Arhgap44促进剂在抑制阿片类药物诱发的痛觉过敏中的应用

摘要

本发明公开了Arhgap44促进剂在抑制阿片类药物诱发的痛觉过敏中的应用。本发明还公开了一种可用于治疗阿片类药物诱发的痛觉过敏的药物组合物，该药物组合物的主要成分为Arhgap44促进剂。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及Arhgap44促进剂在抑制阿片类药物诱发的痛觉过敏中的应用。

背景技术

阿片类药物是临床治疗急、慢性疼痛及癌痛的最重要的镇痛药物，临床用药量极大，但它们在镇痛的同时还能够激活体内的促伤害感受机制，表现为机体对伤害性刺激的反应性增强，镇痛药物需求量增加，即阿片类药物诱发的痛觉过敏(opioid-inducedhyperalgesia，OIH)。瑞芬太尼是一种超短效的μ-阿片受体激动剂，由于它具有起效快、清除快、无蓄积、代谢不依赖于肝肾功能等优点广泛应用于临床术中镇痛。但是，瑞芬太尼诱发术后痛觉过敏(remifentanil-induced postoperative hyperalgesia，RIH)的发生率远高于其他阿片类镇痛药物，高达85％。另有一项研究发现，手术时间超过2小时的患者，RIH的发生率为32.7％，累计输注量超过30μg/kg时，RIH的发生率甚至高达41.8％。RIH的主要特征为瑞芬太尼以0.05～0.3μg/kg/min的速度输注60～90min后出现术后切口疼痛的程度和范围增加，以及阿片类镇痛药需求增加。RIH不仅降低了药物的镇痛效果，还促进了痛觉感知，产生异常疼痛，甚至引发术后慢性疼痛的发生，患者对阿片类药物剂量需求越来越大，不仅增加住院时间、医疗费用、占用医疗资源，最关键的是增加了患者的身心创伤，加重了患者的痛苦，严重影响了患者的生活质量。目前，临床无有效的治疗措施，主要是因为其发生机制目前尚不清楚，因此，深入阐明瑞芬太尼诱发痛觉过敏的发病机制和寻找有效治疗策略是当务之急。

发明内容

本发明提供了促进Arhgap44的试剂在制备预防或治疗阿片类药物诱发的术后痛觉过敏的药物中的应用。

进一步，所述阿片类药物是瑞芬太尼。

进一步，促进Arhgap44的试剂包括促进Arhgap44表达的试剂。

进一步，促进Arhgap44表达的试剂包括促进Arhgap44基因mRNA表达的试剂和/或促进Arhgap44蛋白表达的试剂。

进一步，促进Arhgap44基因表达的试剂和促进Arhgap44基因表达产物的试剂；所述促进Arhgap44基因表达的试剂包括促进基因转录的试剂、促进基因翻译的试剂、促进Arhgap44蛋白含量的试剂；所述促进Arhgap44基因表达产物的试剂包括促进Arhgap44基因表达产物稳定性的试剂、促进Arhgap44基因表达产物活性的试剂、促进Arhgap44基因表达产物功能的试剂。

具体地，所述促进Arhgap44基因表达的试剂包括：含有Arhgap44基因的试剂、携带Arhgap44基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有Arhgap44蛋白质的试剂。

进一步，促进Arhgap44表达的试剂包括Arhgap44过表达载体。

作为一个具体实施例，本发明的过表达载体是基因治疗载体，基因治疗载体形式将编码Arhgap44蛋白的核酸序列给药至待治疗的主体，该基因治疗载体即如下核酸构建体，该核酸构建体包括编码序列(包括翻译和终止密码子)，紧挨着外源性核酸表达所需的其它序列，诸如启动子、科扎比(Kozak)序列、多聚腺苷酸(polyA)信号等。在主体中表达外源性核酸序列的基因治疗载体是本领域众所周知的。例如，基因治疗载体可以是哺乳动物表达系统的一部分。现有技术中已经描述了有用的哺乳动物表达系统和表达构建体。此外，不同的制造商分售了几种哺乳动物表达系统并能用于本发明中，诸如基于质粒或病毒载体的系统，例如LENTI-SmartTM(InvivoGen)、GenScriptTM表达载体、pAdVAntageTM(Promega)、ViraPowerTM慢病毒、腺病毒表达系统(Invitrogen)和腺相关病毒表达系统(CellBiolabs)。

例如，本发明的基因治疗载体可以是适用于将外源性核酸引入到细胞中，用于随后表达由该核酸编码的蛋白的病毒表达载体或非病毒表达载体。

表达载体可以是：游离型载体，即，能在宿主细胞内自主地进行自我复制的载体；或整合型载体，即，能稳定并入到细胞基因组内的载体。在宿主细胞中的表达可以是组成型或受到调节的(例如，诱导型)。

本发明的基因治疗载体通常包括与编码Arhgap44蛋白的核酸功能性连接的启动子。启动子序列必须是紧凑并且保证强表达。优选地，启动子使Arhgap44蛋白在经基因治疗载体治疗的患者中表达。

作为可选的成分，基因治疗载体可包括增加Arhgap44蛋白表达水平的增强子元件。实例包括SV40早期基因增强子和劳斯氏肉瘤病毒(RousSarcomaVirus)的长末端重复序列(LTR)的增强子(Gormanetal.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.79:6777)。载体还任选包括用于改进人和/或非人抗原的表达的转录终止序列和多聚腺苷酸序列。例如，合适的转录终止子和多聚腺苷酸信号可源自SV40(Sambrooketal(1989),MolecularCloning:ALaboratoryManual)。

本领域已知的支持表达效率或特异性的任何其它元件都可添加到表达载体中，诸如土拨鼠肝炎转录后调控元件(wPRE)。

为了进一步提高基因表达水平，可在本发明的基因治疗载体中引入嵌合内含子。如本文所用的“嵌合内含子”指如下的内含子，该内含子包括源自两个不同基因的至少两个不同内含子的部分。

基因治疗载体可以通过本领域已知的标准方法，诸如DNA重组技术或化学合成进行构建和克隆。标准克隆方法描述在Sambrooketal.,1989,分子克隆:实验指南(MolecularCloning:A LaboratoryManual),冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarbourLabPress)中。

在特别优选的方面中，基因治疗载体是病毒表达载体。本发明使用的病毒载体通常包括其中缺失了一部分天然序列，以引入异种多核苷酸而不破坏病毒感染性的病毒基因组。由于病毒成分和宿主细胞受体之间发生特异的相互作用，病毒载体非常适于将基因高效地转移到靶细胞中。有助于基因转移到哺乳动物细胞中的合适的病毒载体是本领域众所周知的，并且可源自不同类型的病毒，例如，源自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、正粘病毒、副粘病毒、乳多空病毒、细小核糖核酸病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒或甲病毒。对于不同病毒载体系统的概述，参见Nienhuisetal.,Hematology,Vol.16:Virusesand BoneMarrow,N.S.Young(ed.),353-414(1993)。

根据本发明，基因治疗载体是腺病毒载体。

可根据标准技术产生重组病毒载体。例如，重组腺病毒或腺相关病毒载体能在人293细胞(其提供反式E1A和E1B特性)中传播，以达到在10

如下面实施例所述，与动物模型中已示出的类似，通过全身应用，例如通过载体的静脉内、动脉内或腹膜内递送，能实现本发明的基因治疗载体转导到待治疗的主体中(Katzetal.,2012,GeneTher19:659-669)。

除病毒载体外，非病毒表达构建体也可用于将编码蛋白或其功能变体或片段的基因导入细胞或人主体中。允许在靶细胞中体内表达蛋白的非病毒表达载体包括例如，诸如质粒pBK-CMV、pcDNA3.1和pZeoSV(Invitrogen,Stratagene)的载体。非病毒载体转入靶细胞的合适方法是例如脂质体转染法、磷酸-钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖法和使用微玻璃管等的直接DNA导入法。

进一步，宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

进一步，痛觉过敏包括机械痛觉过敏和热痛觉过敏。

进一步，所述药物的剂型是药剂学上可以接受的任何药物剂型。

本发明还提供了一种预防或治疗阿片类药物诱发的术后痛觉过敏的药物组合物，所述药物组合物包括促进Arhgap44的试剂。

优选地，促进Arhgap44的试剂包括抑促进Arhgap44表达的试剂。

优选地，促进Arhgap44表达的试剂包括促进Arhgap44基因mRNA表达的试剂和/或促进Arhgap44蛋白表达的试剂。

优选地，促进Arhgap44表达的试剂包括Arhgap44过表达载体。

本发明的药物组合物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；表面活性镁、聚乙二醇等。

附图说明

图1显示Arhgap44抑制瑞芬太尼输注后切口痛觉敏感的结果图，其中A：不同组机械性刺激诱发的缩足频率(％)；B：不同组热刺激的缩足潜伏期(sec)；NS：经腹腔持续输注与瑞芬太尼等容量的生理盐水60min；RI：经腹腔持续输注瑞芬太尼1μg·kg

图2显示ELISA结果图；

注：n＝10；***P<0.001，与NS组相比；$$$P<0.001，与RI组相比；two-way ANOVA。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

实施例Arhgap44与瑞芬太尼诱发的痛觉过敏相关性研究

一、实验方法

(1)实验分组：雄性SD小鼠24只，1月龄，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。采用随机数字表法分为4组(n＝6)：

1)生理盐水组(NS组)，经腹腔持续输注与瑞芬太尼等容量的生理盐水60min；

2)瑞芬太尼+切口痛组(RI组)，经腹腔持续输注瑞芬太尼1μg·kg

3)过表达腺病毒NC+瑞芬太尼+切口痛组(C+RI组)：在注射瑞芬太尼之前1月在L4-5背根神经节注射过表达腺病毒NC 1μl(上海吉玛基因公司)，经腹腔持续输注瑞芬太尼1μg·kg

4)过表达腺病毒Arhgap44+瑞芬太尼+切口痛组(A

(2)切口痛模型制作：制备切口痛模型。小鼠吸入2％七氟醚麻醉，消毒左后足，从足底近端0.2cm处向趾部做长约0.5cm的纵行切口，切开皮肤后，用眼科镊挑起足底肌肉并纵行分离至骨膜，保持肌肉起止和附着完整。按压止血后，以4-0丝线缝合皮肤。切口皮肤不能重叠、内翻、裂开。术后伤口用碘伏消毒，并涂抹少量红霉素软膏预防感染。

(3)行为学实验：于输注瑞芬太尼前24h(T0)、输注停止后2、6、24和48h(T1-4)时测定热刺激缩足潜伏期(PWL)和机械刺激缩足频率(PWF)，实验室温度18～22℃，安静。采用YLS-6B智能热板仪(淮北正华生物仪器设备有限公司)测定PWL，记录从左后足接触热板至出现回缩、踮脚、挣扎、嘶叫、舐足任一反应的时间为PWL，连续测定3次，间隔5min，取平均值作为PWL(sec)。为防止烫伤鼠爪，PWL上限定设置为20s。将大鼠置于20cm×20cm×20cm的金属笼内，30min后，以BSEVF3 von Frey纤维丝0.4g(Harvard Apparatus公司，美国)刺激右后足2、3趾骨间，垂直施加压力，记录出现快速缩足反应、舔舐右足或嘶叫时压力，连续测定10次，间隔1min，取缩足频率为PWF(％)。

(4)ELISA：于最后1次行为学测定结束后，处死小鼠，取L4-5背根神经节，采用ELISA法测定Arhgap44的表达。脊髓背角组织加入预冷的组织蛋白裂解液，研磨成组织匀浆。将匀浆液4℃离心5min，12000rpm，离心半径10cm，上清液即为脊髓组织总蛋白。用膜蛋白提取试剂盒(Thermo公司，美国)，按照说明书进行具体操作提取膜蛋白。使用Arhgap44ELISA Kit(abbexa，abx542303，中国),按照说明书的指南进行实验测定Arhgap44蛋白的表达。

(5)统计学分析：采用SPSS 18.0统计学软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示，随机区组设计的计量资料比较采用单因素方差分析，重复测量设计的计量资料比较采用重复测量设计的方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

二、实验结果

(1)瑞芬太尼输注加剧了术后机械和热痛觉过敏

与生理盐水(NS)组输注相比，瑞芬太尼+切口痛(RI)组以1μg·kg

(2)Arhgap44可以抑制瑞芬太尼输注后切口痛觉敏感

促进Arhgap44表达可以明显的降低瑞芬太尼切口痛诱发的机械痛觉过敏(图1A，缩足频率表征机械痛觉)和热痛觉过敏(图1B，缩足潜伏期表征热痛觉)，提示促进Arhgap44表达的潜在镇痛特性。

(3)瑞芬太尼输注和切口降低了背根神经节Arhgap44的表达

在瑞芬太尼和切口疼痛模型后48h，处死小鼠去背根神经节，在ELISA结果发现Arhgap44蛋白表达明显降低(P<0.001，图2)。以上结果表明，瑞芬太尼输注后的痛觉过敏与背根神经节中Arhgap44表达降低有关。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。