞吸附现象。

结果表明，本发明实施例3制备的猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子的致细胞病变检验和红细胞吸附性外源病毒检验结果均合格。

3.2猪繁殖与呼吸综合征病毒检验结果

采用RT-PCR法，先后对本发明实施例3制备的猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子进行猪繁殖与呼吸综合征病毒检验，检验结果显示，猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性对照均出现436bp扩增带，阴性对照均未出现扩增带，实验结果成立；本发明实施例3制备的猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子的待检样品均未出现436bp扩增带，判为阴性。

结果表明，本发明实施例3制备的猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子均无猪繁殖与呼吸综合征病毒污染。

3.3口蹄疫病毒检验结果

采用RT-PCR法，先后对本发明实施例3制备的猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子进行口蹄疫病毒检验，检验结果显示，口蹄疫病毒阳性对照均出现634bp、483bp、278bp扩增带，阴性对照均未出现扩增带，实验结果成立；本发明实施例3制备的猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子的待检样品均未出现634bp、483bp、278bp扩增带，判为阴性。

结果表明，本发明实施例3制备的猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子均无口蹄疫病毒污染。

3.4伪狂犬病病毒检验结果

采用PCR法，先后对本发明实施例3制备的猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子进行伪狂犬病病毒检验，检验结果显示，伪狂犬病病毒阳性对照均出现217bp扩增带，阴性对照均未出现扩增带，实验结果成立；本发明实施例3制备的猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子的待检样品均未出现217bp扩增带，判为阴性检验。

结果表明，本发明实施例3制备的猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子均无伪狂犬病病毒污染。

3.5猪圆环病毒2型检验结果

采用荧光抗体检查法，对本发明实施例3制备的猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子进行猪圆环病毒2型检验。

在细胞培养期内，细胞培养物观察结果显示，接种本发明实施例3制备的猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子的F1代和F2代细胞均正常生长，未出现异常的变圆、空泡、聚堆、颗粒增多、萎缩、脱落等现象。

荧光抗体检查结果显示，阳性对照孔均出现典型的特异性胞核内黄绿色荧光，阴性对照孔均未出现特异性黄绿色荧光，试验成立；接种本发明实施例3猪胎盘转移因子的待检细胞孔和现有猪胎盘转移因子的待检细胞孔均未出现特异性黄绿色荧光，均判为阴性。

结果表明，本发明实施例3猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子均无猪圆环病毒2型污染。

3.6非洲猪瘟病毒检验结果

采用PCR法，对本发明实施例3猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子进行非洲猪瘟病毒检验，检验结果显示，阳性对照出现257bp的特异性条带，阴性对照不出现257bp的特异性条带，试验成立；本发明实施例3猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子均未出现与阳性对照大小一致的扩增条带，判定为非洲猪瘟病毒核酸阴性。

结果表明，本发明实施例3猪胎盘转移因子和现有猪胎盘转移因子均无非洲猪瘟病毒污染。

附注一外源病毒检验法

1样品处理

1.1原料猪胎盘样品处理 随机抽取的猪胎盘样品数量不低于全批胎盘总数量的1％，每个猪胎盘取样约3.0g，混合后匀浆，反复冻融后离心，取离心上清经0.22μm除菌过滤器除菌，备用。

1.2猪胎盘转移因子样品处理 同批猪胎盘转移因子取3瓶混合后作为待检样品。

2牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒以及猪圆环病毒2型检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，检验结果均应为阴性。

3猪细小病毒检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，检验结果应为阴性。

4猪繁殖与呼吸综合征病毒检验

按北京世纪元亨动物防疫技术有限公司的猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型RT-PCR检测试剂盒进行检验，检验结果应为阴性。

4.1病毒RNA的提取

4.1.1各取样品、阳性对照和阴性对照100μl，分别加入裂解液600μl，充分颠倒混匀，室温静置3～5min。

4.1.2将液体吸入吸附柱中(吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱)，13000r/min离心30s。

4.1.3弃去收集管中液体，加入600μl洗液，13000r/min离心30s。

4.1.4重复步骤4.1.3。

4.1.5弃去收集管中液体，13000r/min空柱离心2min，以除去残留的洗涤液。

4.1.6将吸附柱移入新的1.5ml离心管中，向柱中央加入洗脱液50μl，室温静置1min，13000r/min离心30s，离心管中液体即为模板RNA。

4.2RT-PCR扩增

4.2.1每份总体积20μl，含16.8μl RT-PCR反应液(用前混匀)，1.2μl酶混合液，2μl模板RNA。

4.2.2在PCR扩增仪进行以下程序：(1)42℃45min，95℃3min。(2)循环94℃30s，55℃30s，72℃30s，共35次；再72℃延伸7min。

4.3结果分析和判定

电泳结束后，取出凝胶板置于紫外透射仪上打开紫外灯观察，阳性对照出现436bp扩增带、阴性对照无带出现(引物带除外)时，试验结果成立。待检样品出现436bp扩增带为猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性，否则为阴性。

5口蹄疫病毒检验

按中国农业科学院兰州兽医研究所的口蹄疫病毒多重RT-PCR检测试剂盒进行检验，检验结果应为阴性。

5.1病毒RNA提取

5.1.1用移液器将560μl Carrier RNA工作液加入一个干净的1.5ml离心管中。

5.1.2向离心管中加入140μl样品(样品需平衡至室温)。涡旋振荡15s混匀，为了保证裂解充分，样品和Carrier RNA工作液需要彻底混匀。

5.1.3在室温(15℃～25℃)孵育10min。

5.1.4简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。

5.1.5加入560μl无水乙醇，盖上管盖涡旋振荡15s。

5.1.6简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。

5.1.7仔细将离心管中的630μl液体转移至RNase-Free吸附柱CR2(吸附柱放在收集管中)，盖上管盖，8000r/min离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

5.1.8将剩余离心管中液体按步骤5.1.7再次过柱。

5.1.9小心打开吸附柱盖子，加入500μl溶液GD(

5.1.10小心打开吸附柱盖子，加入500μl溶液RW(

5.1.11重复步骤5.1.10。

5.1.12将吸附柱放回收集管中，12 000r/min离心3min，使吸附膜完全变干，弃废液。乙醇的残留可能会对后续试验造成影响。

5.1.13将吸附柱放回2.0ml收集管中，打开吸附柱盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干。

5.1.14将吸附柱放入一个RNase-Free离心管(1.5ml)中，小心打开吸附柱的盖子，向吸附膜的中间部位悬空滴加60μl RNase-Free ddH

5.2RT-PCR

5.2.1每份总体积25μl，含12.5μl 2×mRT-PCR Buffer，3.0μl Primer Mix，1.0μlmRT-PCR Enzyme Mix，3.5μl RNase-free water，5μl Total RNA。

5.2.2在PCR扩增仪进行以下程序：(1)45℃30min；94℃3min。(2)循环94℃30s，58℃30s，72℃30s，共35次；再72℃延伸5min。

5.3结果分析和判定

电泳结束后，取出凝胶板置于紫外透射仪上打开紫外灯观察，阳性对照电泳结果应为3条大小不一的条带，分别为634bp、483bp和278bp。如样品扩增产物的DNA带至少有一条与以上条带大小相符，同时空白对照无扩增条带，则该样品判定为阳性。

6伪狂犬病病毒检验

按北京世纪元亨动物防疫技术有限公司的猪伪狂犬病毒PCR检测试剂盒进行检验，检验结果应为阴性。

6.1样品处理各取样品、阳性对照和阴性对照100μl，分别加入200μl消化液和20μl蛋白酶k，振荡混匀后，置56℃水浴中消化1.0h。

6.2病毒DNA的提取

6.2.1从水浴锅中取出样品、阳性对照和阴性对照管，降至室温后，加入300μl DNA结合液，颠倒混匀，将全部液体移入吸附柱中(吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱)，室温静置3min，10000r/min离心30s。

6.2.2弃去收集管中液体，加入500μl DNA洗涤液，10000r/min离心30s。

6.2.3重复步骤6.2.2。

6.2.4弃去收集管中液体，10000r/min空柱离心1min，以除去残留的DNA洗涤液。6.2.5将吸附柱放入新的1.5ml离心管中，向柱中央加入DNA洗脱液(最好56℃预热)50μl，室温静置2min，10000r/min离心30s，离心管中液体即为模板DNA。

6.3PCR扩增

6.3.1每份总体积20μl，含16μl PCR反应液(用前混匀)，2μl Taq DNA聚合酶，2μl模板DNA。

6.3.2在PCR扩增仪上进行以下程序：(1)94℃3min。(2)循环94℃30s，65℃30s，72℃30s，共35次；再72℃延伸7min。

6.4结果分析和判定

电泳结束后，取出凝胶板置于紫外透射仪上打开紫外灯观察，阳性对照出现217bp扩增带，阴性对照无带出现(引物带除外)时，试验结果成立。待检样品出现217bp扩增带为PRV阳性，否则为阴性。

7非洲猪瘟病毒检验

按农业农村部公告第172号《猪用生物制品及相关猪源原辅材料中非洲猪瘟病毒核酸检测方法》进行检验，检验结果应为阴性。