基于桃蚜效应因子MpC002基因的dsRNA及其在防治桃蚜中的应用

摘要

本发明属于生物技术领域，涉及桃蚜防控技术领域，具体涉及基于桃蚜效应因子MpC002基因的dsRNA及其在防治桃蚜中的应用。本发明公开了一种基于桃蚜效应因子MpC002基因的dsRNA，通过RNA干扰技术可显著降低桃蚜MpC002基因的表达量，显著提高桃蚜的死亡率，显著降低桃蚜的繁殖力，在影响桃蚜与寄主的亲和性，特别是在取食后的定殖存活和繁殖方面具有重要作用。同时，将应用桃蚜效应因子MpC002基因片段合成的dsRNA用于防治蚜虫具有物种特异性、安全性和高效性等优势，在蚜虫绿色防控中具有良好的市场应用前景和潜在的经济、生态效益，可为蚜虫绿色防控提供一项新的防治途径。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及桃蚜防控技术领域，具体涉及基于桃蚜效应因子MpC002基因的dsRNA及其在防治桃蚜中的应用。

背景技术

桃蚜【Myzus persicae(Sulzer)】属半翅目(Hemiptera)、蚜科(Aphididae)，是一种广食性世界危险性害虫，寄主植物近300种，不仅能直接刺吸梨、桃、李、梅、樱桃等蔷薇科果树和辣椒、白菜、甘蓝、萝卜等多种蔬菜，还是黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)和烟草蚀纹病毒(TEV)等116种世界危险性病毒的传播媒介，传毒危害损失更为严重。由于桃蚜生活周期短、繁殖量大、成灾频繁，因此防治难度大。目前，果蔬生产中主要依赖药剂防治桃蚜的发生危害，但大量高频率不合理用药所带来的农产品安全、害虫抗药性、产地生态环境安全等问题非常突出，严重制约了果蔬产业的健康持续发展。因此，寻求绿色高效的桃蚜防控途径已成为果蔬产业发展中亟需解决的重大难题。

植物介导的RNAi技术(RNAinterference，RNAi)已成为农作物抗虫基因工程的热点之一。RNAi技术是将与目的基因同源的dsRNA(double-strand RNA)导入活体生物体内引起基因沉默的现象。相比于其他基因工程研究方法，具有特异性、安全性和高效性等优势，被广泛地应用于生物学中特定基因功能的研究。近年来，利用dsRNA体外饲喂或注射来筛选RNA靶标基因，导致靶标基因表达和沉默，已经广泛应用于昆虫生长发育关键基因的鉴定和功能分析。

效应因子MpC002是桃蚜唾液蛋白中鉴定出的最具特征性的蛋白，是一种能够帮助其操控寄主细胞并提高自身侵染能力，继而顺利完成定殖的重要因子，在桃蚜和寄主的亲和性中发挥着重要作用。而且MpC002基因只有在桃蚜以植物为食时才发挥作用，具有明显的物种特异性。因此，深度挖掘具有调控桃蚜取食危害的效应因子MpC002的基因功能，可为桃蚜效应因子MpC002基因片段合成的dsRNA在防治蚜虫中的广泛应用提供重要的科学依据。然而，目前尚未有有效的RNAi技术体系构建出可有效防治蚜虫的dsRNA。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于桃蚜效应因子MpC002基因的dsRNA，通过RNA干扰技术抑制桃蚜效应因子MpC002基因表达，显著提高桃蚜的死亡率，显著降低桃蚜的繁殖力及其与寄主的亲和性。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供了一种基于桃蚜效应因子MpC002基因的dsRNA，所述dsRNA具有如SEQID NO.5所示的核苷酸序列。

本发明还提供了所述dsRNA的编码基因。

本发明还提供了含所述dsRNA或其编码基因的重组表达载体、转基因细胞系、重组菌、表达盒。

优选地，所述dsRNA的合成引物具有如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

优选地，所述桃蚜的寄主为辣椒。比如感蚜参照辣椒品种DYJ【大羊角椒(DYJ)(S)】。

本发明还提供了所述的dsRNA或其编码基因在制备防治桃蚜的产品中的应用。

优选地，所述产品的用途包括抑制桃蚜MpC002基因的表达，促进桃蚜死亡，显著降低桃蚜的繁殖力及其与寄主的亲和性。

本发明以桃蚜效应因子MpC002基因为靶标，建立出一种桃蚜效应因子MpC002基因的最佳沉默技术体系，设计出一种基于桃蚜效应因子MpC002基因的dsRNA，通过饲喂的方法将其导入桃蚜体内，观察分析沉默MpC002基因后取食抗感辣椒品种后的桃蚜MpC002基因表达量、死亡率、单雌产仔量、MpC002基因表达量和基于死亡率和单雌产仔数的桃蚜与辣椒的亲和性，发现本发明的dsRNA可以显著抑制桃蚜MpC002基因的表达，显著提高桃蚜取食抗、感参照辣椒品种后的死亡率，并显著降低桃蚜的繁殖力及其与寄主的亲和性，提示桃蚜效应因子MpC002的dsRNA可应用于桃蚜防治中。

优选地，所述产品的类型包括但不限于药剂、化肥等。

本发明还提供了一种用于防治桃蚜的产品，所述产品的活性成分为所述的dsRNA或其编码基因，所述防治包括抑制桃蚜MpC002基因的表达，促进桃蚜死亡，降低桃蚜的繁殖力及其与寄主的亲和性。

本发明还提供了一种控制桃蚜危害植物的方法，具体为：先将所述的dsRNA制成溶液，然后将其喷施于植物叶片上，从而达到控制桃蚜危害的目的。

优选地，所述dsRNA的喷施浓度为500ng/μL。

优选地，所述植物包括辣椒。比如感蚜参照辣椒品种DYJ【大羊角椒(DYJ)(S)】。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明公开了一种基于桃蚜效应因子MpC002基因的dsRNA，通过RNA干扰技术可显著降低桃蚜MpC002基因的表达量，显著提高桃蚜的死亡率，显著降低桃蚜的繁殖力，在影响桃蚜与寄主的亲和性，特别是在取食后的定殖存活和繁殖方面具有重要作用。同时，将应用桃蚜效应因子MpC002基因片段合成的dsRNA用于防治蚜虫具有物种特异性、安全性和高效性等优势，在蚜虫绿色防控中具有良好的市场应用前景和潜在的经济、生态效益，可为蚜虫绿色防控提供一项新的防治途径。

附图说明

图1为桃蚜MpC002基因的PCR扩增电泳图(泳道M为Trans2K DNA marker；泳道1为桃蚜MpC002基因)；

图2为取食经不同浓度dsRNA处理的辣椒叶片后的桃蚜MpC002相对表达量；

图3为取食经不同浓度dsRNA处理的辣椒叶片后的桃蚜死亡率；

图4为沉默MpC002后取食抗感辣椒品种叶片的桃蚜MpC002表达量；

图5为沉默MpC002后取食抗感辣椒品种叶片的桃蚜死亡率；

图6为沉默MpC002后取食抗感辣椒品种叶片的桃蚜单雌产仔量。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。

实施例1桃蚜效应因子MpC002基因克隆

(1)提取桃蚜总RNA

1)选取室内用经抗蚜性鉴选获得的感蚜参照辣椒品种DYJ【大羊角椒(DYJ)(S)】继代饲养且发育历期和大小一致的桃蚜雌成虫30头于RNase-Free的离心管中，加入1mL的TRIzol，用研磨棒快速研磨，立即涡旋剧烈震荡混匀，室温静置5min；

2)离心(4℃，12000×g)10min，取上清至一新的EP管中；

3)加0.2mL的氯仿，震荡15s，15-30℃静置3min；离心(4℃，12000×g)15min；

4)取无色相至一新的EP管中，加入等体积的异丙醇颠倒混匀，15-30℃静置10min；

5)离心(4℃，12000×g)10min，并吸除上清后加1mL冰预冷的75％乙醇，轻轻摇匀后静置20min；

6)离心(4℃，7500×g)5min，并吸除上清后在室温下晾干，然后加入30-50μLddH

(2)设计桃蚜效应因子MpC002基因引物

根据NCBI(登录号：XP_022166597.1)发布的桃蚜效应因子MpC002基因序列，利用Primer 5.0软件设计用于扩增桃蚜效应因子MpC002的引物：

MpC002-F：GGAGGATCCATGAAGGTTCAGACTTCCG(SEQ ID NO.1)；

MpC002-R：GGAACTAGTTTATTAAAAATGTCTAAAGAAACG(SEQ ID NO.2)。

(3)反转录合成cDNA

参照TaKaRa公司的PrimeScript

温育后向上述反应体系中加入以下各组分：5×Primerscript buffer 5μL,RNA酶抑制剂RI 0.5μL,Primerscript RTase(反转录酶)1μL,RNase-Free ddH

(4)扩增桃蚜效应因子MpC002基因

PCR反应体系(20μL)为：cDNA 2μL,MpC002-F 1μL,MpC002-R 1μL,PCR mix master10μL,ddH

(5)确证克隆获得桃蚜效应因子MpC002基因

将获得的PCR产物经过琼脂糖凝胶回收，然后连接到pGEM-18T载体上，并转化大肠杆菌DH5α，经酶切和PCR鉴定为阳性克隆后测序，然后采用DNAMAN Version 4.0软件与美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的不同昆虫的效应因子基因的全长氨基酸序列进行比对，确证克隆获得桃蚜效应因子MpC002基因。桃蚜MpC002基因的PCR扩增电泳结果如图1所示，说明成功扩增得到桃蚜MpC002基因。

实施例2桃蚜效应因子MpC002基因的沉默效果分析

(1)dsRNA的合成

1)设计合成桃蚜效应因子dsRNA的引物

根据桃蚜效应因子MpC002基因序列，利用引物设计网站E-RNAi(https://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/idseq.php)设计用于合成dsRNA且携带T7启动子的引物：

dsMpC002-F：taatacgactcactatagggGTGCACCAGGAAAAGTATGT(小写字母为T7启动子，SEQ ID NO.3)；

dsMpC002-R：taatacgactcactatagggGACGTTGTCCTCTCCAATTA(小写字母为T7启动子，SEQ ID NO.4)。

2)合成dsRNA

采用MEGAscript RNAi Kit(Thermo Scientific,Wilmington,DE,USA)。根据试剂盒的说明书操作流程(https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/references/protocols/rnai-epigenetics-and-gene-regulation/rnai-protocol/megascript-rnai-kit.html)合成得到dsRNA。dsRNA的序列如下所示：

MpC002 dsRNA序列(SEQ ID NO.5)：

ACGATGATGAGGGAGGAGTGAACGATAATCAGGGAGAAGAGAACGATAATCAGGGAGAAGAGAACGATAATCAGGGAGAAGAGAACGATAATCAGGGAGAAGAGAAGGAAGAAGTTTCCGAACCAGAGATGGAGCACCATCAGTGCGAAGAATACAAATCGAAGATCTGGAACGATGCATTTAGCAACCCGAAGGCTATGAACCTGATGAAACTGACGTTTAATACAGCTAAGGAATTGGGCTCCAACGAAGTGTGCTCGGACACGACCCGGGCCTTATTTAACTTCGTCGATGTGATGGCCACCAGCCCGTACGCCCACTTCTCGCTAGGTATGTTTAACAAGATGGTGGCGTTTATTTTGAGGGAGGTGGACACGACATCGGACAAATTTAAAGAGACGAAGCAGGTGGTCG。

(2)基于qPCR的桃蚜效应因子MpC002基因表达分析

1)设计桃蚜效应因子MpC002基因的qPCR引物

根据桃蚜效应因子MpC002的基因序列，利用Primer 5.0软件设计用于qPCR的引物和内参基因Actin引物：

Actin-qF:5’-TGGTATCGTCTTGGATTCTG-3’(SEQ ID NO.6)；

Actin-qR:5’-TTAGGTAGTCGGTGAGATCA-3’(SEQ ID NO.7)；

MpC002-qF：GGAGGATCCATGAAGGTTCAGACTTCCG(SEQ ID NO.8)；

MpC002-qR：GACGTTGTCCTCTCCAATTA(SEQ ID NO.9)。

2)反转录合成cDNA

具体方法同实施例1的步骤(3)，反转录合成得到桃蚜效应因子MpC002的cDNA。

3)桃蚜效应因子MpC002基因表达量的qPCR测定分析

利用nuclease-free水将cDNA样品稀释5倍，以桃蚜的Actin基因作为内参，qPCR的反应体系20μL为：2×SYBR Premix E×TaqTM 10μL，上下游引物各0.5μL(10μmol/L),cDNA2μL，ddH

(3)确定桃蚜效应因子MpC002基因dsRNA的最佳基因沉默饲喂浓度

将发育历期和大小一致的桃蚜雌成虫转移到饲蚜器中，设置100ng/μL、200ng/μL、300ng/μL、500ng/μL、1000ng/μL五个MpC002基因的dsRNA处理浓度，以相同浓度的绿色荧光蛋白(GFP)的dsRNA和清水为对照，喷施移栽30天的感蚜参照辣椒品种DYJ(DYJ(S))植株直至叶片完全湿润，用经dsRNA喷施处理过的辣椒叶片饲喂桃蚜1d、2d、4d、6d、8d，分别观察统计桃蚜的活虫数，并收集活虫用于桃蚜的总RNA提取，随后按照步骤(2)的方法进行桃蚜效应因子MpC002基因表达量的qPCR测定分析。饲喂过程中每张叶片30头桃蚜，每个浓度及每个处理时间均设置3个重复。

(4)试验结果

根据经MpC002基因和GFP的dsRNA处理后的桃蚜MpC002基因相对表达量(图2)及死亡率(图3)，确定500-1000ng/μL对桃蚜效应因子MpC002基因的沉默效率最好。由于500ng/μL和1000ng/μL对桃蚜效应因子MpC002基因的沉默效率无显著差异，故综合考虑成本和效果，确定500ng/μL桃蚜效应因子MpC002基因dsRNA为最佳基因沉默饲喂浓度。

实施列3效应因子MpC002基因在防治桃蚜中的作用

选用经抗蚜性鉴选获得且移栽30天的抗蚜参照辣椒品种ZDC【猪大肠(ZDC)(R)】和感蚜参照辣椒品种DYJ【大羊角椒(DYJ)(S)】，将发育历期和大小一致的桃蚜雌成虫接种到喷施500ng/μL MpC002基因dsRNA的ZDC和DYJ植株叶片上，分别于接虫后1d、2d、4d、6d、8d观察统计桃蚜活虫数、单雌产仔数，并收集活虫用于桃蚜的总RNA提取，随后进行桃蚜效应因子MpC002基因表达量的qPCR测定分析及基于死亡率和单雌产仔数的亲和性分析(桃蚜死亡率越高及单雌产仔数越低，与辣椒的亲和性越低)。每株接虫6张叶片，每叶片接虫30头，每个处理均设置3个重复，qPCR测定分析方法与实施例2相同。

最后发现，通过RNA干扰技术可以显著抑制桃蚜MpC002基因的表达(图4)，显著提高桃蚜取食抗、感参照辣椒品种后的死亡率(图5)，显著降低桃蚜的繁殖力(图6)，最终显著降低桃蚜与辣椒的亲和性(图5，图6)，为桃蚜效应因子MpC002基因的dsRNA在桃蚜防治中的广泛应用提供了重要的科学依据。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院三亚研究院

<120> 基于桃蚜效应因子MpC002基因的dsRNA及其在防治桃蚜中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA/RNA

<213> MpC002-F(Artificial Sequence)

<400> 1

ggaggatcca tgaaggttca gacttccg 28

<210> 2

<211> 33

<212> DNA/RNA

<213> MpC002-R(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaactagtt tattaaaaat gtctaaagaa acg 33

<210> 3

<211> 40

<212> DNA/RNA

<213> dsMpC002-F(Artificial Sequence)

<400> 3

taatacgact cactataggg gtgcaccagg aaaagtatgt 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA/RNA

<213> dsMpC002-R(Artificial Sequence)

<400> 4

taatacgact cactataggg gacgttgtcc tctccaatta 40

<210> 5

<211> 414

<212> DNA/RNA

<213> MpC002 dsRNA(Artificial Sequence)

<400> 5

acgatgatga gggaggagtg aacgataatc agggagaaga gaacgataat cagggagaag 60

agaacgataa tcagggagaa gagaacgata atcagggaga agagaaggaa gaagtttccg 120

aaccagagat ggagcaccat cagtgcgaag aatacaaatc gaagatctgg aacgatgcat 180

ttagcaaccc gaaggctatg aacctgatga aactgacgtt taatacagct aaggaattgg 240

gctccaacga agtgtgctcg gacacgaccc gggccttatt taacttcgtc gatgtgatgg 300

ccaccagccc gtacgcccac ttctcgctag gtatgtttaa caagatggtg gcgtttattt 360

tgagggaggt ggacacgaca tcggacaaat ttaaagagac gaagcaggtg gtcg 414

<210> 6

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> Actin-qF(Artificial Sequence)

<400> 6

tggtatcgtc ttggattctg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA/RNA

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<400> 7

ttaggtagtc ggtgagatca 20

<210> 8

<211> 28

<212> DNA/RNA

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<400> 8

ggaggatcca tgaaggttca gacttccg 28

<210> 9

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> MpC002-qR(Artificial Sequence)

<400> 9

gacgttgtcc tctccaatta 20