一种用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架及其制备方法和应用

摘要

本发明提供一种用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架及其制备方法和应用。所述水凝胶支架由丙烯酸类聚合物、聚乙烯醇和聚乙二醇交联形成。本发明旨在开发基于水凝胶的体外长时3D培养神经元细胞的支架，可以培养原代神经元细胞，分化体外三维神经网络，构建癫痫等脑疾病模型，用于神经环路功能的精准解析及神经精神疾病的机制研究。

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种水凝胶支架及其制备方法和应用，特别涉及一种用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架及其制备方法和应用。

背景技术

传统的细胞培养通常是二维的，比如采用培养皿、组织培养瓶和微孔板，细胞通常只在和支持物接触面形成单层，对环境的刺激等相互作用仅发生在细胞边缘。二维的培养模式中，只有50％的细胞表面可以与培养基接触，细胞倾向于沿支持物表面平展，相对较早的发生形态变化，这有可能诱导细胞的生化功能的改变。

在神经障碍、损伤及毒性和药物功效方面的研究中，对中枢神经系统的体外模型有很高的要求。能高度模拟出体内微环境的三维体外模型可以弥合传统的二维培养和动物模型的差距。水凝胶因其极为亲水的三维网络结构以及良好的生物相容性和适宜的机械强度受到广大研究者们的亲睐，被广泛应用于细胞三维培养支架的研发中。现有研究中有采用壳聚糖、海藻酸纳、透明质酸等天然水凝胶材料制备的水凝胶支架用于体外三维培养肿瘤细胞作为筛药模型。也有研究者通过应用海藻酸钠和壳聚糖作为3D打印墨水，利用生物3D打印制造细胞体外培养的三维支架，培育PC12细胞。

CN104548208A公开了一种负载细胞三维支架的制备方法，其特征在于，是将自体细胞与高温间歇灭菌的水凝胶溶液混合均匀得到混合液，喷射到交联剂溶液中，静置，然后去除交联剂溶液，漂洗后得到负载细胞微球体；将负载细胞微球体与基质材料混合得到细胞共混物；采用生物打印机将细胞共混物挤出在载有灭菌玻璃底板的三维微动平台上，层层叠加，形成负载细胞三维支架。本发明通过减轻细胞打印过程对细胞活性及生物活性造成的损害，保证高活性的细胞打印。

CN110055221A公开了一种基于细胞三维打印技术的类脑疾病治疗组织模型及其制备方法与应用。制备方法包括如下步骤：将从大脑病变影响部位提取的原代神经细胞与水凝胶材料及交联剂混合得到打印生物墨水；基于天然大脑皮层层状结构和弹性模量的力学特征，将打印生物墨水采用生物三维打印技术进行打印成型，然后进行组织培养，即得基于细胞三维打印技术的类脑疾病治疗组织模型。

CN108888803A公开了一种生物支架及其水凝胶体系。所述水凝胶体系包括：第一凝胶、第二凝胶以及纳米骨替代材料或纳米神经替代材料，所述第一凝胶由聚乙烯醇和水形成，所述第二凝胶由光引发剂、光交联剂和水形成。所述生物支架由所述水凝胶体系形成。本申请还提供了所述生物支架的制备方法和用途，并且该生物支架能够为骨细胞和神经细胞提供良好的生长环境，可用于骨修复或神经修复。

CN109054049A公开了一种PEG类温敏水凝胶三维细胞支架及其制备方法和应用，所述三维细胞支架的制备方法，包括：将含有寡聚乙二醇(PEG)侧链的丙烯酸酯类水溶性大分子聚合单体、引发剂、表面活性剂、交联剂和/或共聚单体混合，反应得到PEG类温敏性纳米凝胶；与细胞在常温下均匀混合，通过热诱导原位包埋细胞，形成PEG类温敏水凝胶三维细胞支架，是一种较理想的组织工程材料，可应用于细胞体外培养等领域。

目前，研究者们已开发了很多适用于细胞体外三维培养的支架，应用于组织工程或肿瘤模型中。然而，受限于神经组织的复杂性，较难实现原代神经元细胞体外长时三维培养，制造工艺复杂，成本较高。因此，发展同时适用于神经细胞生长、三维网络构建、微观结构观测和特定功能调控的神经支架仍然极具挑战。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架及其制备方法和应用。本发明旨在开发基于水凝胶的体外长时3D培养神经元细胞的支架，可以培养原代神经元细胞，分化体外三维神经网络，构建癫痫等脑疾病模型，用于神经环路功能的精准解析及神经精神疾病的机制研究。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架，所述水凝胶支架由丙烯酸类聚合物、聚乙烯醇和聚乙二醇交联形成。

在本发明中，多孔水凝胶支架可由丙烯酸类聚合物作为基础骨架，再加入聚乙烯醇可与丙烯酸类聚合物酯化交联形成网络，聚乙二醇的引入一方面可以进一步强化水凝胶的交联网络，另一面可以提高生物相容性，且聚乙二醇还作为致孔剂，热处理过程中未完全交联的聚乙二醇在溶胀的过程中会溶于水中而致孔。

本发明专利主要是设计一种有效的用于体外原代神经元细胞三维培养的新型水凝胶支架，旨在基于水凝胶材料制造一种三维多孔支架，模拟创建一个相似于体内生理情况的体外微环境，可以适用于神经细胞生长及体外三维神经网络构建，从而作为一种简化模型，供研究者们用于神经环路功能的精准和定量化解析，全面探索对脑的认知和脑疾病的治疗。

在本发明中，所述水凝胶支架的制备原料按质量百分含量计包括：丙烯酸类聚合物20-80％、聚乙烯醇0.5％-79.5％和聚乙二醇0.5％-79.5％。

以所述水凝胶支架的制备原料质量为100％计，所述丙烯酸类聚合物的含量为20-80％，例如可以是20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％等。

以所述水凝胶支架的制备原料质量为100％计，所述聚乙烯醇的含量为0.5％-79.5％，例如可以是0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、79.5％等。

以所述水凝胶支架的制备原料质量为100％计，所述聚乙二醇的含量为0.5％-79.5％，例如可以是0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、79.5％等。

优选地，所述水凝胶支架的制备原料按质量百分含量计包括：丙烯酸类聚合物30-50％、聚乙烯醇20-40％和聚乙二醇20-40％。

优选地，所述丙烯酸类聚合物选自聚丙烯酸和/或聚丙烯酸的衍生物。

优选地，所述聚丙烯酸的衍生物选自卡波姆、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺或聚丙烯腈中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述丙烯酸类聚合物的数均分子量为40-50万，例如可以是40万、41万、42万、43万、44万、45万、46万、47万、48万、49万、50万等。

优选地，所述聚乙烯醇的数均分子量为8-10万，例如可以是8万、8.2万、8.4万、8.6万、8.8万、9万、9.2万、9.4万、9.6万、9.8万、10万等。

优选地，所述聚乙二醇的数均分子量为3000-5000，例如可以是3000、3200、3400、3600、3800、4000、4200、4400、4600、4800、5000等。

优选地，所述水凝胶支架在水中的溶胀率为500-3000％，例如可以是500％、600％、800％、1000％、1200％、1400％、1600％、1800％、2000％、2200％、2400％、2600％、2800％、3000％等。

优选地，所述水凝胶支架的最大吸水率为1500-4000％，例如可以是1500％、1600％、1800％、2000％、2200％、2400％、2600％、2800％、3000％、3200％、3400％、3600％、3800％、4000％等。

优选地，所述水凝胶支架的孔隙率为70-95％，例如可以是70％、75％、80％、85％、90％、95％等。

优选地，所述水凝胶支架的杨氏模量为0.3-20kPa，例如可以是0.3kPa、2kPa、4kPa、6kPa、8kPa、10kPa、12kPa、14kPa、16kPa、18kPa、20kPa等。

第二方面，本发明提供一种第一方面述用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将丙烯酸类聚合物、聚乙烯醇和聚乙二醇混合，进行压片，得到片剂；

(2)将步骤(1)得到的片剂进行热处理；

(3)将步骤(2)热处理后的片剂进行溶胀处理，得到所述用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架。

本发明中，用于原代神经元细胞体外长时培养的多孔水凝胶支架的制备包括压片处理，热处理，溶胀(如图1所示)；该制备工艺简单，成本低廉，且可以体外长时三维培养原代神经元细胞，分化形成神经网络，可以体外运用光遗传学实现细胞功能的研究，并实现癫痫等脑疾病的体外模型构建。

优选地，步骤(1)中，所述压片具体为：将粉末状的丙烯酸类聚合物、聚乙烯醇和聚乙二醇置于模具中，采用压片机进行压片。

优选地，所述压片中，单次片剂的混合粉末的总质量为250-300mg，例如可以是250mg、260mg、270mg、280mg、290mg、300mg等。

优选地，所述压片采用的模具直径为5-20mm，例如可以是5mm、6mm、8mm、10mm、12mm、14mm、15mm、16mm、18mm、20mm等。

优选地，所述压片的压力为1-4tons，例如可以是1tons、1.5tons、2tons、2.5tons、3tons、3.5tons、4tons等，所述压片的时间为20-40s，例如可以是20s、25s、30s、35s、40s等。

优选地，步骤(2)中，所述热处理具体为：将步骤(1)得到的片剂置于烘箱中进行加热。

优选地，所述热处理的温度为120-140℃，例如可以是120℃、125℃、130℃、135℃、140℃等，所述热处理的时间为20-60min，例如可以是20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min等。

优选地，步骤(3)中，所述溶胀处理具体为：先将热处理后的片剂置于水中，于60-85℃(例如可以是60℃、65℃、70℃、72℃、74℃、76℃、78℃、80℃、82℃、85℃等)下溶胀1-4h(例如可以是1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h等)，再降温至25-40℃(例如可以是25℃、30℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等)溶胀24-48h(例如可以是24h、26h、28h、30h、35h、40h、45h、48h等)；最后取出片剂置于PBS缓冲液中，于20-40℃(例如可以是20℃、25℃、30℃、35℃、40℃等)下浸润60-80h(例如可以是60h、65h、70h、75h、80h等)。

优选地，步骤(3)后还需进行步骤(4)：将溶胀处理得到的水凝胶支架进行灭菌处理。

优选地，步骤(4)中，所述灭菌处理具体为：将水凝胶支架置于PBS缓冲液中，于0.05-0.2MPa(例如可以是0.05MPa、0.06MPa、0.08MPa、0.1MPa、0.15MPa、0.2MPa等)的高压、110-130℃(例如可以是110℃、115℃、120℃、125℃、130℃等)的高温下进行灭菌处理10-30min(例如可以是10min、15min、20min、25min、30min等)。

第三方面，本发明提供一种如第一方面所述用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架在体外细胞三维培养或构建癫痫疾病的体外模型中的应用。

本发明提供的水凝胶支架的应用不仅仅用于培养原代神经元细胞，还可应用于其他细胞系的体外三维培养，构建其他的体外疾病模型或筛药模型。

第四方面，本发明提供一种体外原代神经细胞三维培养的方法，所述方法包括以下步骤：将细胞接种于第一方面所述用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架中，进行培养，分化形成体外三维神经网络。

优选地，所述细胞的接种量为1×10

优选地，所述培养用培养基为神经基质培养基(Neurobasal medium)。

优选地，所述神经基质培养基中还包括B27添加剂(B-27

优选地，所述B27添加剂的添加量占所述神经基质培养基总质量的1-3％，例如可以是1％、1.5％、2％、2.5％、3％等。

优选地，所述双抗的添加量占所述神经基质培养基总质量的0.5-2％，例如可以是0.5％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％等。

优选地，所述培养的温度为36-38℃，例如可以是36℃、36.5℃、36.8℃、37℃、37.2℃、37.5℃、38℃等，所述培养的时间为10天以上，例如可以是10天、11天、12天、13天、14天、15天、20天、25天等。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明中的水凝胶支架制备工艺简单，成本低廉，且可以体外长时三维培养原代神经元细胞，分化形成神经网络，可以体外运用光遗传学实现细胞功能的研究，并实现癫痫等脑疾病的体外模型构建。

附图说明

图1为本发明所述用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架的制备流程以及细胞接种流程图。

图2为实施例1提供的水凝胶支架溶胀后的外观图。

图3为在应用例1提供的水凝胶支架中分化形成的体外三维神经网络。

图4为在应用例2提供的水凝胶支架中分化形成的体外三维神经网络。

图5为在应用例3提供的水凝胶支架中分化形成的体外三维神经网络。

图6A为体外光遗传学应用的光刺激前后的原始信号图。

图6B为体外光遗传学应用的一类神经元的波形图。

图7为体外癫痫模型构建图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

以下实施例和对比例各组分，以及设备来源如下所示：

实施例1

本实施例提供一种用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架，所述水凝胶支架由聚丙烯酸、聚乙烯醇和聚乙二醇交联形成，所述水凝胶支架的制备原料按质量百分含量计包括：聚丙烯酸50％、聚乙烯醇30％和聚乙二醇20％。

所述水凝胶支架的制备方法包括以下步骤：

(1)将粉末状的聚丙烯酸、聚乙烯醇和聚乙二醇按照上述比例混合后，置于模具中，采用压片机进行压片，单次片剂的混合粉末的总质量为250mg，模具直径13mm，压力2tons，压片时间30s，得到片剂；

(2)将步骤(1)得到的片剂置于烘箱中，于130℃下热处理30min；

(3)将步骤(2)热处理后的片剂现在水中80℃溶胀2h，再37℃溶胀约24h后达到最大吸水程度，继而换用PBS溶液室温浸润，约72h后其吸水质量，体积膨胀达到恒定值，得到PAA-PVA-PEG水凝胶(如图2所示)；

(4)将溶胀好的PAA-PVA-PEG水凝胶根据孔板大小切成适度尺寸的小圆柱体，至于装有PBS溶液的试剂瓶中0.11MPa的高压、121℃的高温下灭菌处理20min，得到所述用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架。

实施例2

本实施例提供一种用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架，所述水凝胶支架由聚丙烯酸、聚乙烯醇和聚乙二醇交联形成，所述水凝胶支架的制备原料按质量百分含量计包括：聚丙烯酸40％、聚乙烯醇40％和聚乙二醇20％。

所述水凝胶支架的制备方法包括以下步骤：

(1)将粉末状的聚丙烯酸、聚乙烯醇和聚乙二醇按照上述比例混合后，置于模具中，采用压片机进行压片，单次片剂的混合粉末的总质量为270mg，模具直径13mm，压力2tons，压片时间30s，得到片剂；

(2)将步骤(1)得到的片剂置于烘箱中，于130℃下热处理30min；

(3)将步骤(2)热处理后的片剂现在水中80℃溶胀2h，再37℃溶胀约24h后达到最大吸水程度，继而换用PBS溶液室温浸润，约72h后其吸水质量，体积膨胀达到恒定值，得到PAA-PVA-PEG水凝胶；

(4)将溶胀好的PAA-PVA-PEG水凝胶根据孔板大小切成适度尺寸的小圆柱体，至于装有PBS溶液的试剂瓶中0.11MPa的高压、、121℃的高温下灭菌处理20min，得到所述用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架。

实施例3

本实施例提供一种用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架，所述水凝胶支架由聚丙烯酸、聚乙烯醇和聚乙二醇交联形成，所述水凝胶支架的制备原料按质量百分含量计包括：聚丙烯酸30％、聚乙烯醇40％和聚乙二醇30％。

所述水凝胶支架的制备方法包括以下步骤：

(1)将粉末状的聚丙烯酸、聚乙烯醇和聚乙二醇按照上述比例混合后，置于模具中，采用压片机进行压片，单次片剂的混合粉末的总质量为300mg，模具直径13mm，压力2tons，压片时间30s，得到片剂；

(2)将步骤(1)得到的片剂置于烘箱中，于130℃下热处理30min；

(3)将步骤(2)热处理后的片剂现在水中80℃溶胀2h，再37℃溶胀约24h后达到最大吸水程度，继而换用PBS溶液室温浸润，约72h后其吸水质量，体积膨胀达到恒定值，得到PAA-PVA-PEG水凝胶；

(4)将溶胀好的PAA-PVA-PEG水凝胶根据孔板大小切成适度尺寸的小圆柱体，至于装有PBS溶液的试剂瓶中0.11MPa的高压、121℃的高温下灭菌处理20min，得到所述用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架。

实施例4

本实施例提供一种用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架，所述水凝胶支架由聚丙烯酸、聚乙烯醇和聚乙二醇交联形成，所述水凝胶支架的制备原料按质量百分含量计包括：聚丙烯酸60％、聚乙烯醇15％和聚乙二醇15％。

所述水凝胶支架的制备方法包括以下步骤：

(1)将粉末状的聚丙烯酸、聚乙烯醇和聚乙二醇按照上述比例混合后，置于模具中，采用压片机进行压片，单次片剂的混合粉末的总质量为250mg，模具直径13mm，压力2tons，压片时间30s，得到片剂；

(2)将步骤(1)得到的片剂置于烘箱中，于130℃下热处理30min；

(3)将步骤(2)热处理后的片剂现在水中80℃溶胀2h，再37℃溶胀约24h后达到最大吸水程度，继而换用PBS溶液室温浸润，约72h后其吸水质量，体积膨胀达到恒定值，得到PAA-PVA-PEG水凝胶；

(4)将溶胀好的PAA-PVA-PEG水凝胶根据孔板大小切成适度尺寸的小圆柱体，至于装有PBS溶液的试剂瓶中0.11MPa的高压、121℃的高温下灭菌处理20min，得到所述用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架。

实施例5

本实施例提供一种用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架，所述水凝胶支架由聚丙烯酸、聚乙烯醇和聚乙二醇交联形成，所述水凝胶支架的制备原料按质量百分含量计包括：聚丙烯酸25％、聚乙烯醇50％和聚乙二醇25％。

所述水凝胶支架的制备方法包括以下步骤：

(1)将粉末状的聚丙烯酸、聚乙烯醇和聚乙二醇按照上述比例混合后，置于模具中，采用压片机进行压片，单次片剂的混合粉末的总质量为250mg，模具直径13mm，压力2tons，压片时间30s，得到片剂；

(2)将步骤(1)得到的片剂置于烘箱中，于130℃下热处理30min；

(3)将步骤(2)热处理后的片剂现在水中80℃溶胀2h，再37℃溶胀约24h后达到最大吸水程度，继而换用PBS溶液室温浸润，约72h后其吸水质量，体积膨胀达到恒定值，得到PAA-PVA-PEG水凝胶；

(4)将溶胀好的PAA-PVA-PEG水凝胶根据孔板大小切成适度尺寸的小圆柱体，至于装有PBS溶液的试剂瓶中0.11MPa的高压、121℃的高温下灭菌处理20min，得到所述用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架。

实施例6

本实施例提供一种用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架，所述水凝胶支架由卡波姆、聚乙烯醇和聚乙二醇交联形成，所述水凝胶支架的制备原料按质量百分含量计包括：卡波姆40％、聚乙烯醇40％和聚乙二醇20％。

所述水凝胶支架的制备方法包括以下步骤：

(1)将粉末状的卡波姆、聚乙烯醇和聚乙二醇按照上述比例混合后，置于模具中，采用压片机进行压片，单次片剂的混合粉末的总质量为250mg，模具直径13mm，压力2tons，压片时间30s，得到片剂；

(2)将步骤(1)得到的片剂置于烘箱中，于130℃下热处理30min；

(3)将步骤(2)热处理后的片剂现在水中80℃溶胀2h，再37℃溶胀约24h后达到最大吸水程度，继而换用PBS溶液室温浸润，约72h后其吸水质量，体积膨胀达到恒定值，得到PAA-PVA-PEG水凝胶；

(4)将溶胀好的PAA-PVA-PEG水凝胶根据孔板大小切成适度尺寸的小圆柱体，至于装有PBS溶液的试剂瓶中0.11MPa的高压、121℃的高温下灭菌处理20min，得到所述用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架。

对比例1

本对比例提供一种水凝胶支架，所述水凝胶支架仅由聚丙烯酸和聚乙烯醇交联形成，所述水凝胶支架的制备原料按质量百分含量计包括：聚丙烯酸50％和聚乙烯醇50％。

所述水凝胶支架的制备方法包括以下步骤：

(1)将粉末状的聚丙烯酸和聚乙烯醇按照上述比例混合后，置于模具中，采用压片机进行压片，单次片剂的混合粉末的总质量为250mg，模具直径13mm，压力2tons，压片时间30s，得到片剂；

(2)将步骤(1)得到的片剂置于烘箱中，于130℃下热处理30min；

(3)将步骤(2)热处理后的片剂现在水中80℃溶胀2h，再37℃溶胀约24h后达到最大吸水程度，继而换用PBS溶液室温浸润，约72h后其吸水质量，体积膨胀达到恒定值，得到PAA-PVA水凝胶；

(4)将溶胀好的PAA-PVA水凝胶根据孔板大小切成适度尺寸的小圆柱体，至于装有PBS溶液的试剂瓶中0.11MPa的高压、121℃的高温下灭菌处理20min，得到所述水凝胶支架。

对比例2

本对比例提供一种水凝胶支架，所述水凝胶支架由聚丙烯酸和聚乙二醇交联形成，所述水凝胶支架的制备原料按质量百分含量计包括：聚丙烯酸50％和聚乙二醇50％。

所述水凝胶支架的制备方法包括以下步骤：

(1)将粉末状的聚丙烯酸和聚乙二醇按照上述比例混合后，置于模具中，采用压片机进行压片，单次片剂的混合粉末的总质量为250mg，模具直径13mm，压力2tons，压片时间30s，得到片剂；

(2)将步骤(1)得到的片剂置于烘箱中，于130℃下热处理30min；

(3)将步骤(2)热处理后的片剂现在水中80℃溶胀2h，再37℃溶胀约24h后达到最大吸水程度，继而换用PBS溶液室温浸润，约72h后其吸水质量，体积膨胀达到恒定值，得到PAA-PEG水凝胶；

(4)将溶胀好的PAA-PEG水凝胶根据孔板大小切成适度尺寸的小圆柱体，至于装有PBS溶液的试剂瓶中0.11MPa的高压、121℃的高温下灭菌处理20min，得到所述水凝胶支架。

试验例1

测试样品：实施例1-6和对比例1-2提供的水凝胶支架；

测试方法：

(1)水中溶胀率：记录初始质量为W

(2)PBS中最大吸水率：记录初始质量为W

(3)孔隙率：依据液体排开法改进，水凝胶样品用打孔器切成圆柱体，冻干，测量小柱体的厚度，直径，计算出体积V

(4)杨氏模量：应用万能试验机进行压缩模式测试，得到应力应变曲线，通过该曲线的斜率计算杨氏模量。

具体测试结果如表1所示：

表1

由表1测试数据可知，本发明制备出的水凝胶在水中溶胀率为500-3000％，PBS浸润后最大吸水率可达1500-4000％；孔率为70-95％；杨氏模量为0.3-20kPa。本发明中的水凝胶支架制备工艺简单，成本低廉，且可以体外长时三维培养原代神经元细胞，分化形成神经网络，可以体外运用光遗传学实现细胞功能的研究，并实现癫痫等脑疾病的体外模型构建。

应用例1

本应用例提供一种体外原代神经细胞三维培养的方法，所述方法包括以下步骤：将细胞接种于实施例1提供的用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架中，进行培养，分化形成体外三维神经网络；

其中，所述细胞的接种量为1×10

其中，所述培养用培养基为Neurobasal medium+2％B-27

应用例2

本应用例提供一种体外原代神经细胞三维培养的方法，所述方法包括以下步骤：将细胞接种于实施例2提供的用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架中，进行培养，分化形成体外三维神经网络；

其中，所述细胞的接种量为1×10

其中，所述培养用培养基为Neurobasal medium+2％B-27

应用例3

本应用例提供一种体外原代神经细胞三维培养的方法，所述方法包括以下步骤：将细胞接种于实施例3提供的用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架中，进行培养，分化形成体外三维神经网络；

其中，所述细胞的接种量为1×10

其中，所述培养用培养基为Neurobasal medium+2％B-27

试验例2

分化形成的体外三维神经网络

测试样品：应用例1-6和对比应用例1-3水凝胶支架中分化形成的体外三维神经网络；

测试方法：培育新生24小时之内的小鼠的海马神经元细胞10天，通过免疫组化染色，可在共聚焦显微镜下获得分化的神经网络图。

测试结果：

图3为在应用例1提供的水凝胶支架中分化形成的体外三维神经网络。如图3所示，共聚焦显微镜拍摄小鼠海马神经元在水凝胶支架中培养10天，通过iMaris软件重构的3D图，由此说明神经元细胞可在该支架中培养10天以上，分化形成体外三维神经网络。

图4为在应用例2提供的水凝胶支架中分化形成的体外三维神经网络。如图4所示，共聚焦显微镜拍摄小鼠海马神经元在水凝胶支架中培养10天的形态，由此说明神经元细胞可在该支架中培养10天以上，分化形成体外三维神经网络。

图5为在应用例3提供的水凝胶支架中分化形成的体外三维神经网络。如图5所示，共聚焦显微镜拍摄小鼠海马神经元在水凝胶支架中培养10天的形态，由此说明神经元细胞可在该支架中培养10天以上，分化形成体外三维神经网络。

试验例3

体外光遗传学应用

测试样品：实施例1提供的水凝胶支架；

测试方法：小鼠海马神经元细胞在支架中培养10天后，使用定制的多通道光极阵列通过64通道神经采集处理器(Plexon，USA)进行电生理信号记录。电生理信号采样率是40kHz，滤波范围300-5000Hz。LFP的采样频率为1kHz，滤波范围为1-500Hz。蓝光(473nm)刺激参数是功率10mW，20Hz，5ms。

测试结果：

图6A-图6B为体外光遗传学应用图，如图6A所示，光刺激前后的原始信号图，如图6B所示，一类神经元的波形图。说明本发明提供的水凝胶支架可以体外运用光遗传学实现细胞功能的研究。

试验例4

体外癫痫模型构建

测试样品：实施例1提供的水凝胶支架；

构建方法：Vgat-ChR2转基因小鼠的海马神经元细胞在支架中培养十天后，添加40μg/mL的钾离子通道阻断剂4-氨基吡啶(4-AP)，从而诱发神经元细胞发放癫痫波，以构建外癫痫模型，癫痫波诱发后，再用蓝光(473nm)激活Vgat-ChR2，刺激参数功率10mW，130Hz，5ms，60s开，120s关，循环刺激，以抑制癫痫波的发放。最后用MATLAB(MathWorks,USA)和Neuroexplorer(Plexon,USA)进行数据分析。

测试结果：图7为体外癫痫模型构建图，如图7所示，癫痫造模前，发作时和光抑制发作后的能量密度图，说明本发明所示的支架可以实现癫痫等脑疾病的体外模型构建。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的用于体外原代神经细胞三维培养的水凝胶支架及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。