一株娄彻氏链霉菌及其应用

摘要

本发明涉及一株防治果胶杆菌属细菌病害并具有促进植物生长功能的娄彻氏链霉菌及其应用。本发明所提供的娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)26B在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.24171。该菌株分离于受到缺水胁迫的白菜根际土壤，对多种病原细菌和病原真菌具有强烈的抑制作用，对果胶杆菌属细菌病害具有高效防治作用，而且促进植物种子萌发和根系伸长。该菌株发酵培养时间短，生产成本低，比其它菌剂更有优势，利于将其应用于植物病害防治领域，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于农、林和园艺作物植物保护领域，特别涉及一株对果胶杆菌属细菌病害具有强烈抑制作用并具促生功能的链霉菌及其代谢物。

技术背景

果胶杆菌属(Pectobacterium spp.)细菌可侵染多种作物引起软腐病，如胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)对白菜、胡萝卜、魔芋、马铃薯等多种作物均可致病，而且一旦发生，很难控制。白菜软腐病、魔芋软腐病以及马铃薯黑胫病成为制约白菜、魔芋和马铃薯生产的关键病害，一旦发生，轻者减产10％～20％，重者减产50％以上，甚至绝收。在病害流行年份，其发病率高达30％～40％(李林，2018；杨贤莉，2010；王巍，2019；李建军等，2010)。土壤湿度是影响细菌性病害发生与流行的主要因素之一，过量浇水或者多雨造成地面积水、局部空气湿度过大有利于病菌的侵入和传播，最终造成该病害的大规模爆发。

针对细菌性软腐病，目前可使用的生物防治药剂品种很少，农用链霉素的防治效果较差，铜离子制剂容易导致细菌产生抗药性基因簇，生产上多采用梧宁霉素、春雷霉素和中生菌素进行防治。赵辰瑞(2015)报道梧宁霉素和中生菌素对白菜软腐病的田间防效较好，防效分别达到87.26％和79.91％。邓华强(2022)报道，生产上多采用高锰酸钾处理种子，后期喷施喹菌酮可湿性粉剂，或使用春雷霉素等药剂防治马铃薯黑胫病。闫佳会(2020)报道采用6％春雷霉素可湿性粉剂进行种薯拌种(25g制剂/100Kg种薯)，对马铃薯黑胫病的田间防治效果可达到66.88％。梧宁霉素是不吸水链霉菌梧州亚种(Streptomycesahygroscopicus var.wuzhouensis)的发酵代谢产物，主要活性组分为大环内酯类四烯抗生素。中生菌素是由淡紫灰链霉菌海南变种(Streptomyces lavendulaevar.hainanensis)产生的一种N-糖甙类次级代谢产物，属于IV一糖甙类碱竺变霉性物质，通过抑制病原菌的蛋白质合成起抑菌作用。春雷霉素为小金色链霉菌(Streptomycesmicroaureus)产生的代谢产物，为氨基糖苷类抗生素，主要活性成分为[5-氨基-2-甲基-6-(2，3，4，5，6-羟基环己基氧代)四氢吡喃-3-基]氨基-α-亚氨乙酸，主要通过干扰病原菌蛋白质合成抑制病原菌。众所周知，不同放线菌，甚至同种的不同菌株产生的代谢产物和作用机理并不完全相同，对不同种病原细菌的防治效果也会有很大差异，获得防治植物细菌病害的新菌株对丰富生防菌资源具有重要意义。

目前用于细菌性软腐病防治的放线菌资源并不多。代雪凤等(2021)分离到了拮抗魔芋软腐病菌Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum的拮抗放线菌，但仅测定了放线菌对软腐病菌以及离体魔芋块茎的防治作用，未进行放线菌的种属鉴定；李威等(2017)报道娄彻氏链霉菌XL-6发酵液对茄子青枯病菌(Ralstonia solanacearum)有较强的拮抗效果，但未测试其防病效果；何斐等(2015)分离到拮抗放线菌Streptomyces rocheiD74对魔芋软腐病菌Pectobacterium chrysanthemi有较强的拮抗作用，拮抗圈直径为11.0～18.3mm。盆栽试验中D74与病原菌混和处理防效仅为17.0％。Zamanian等(2005)报道了S.rochei对Erwinia carotovora subsp.carotovora的抑制作用，但需要液体培养10-11天时达到最高抑菌活性；Osman等(2011)报道了S.rochei对医学病原菌的抑菌活性；Boortseva等(2019)报道了Streptomyces plicatus对植物病原细菌Clavibatermichiganensis和Xanthomonas campestris的抑菌作用，抑菌圈直径分别为22.7-30.0mm和16.2-30.0mm。目前S.plicatus已经划归为S.rochei(Komaki，2019)，有关S.rochei和S.plicatus对白菜软腐病、马铃薯黑胫病、姜瘟病等病害的防治作用研究未见报道。

发明人于2021年7月从我国北京市海淀区上庄白菜根际土壤中分离到一株链霉菌26B，被鉴定为娄彻氏链霉菌Streptomyces rochei，该菌株对多种病原细菌如白菜软腐病菌Pectobacterium carotovorum subsp.brasiliensis、马铃薯黑胫病菌P.atrosepticum、P.carotovorum subsp.brasiliensis、P.polaris以及尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、茄孢镰刀菌Fusarium solani、疫霉菌Phytophythora capsici、胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides等多种病原真菌具有强烈抑制作用，对白菜软腐病的防病效果达89.8％-96.0％。该菌株除具有防病作用外，还具有促生作用，是一株非常有应用潜力的菌株。

发明内容

本发明的目的是提供一株对果胶杆菌属细菌病害具有防治作用并能促进植物生长的娄彻氏链霉菌及其应用。

本发明所提供的娄彻氏链霉菌具体为娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)26B，该菌株已于2021年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.24171。

本发明还保护活性成分为所述娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)26B的菌剂。

所述菌剂中还可包括吸附载体；所述吸附载体可为硅藻土、草炭、蛭石、稻壳粉、秸秆粉、珍珠岩和碳酸钙中的至少一种。

更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述吸附载体具体由硅藻土和碳酸钙混和物(质量比2∶1)按照体积比1∶1的配比混和而成。

进一步，所述菌剂由所述娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)26B的发酵液，或对发酵液进行离心后所得菌泥与所述吸附载体按照1L∶1Kg至1L∶4Kg(如1L∶1Kg)的配比混和而成。在本发明的一个实施例(实施例5)中，制备所述娄彻氏链霉菌(Streptomycesrochei)26B的发酵液时采用大量发酵培养液，所述娄彻氏链霉菌26B的发酵液中，所述娄彻氏链霉菌26B的活菌数为20～60亿/mL(如40亿/mL)所述发酵液。其中，所述大量发酵培养液的溶剂为水，溶质及浓度如下：黄豆饼粉1.2％、淀粉1.5％、葡萄糖0.8％、蛋白胨0.5％、硫酸铵0.25％、硫酸镁0.03％、磷酸二氢钾0.025％、氯化钠0.04％、碳酸钙0.8％；其中，％表示质量百分含量。相应的，在所制备得到的所述菌剂中，所述娄彻氏链霉菌26B的活菌数为20～60亿/g(如40亿/g)所述菌剂；所述菌剂的含水量在5～8％以内。

所述菌剂的制备方法也属于本发明的保护范围。

所述菌剂的制备方法，具体可包括如下步骤：

(1)培养所述娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)26B，得到所述娄彻氏链霉菌26B的发酵液；在所述发酵液中，所述娄彻氏链霉菌26B的活菌数为20～60亿/mL(如40亿/mL)；

(2)将步骤(1)所得发酵液或离心后的菌泥和所述吸附载体按照1L∶1Kg至1L∶4Kg(如1L∶1Kg)的配比混和，得到所述菌剂。

在步骤(1)中，培养所述娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)26B的培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：黄豆饼粉1.0～1.5％、淀粉1.2～1.5％、葡萄糖0.6～1.0％、蛋白胨0.4～0.6％、硫酸铵0.2～0.3％、硫酸镁0.02～0.03％、磷酸二氢钾0.015～0.03％、氯化钠0.02～0.04％、碳酸钙0.6～1.0％；其中，％表示质量百分含量。

更加具体的，所述培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：黄豆饼粉1.2％、淀粉1.5％、葡萄糖0.8％、蛋白胨0.5％、硫酸铵0.25％、硫酸镁0.03％、磷酸二氢钾0.025％、氯化钠0.04％、碳酸钙0.8％；其中，％表示质量百分含量。

所述娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)26B的发酵液也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种用于植物细菌性病害防治的产品。

所述娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)26B或所述菌剂或所述发酵液在如下(1)或(2)中的应用也属于本发明的保护范围：

(1)防治细菌性病原侵染、细菌和真菌复合侵染、或者细菌和线虫复合侵染引起的植物病害。

(2)制备用于(1)中病害防治的产品。

本发明所提供的娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)26B的CGMCC No.24171具有如下优势：

1、该菌株分离于植物根际，更能适应植物根际环境，而且生长迅速。

2、该菌株分离于受到缺水胁迫的根际土壤，更耐受土壤干旱缺水环境，不仅对病原细菌引起的细菌性软腐病具有高效防治作用，而且在土壤含水量非常低的条件下，防病效果更好，有利于其在不利环境中存活而发挥作用，是一株有潜力的生防菌。

3、该菌株发酵周期短，成本低，容易大规模生产和商品化应用。

本发明所提供的娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)26B CGMCC No.24171是2021年7月发明人从我国北京市海淀区上庄白菜根际土壤分离到的一株对多种病原菌具有拮抗作用的链霉菌。该菌株的特点是：菌株26B在ISP2培养基(酵母提取物4g、麦芽提取物10g、无水葡萄糖4g、琼脂18g、蒸馏水1L，pH 7.3)上，生长初期为白色，产孢后转为鼠灰色，气生菌丝茂盛，菌落向培养基表面隆起，疏松、多孔，表面粗糙、干燥，有褶皱；菌落背面中心为黄褐色，边缘为黄色，菌落周围的培养基上有暗红色色素产生。有大量卵圆形孢子产生、孢子表面光滑。该菌株对多种病原菌细菌和真菌具有强烈抑制作用，促进种子萌发和根系生长，是一株非常有潜力的菌株。经鉴定，该菌株为娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)，定名为26B。该菌株除菌发酵滤液以10％(V/V)与病原细菌混和可完全抑制病原细菌在白菜根部的定殖，无论是在含水量低(14％，W/W)或含水量较高(20％，W/W)的土壤中，防病效果都非常高，分别达到了89.8％和96.0％，高于其他菌株。26B菌株发酵培养时，生长速度快、4d之内可完成发酵，发酵结束后活菌数可达到20～60亿/mL，生产成本低。因此26B是一株非常有潜力的降解菌，从而提出了本发明。

保藏说明

菌种名称：娄彻氏链霉菌

拉丁名：Streptomyces rochei

菌株编号：26B

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2021年12月21日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.24171

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)的分离筛选

(一)娄彻氏链霉菌26B菌株的分离和拮抗作用

(1)娄彻氏链霉菌26B菌株的分离、筛选

本发明的娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)26B是从施用芽胞杆菌并经缺水胁迫的白菜根际土壤，经稀释涂布后分离获得的，具体如下：

从北京市海淀区上庄，多点取样法，从施用芽胞杆菌B006菌剂并受到缺水胁迫的白菜根际收集根际土，每处理2-3g。采用稀释涂布法，进行放线菌的分离。在ISP2培养基和高氏一号培养基中加入终浓度分别为20mg/L和50mg/L的萘啶酮酸和放线菌酮，抑制细菌和真菌的生长。28℃、培养7～14d后，挑取菌落形态不同的放线菌进行划线纯化，纯菌株保存于30％甘油管中，-80℃冻存。然后采用牛津杯法测定不同放线菌发酵液的抑菌活性。挑取活化后的放线菌单菌落，转接到100mL发酵培养基中，28℃、180r/min振荡培养5d。发酵液在4℃、5000r/min离心10min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，获得除菌发酵滤液。将500μL(1×10

其中，所述ISP2培养基组分及配比为：酵母提取物4g、麦芽提取物10g、无水葡萄糖4g、琼脂18g、蒸馏水1L，pH 7.3。高氏一号培养基组分及配比为：可溶性淀粉20.0g、KNO

经划线分离后，得到38株放线菌。采用牛津杯法测定分离菌株除菌发酵滤液对软腐病菌的拮抗活性，获得放线菌26B，其抑菌效果最好，抑菌圈直径为22.44±0.22mm。

(2)链霉菌26B不同培养时间发酵滤液对多种病原细菌的抑制作用

将链霉菌26B菌体接种于50mL ISP2种子培养液(酵母提取物4g、麦芽提取物10g、无水葡萄糖4g、蒸馏水1L，pH 7.3)中，28℃、180r/min振荡培养18h；然后按2％(V/V)的接种量将种子液转接到100mL发酵培养基(黄豆饼粉1.2％、淀粉1.5％、葡萄糖8.0g、蛋白胨5.0g、硫酸铵2.5g、硫酸镁0.3g、磷酸二氢钾0.25g、氯化钠0.4g、碳酸钙8.0g、蒸馏水1L，pH7.3)中，继续振荡培养。分别于培养3、4、5、6d时，从每处理摇瓶中吸取50mL发酵液，4℃、5000r/min离心10min。保留上清液，用于抑菌活性和发酵液pH的测定。

牛津杯法测定26B菌株不同时间发酵滤液对4种病原细菌的抑菌活性，结果(表1)表明：培养4d的链霉菌26B发酵液的抑菌作用比3d时高，对白菜软腐病菌Pectobacteriumcarotovorum subsp.brasiliensis、马铃薯黑胫病菌P.atrosepticum、P.carotovorumsubsp.brasiliensis、P.polaris和姜瘟病菌Pectobacterium sp.的抑菌圈直径分别为23.34mm、17.80mm、16.83mm、22.37mm和14.25mm，培养5d和6d的发酵液的抑菌作用与4d时差异不显著(表1)。对菌株26B发酵液的pH测定结果表明，发酵液的初始pH为7.42±0.01，培养3～6d时发酵滤液pH基本在6.84±0.05，说明菌株26B发酵液的抑菌活性不是由pH值改变引起的。从工业生产角度考虑，发酵培养4d可作为其发酵终点。

表1 不同培养时间的链霉菌26B发酵除菌滤液对植物病原细菌的抑制作用

注：同行数据后面的不同字母表示差异显著(p＜0.05)。

(3)链霉菌26B发酵滤液对多种病原真菌的抑制作用

按照实施例2中方法制备链霉菌26B培养4d的发酵液。在马铃薯葡萄糖培养基(去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g，蒸馏水1L)平板上接种5mm待测的病原真菌的菌丝块，26℃培养3天后，在PDA平板的四个角距真菌菌落2cm放置牛津杯，加入200μL发酵除菌滤液，每处理5重复，26℃培养3-4天后，测量抑菌圈直径(mm)。测量结果表明(表2)，培养4d的链霉菌26B发酵除菌滤液对四种病原真菌都有较好的抑制作用，其中对黄瓜枯萎病菌、菜豆根腐病菌、辣椒疫霉菌抑制作用较高，对胶孢炭疽菌的抑制作用较弱。

表2 不同培养时间的链霉菌26B发酵除菌滤液对植物病原真菌的抑制作用

(二)链霉菌26B菌株的鉴定

提取菌株26B的基因组DNA，用通用引物27F和1492R扩增16S rDNA序列，并进行测序。

27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；1492R：5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACGACT T-3′。菌株26B的16S rDNA的序列已经提交GenBank，登录号为OM214460。鉴于上述分子生物学特性鉴定结果，将步骤一分离并纯化得到的菌株26B鉴定为娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)。该娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)已于2021年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.24171。

实施例2、链霉菌26B发酵滤液抑制软腐病菌在白菜根部的定殖

白菜种子萌芽准备：挑选籽粒饱满的白菜种子在3％NaClO溶液中消毒1min，用无菌水冲洗3次后，灭菌滤纸上晾干。然后将消毒后的白菜种子转移到铺有灭菌滤纸的培养皿中，置于25℃的培养箱中培养，待幼苗胚根长到2.5cm时，挑取长势一致的白菜幼苗进行试验。

试验设3个处理，T1：白菜幼苗根部用20mL带有卡那霉素抗性和绿色荧光标记的软腐病菌Pcb

对白菜根内软腐病菌Pcb

实施例3、链霉菌26B发酵滤液对白菜的促生作用

挑选籽粒饱满的白菜种子在3％NaClO溶液中消毒1min，用无菌水冲洗3次后，灭菌滤纸上晾干，备用。将白菜种子放入50mL稀释10倍的链霉菌26B除菌发酵滤液中浸泡3h，浸泡完成后自然风干，置于铺有3层无菌湿润滤纸的培养皿中，每个培养皿中均匀摆入30粒种子，6次重复，以等量的无菌水处理为对照。所有培养皿置于25℃的培养箱中培养，3d后统计发芽率、发芽势和发芽指数，4d后在每个平板中随机选20株萌发的白菜幼苗，测其胚根长和鲜重。

结果表明(表3)：与正常生长白菜相比，经稀释10倍的链霉菌26B除菌发酵滤液浸种后白菜种子的发芽势、发芽指数、根长及鲜重显著高于对照组(p＜0.05)，说明菌株26B发酵滤液对白菜种子萌发和根系伸长有促进作用。

表3 稀释10倍的菌株26B发酵滤液对白菜种子萌发的影响

注：同列数字后面的不同字母表示差异显著(p＜0.05)。

实施例4：娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)26B菌剂的制备

1、将实施例1获得的娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)26B CGMCC No.24171的菌苔移植到ISP2培养液中，28～30℃摇床振荡培养18h得到种子液。

其中，ISP2培养液的配方为：酵母提取物4g、麦芽提取物10g、无水葡萄糖4g、蒸馏水1L，pH 7.3。

2、按5％比例(体积比)将步骤1获得的种子液接种到大量培养发酵培养液中，培养温度28～30℃，转速150～180转/分，初始pH 7.0～7.2，培养时间4d。发酵完成后得到发酵液，发酵液中娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)26B CGMCC No.24171的活菌数可达30亿/mL。

其中，大量发酵培养液配方为：黄豆饼粉1.2％、淀粉1.5％、葡萄糖0.8％、蛋白胨0.5％、硫酸铵0.25％、硫酸镁0.03％、磷酸二氢钾0.025％、氯化钠0.04％、碳酸钙0.8％，pH7.2。

3、将步骤2获得的娄彻氏链霉菌发酵液经离心获得的菌泥与吸附载体——硅藻土和碳酸钙(质量比2∶1)按照体积质量比为1∶1(即1L∶1Kg)的比例混和均匀，即得菌剂。所述离心转速为10000转/分，离心时间为20分钟；所述的菌剂中娄彻氏链霉菌(Streptomycesrochei)26B CGMCC No.24171的活菌数可达60亿/g，含水量在5％以内。

实施例5、链霉菌26B发酵液对不同含水量土壤中白菜软腐病的防病作用

将白菜种子均匀播种于盛有湿润灭菌土壤的花盆中，置于25℃人工气候箱中培养。每个花盆播种5株苗，待其3片真叶展开后，采用浇灌法接种白菜软腐病菌Pcb和26B发酵滤液。设置T1-1、T1-2、CK1的土壤含水量为14％，T2-1、T2-2、CK2的土壤含水量为20％。T1-1、T2-1为接种病原菌处理，每盆浇灌10mL Pcb菌悬液，Pcb菌悬液浓度为5×10

试验结果表明：链霉菌26B除菌发酵滤液明显抑制白菜软腐病的发生(表4)。与土壤含水量为20％的T2-1相比，土壤含水量为14％的T1-1处理中白菜软腐病的发病率和病情指数显著降低，其相对防效为87.0％；在此基础上，加入26B除菌发酵滤液的处理T1-2中白菜软腐病发病率和病情指数更低，相对防效达到96.0％。该结果说明白菜软腐病的发病程度受土壤水分的影响，在较低的土壤含水量下施用链霉菌26B发酵滤液可进一步降低白菜幼苗的发病率和病情指数。

表4 不同含水量土壤中链霉菌26B发酵滤液对白菜软腐病的防病效果

注：同列数字后面的不同字母表示差异显著(p＜0.05)；*代表空白对照中未接种软腐病菌，不发病，因而不进行病害数据调查。