一种有助于改善口臭的复合益生菌

摘要

本发明公开了一种有助于改善口臭的复合益生菌，属于微生物技术领域。本发明所述复合乳杆菌，是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1214细胞和/或其胞外代谢物，与唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)CCFM1215细胞和/或其胞外代谢物的组合物。该组合物具有抑制具核梭杆菌产VSCs的能力，在体内具有长效缓解口臭的作用，志愿者在第28天时，口气值可以降低63.37％。

说明书

技术领域

本发明涉及一种有助于改善口臭的复合益生菌，特别是用于改善由具核梭杆菌所引起的口臭的植物乳杆菌和唾液乳杆菌组成的复合益生菌，属于微生物技术领域。

背景技术

口臭作为第三大口腔健康问题，困扰了很多人。80％～90％的口臭与口腔因素相关，称为口源性口臭。口气的主要成分是挥发性硫化物(Volatile Sulfur Compounds，VSCs)，其中90％是硫化氢和甲硫醇，还有二甲基硫醚等。而产生气味的原因口腔内的微生物分解含硫氨基酸 (胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸)或血清从而产生了代谢产物。产生VSCs的细菌主要是具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、Solobacterium moorei等等。

目前，治疗方法有化学疗法，如利用洗必泰、精油等漱口水产品来治疗口臭，但此类方法温和性和安全性欠佳，且精油仅能遮盖气味，并没有从本质上降低VSCs的浓度，治标不治本，所以效果不佳；而中药起效慢，起效一般。对于由微生物引起的口源性口臭，应“对症下药”，用微生物的方法解决因微生物引起的问题。目前益生菌以其安全、温和的特点，正逐步应用于口腔领域。

对于采用益生菌改善口臭的方法，US2006171901披露了一种能够抑制厌氧菌的唾液链球菌；CN201811441014.1添加铁皮石斛低聚甘露糖作为益生元成分、添加多种益生菌成分，旨在设计一种清新口气的固体饮料，但却无改善口气的效果评价。CN109045071A披露了一种可以减轻口臭的组合物用于治疗胃源性口臭，其中包含了7种益生菌和绿茶粉等等；CN201910453030.0评估了复合益生菌含片漱口3min后对志愿者口气的一个瞬时的改善效果，但没有对服用的一个长期效果做出评估；CN201810931190.7针对如幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)发明了一种用于改善口臭状况的益生菌组合物，而组合物涉及7种乳杆菌，成本高。CN111235063A披露了口腔益生菌干粉，用于口腔护理产品中，以改善口腔微生态，可以有效减少变异链球菌的生物膜，所述口腔益生菌包括植物乳杆菌XY-381、副干酪乳杆菌XY-256和唾液乳杆菌XY-101，但是体外减少生物膜的体内却不一定有效，且效果不一定持久。

发明内容

[技术问题]

现有技术中能够缓解口臭的益生菌多是以抑菌为靶向，并且很多都无体内的验证实验，或者只有较短暂时间的效果评价。

[技术方案]

本发明提供能够降低具核梭杆菌产挥发性硫化物(简称VSCs)的复合乳杆菌，并且有在体内具有改善口臭的作用效果。

所述复合乳杆菌，是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1214细胞和/或其胞外代谢物，与唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)CCFM1215细胞和/或其胞外代谢物的组合物。所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1214在体外有抑制抑制具核梭杆菌的能力，在体内具有缓解口臭的作用，具体地，(1)CCFM1214的培养液上清可以预防具核梭杆菌生物膜的形成，添加量10％时，抑制率达到68.61％；(2)对具核梭杆菌的生长有一定的抑制； (3)与具核梭杆菌有良好的共聚能力；(3)能够抑制具核梭杆菌产H

所述复合乳杆菌中，植物乳杆菌与唾液乳杆菌的比例是1:1。

所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1214和唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)CCFM1215在MRS培养基上的菌落呈光滑、白色、圆形小凸起。

本发明还提供了一种用于改善口臭的产品，所述产品含有上述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1214活细胞或死细胞或胞外代谢物，与唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius) CCFM1215活细胞或死细胞或胞外代谢物。所述死细胞包括但不限于自然失去活性的细胞或经灭活处理后的细胞。所述产品的形式包括但不限于微生物制剂、固体饮料、口气清新剂、牙膏、漱口水。

[有益效果]

本发明筛选得到了一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1214和一株唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)CCFM1215在体外有抑制抑制具核梭杆菌产VSCs的能力，在体内，两者复配具有缓解口臭的作用，具体体现在：能够改善志愿者的口气值，在第28天时，可以降低63.37％的口气值。

生物材料保藏

所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1214于2021年12月17日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为 GDMCC No:62140。

唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)CCFM1215于2021年12月17日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:62141。

附图说明

图1：人群实验流程图

具体实施方式

下述实施例中涉及的培养基如下：

MRS培养基：酵母粉5.0g/L、牛肉膏10.0g/L、蛋白胨10.0g/L、葡萄糖20.0g/L、无水乙酸钠2.0g/L、柠檬酸氢二胺2.0g/L、磷酸氢二钾2.6g/L、一水合硫酸锰0.25g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、吐温-80 1mL/L，pH 6.2～6.4。

食品级MRS培养基(/L)：食用级酵母抽提物10g(购自安琪酵母股份有限公司)、食用级葡萄糖20g(购自山东海容生物技术有限公司)、大豆蛋白胨10g(河南万邦化工科技有限公司)、食用级硫酸镁0.1g(购自莱州市莱玉化工有限公司)、食用级硫酸锰0.05g(购自连云港龙泰威食品配料有限公司)、食用级醋酸钠5g(购自江苏科伦多食品配料有限公司)、食用级柠檬酸铵2g(购自江苏科伦多食品配料有限公司)、食用级磷酸氢二钾2g(购自徐州丰瑞生物科技有限公司)

BHI培养基：购买于青岛海博，另外添加0.05％的氯化血红素和0.1％的维生素K1，pH 7.2～7.4。

下述实施例中涉及的菌悬液的制备方法如下：

乳杆菌上清液：在MRS液体培养基中以1％接种量接种，于37℃培养箱培养24h后，10,000r/min，4℃离心10min，再经0.22μm滤膜过滤除菌，于4℃短期保存，于-20℃长期保存。

下述实施例中的植物乳杆菌CCFM1214筛选于卷心菜，以抑制具核梭菌VSCs的产量为指标进行筛选，经鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

下述实施例所用唾液乳杆菌CCFM1215筛选于粪便，以抑制具核梭菌VSCs的产量为指标进行筛选，经鉴定为唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)。

实施例1：CCFM1214与CCFM1215复配对具核梭杆菌产VSCs的影响

Control(对照组)：将10

CCFM1214或CCFM1215：将10

CCFM1214+CCFM1215：将10

结果如表1所示，两菌复配时，对具核梭杆菌产VSCs的抑制率为93.28％，要优于单菌的效果。

表1 CCFM1214与CCFM1215复配对具核梭杆菌产VSCs的影响

实施例2：益生菌菌粉的制备

菌泥：植物乳杆菌CCFM1214和唾液乳杆菌CCFM1215用食品级MRS培养基37℃培养24h，离心弃上清收集菌泥，无菌水洗涤再离心弃上清收集菌泥。

冻干保护剂：脱脂乳粉200g/L，甘露醇300g/L。菌泥和冻干保护剂比例是1:3。

冻干：将菌泥与保护剂混合均匀后，于-80℃预冷过夜，再置于冻干机进行冻干。

CCFM1214菌粉：将冻干的菌粉与低聚果糖混合，使得每克含有10

实施例3：益生菌粉改善口臭的人群实验

一、志愿者招募及实验流程

志愿者招募的纳入标准：Halimeter检测值>200ppb，1个月内未使用抗生素；排除标准：抽烟，处于孕期。

志愿者共招募66名，随机分成4组，安慰剂组15人，CCFM1214菌粉组15人，CCFM1215菌粉组15人，复合菌粉组21人，实验的流程和周期见图1。实验共为期5周，4周服用菌粉 (安慰剂组服用安慰剂)，期间每日餐后30min服用一袋菌粉，1周洗脱期，期间不服用菌粉 (安慰剂组不服用安慰剂)。从服用菌粉的第一天起算为第1天，第7、14、28、35天需要用Halimeter口臭仪进行口气的检查，其中基线期与第28天由医生进行口腔健康的检查，包括牙结石指数(CI)、菌斑指数(PLI)、牙龈指数(GI)、牙龈出血指数(GBI)，检查结果如表 3所示。

二、检测方法

1、Halimeter口臭仪检测：要求志愿者检查前禁食禁水2h，采样前，受试者闭口3min，将吸管的末端插入患者口中，深度约为2.5cm，嘴唇应几乎闭合，嘴唇与吸管间允许有一点空隙，不能将嘴唇与牙齿压在吸管上。采样过程中，应该通过鼻子进行呼吸。当仪器显示板数值升至最高值稳定后开始下降时，记录最高值，并检测三次取平均值，结果见表2。

表2志愿者服用菌粉前后口气值的变化(ppb)

注：*益生菌组与基线期相比，p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，

2、口腔健康检查：由专业的医师进行诊断，结果见表3。

牙结石指数：0＝无软垢及牙结石。1＝少许软垢或牙结石，但未超过牙面的l/3。2＝有牙结石，未超过冠面的1/3，有少量的龈下结石。3＝牙结石不超过冠面的2/3，有较多的龈下结石。

菌斑指数：0＝龈缘区无菌斑；1＝龈缘区的牙面有薄的菌斑，但视诊不可见，若用探诊尖的侧面可刮出菌斑；2＝在龈缘或邻面可见中等量菌斑；3＝龈沟内或龈缘区及邻面有大量软垢。

牙龈指数：0＝牙龈健康；1＝牙龈轻度炎症：牙龈的颜色有轻度改变并轻度水肿，探诊不出血；2＝牙龈中等炎症：牙龈色红，水肿光亮，探诊出血；3＝牙龈严重炎症：牙龈明显红肿或有溃疡，并有自动出血倾向。

牙龈出血指数：0＝牙龈健康，无炎症和出血；1＝牙龈颜色有炎症改变，探诊后不出血； 2＝探诊后有点状出血；3＝探诊后出血沿牙龈缘呈线状；4＝出血溢满并溢出龈沟；5＝自动出血。

表3志愿者口腔健康检查变化

注：*益生菌组与基线期相比，p<0.05

3、实验结果

基线期，安慰剂组与复合菌粉组的口气值没有显著区别的，当服用菌粉1周后，复合菌粉组的口气值有了显著的下降(p<0.01)，下降了46.89％，CCFM1214组降低了40.67％，CCFM1215降低了43.69％，而安慰剂组无显著的变化。服用两周后，复合菌粉组口气值下降极显著(p<0.001)，两株单菌有显著的降低(p<0.01)。而安慰剂组也有显著的降低(p<0.05)，可能是由于心理作用的影响，因为口气也会受到生理和心理的影响，但是安慰剂组的下降效果是短暂的，当洗脱期时，便恢复到了原来的数值。复合菌粉组整体呈下降的趋势，不服用菌粉后，口气值略有回升，但效果依然很显著(p<0.001)。服用菌粉28天后，复合菌粉组口气值下降了63.37％，CCFM1214菌粉组是44.29％，CCFM1215菌粉组是46.50％。总体来说，认为复合菌的效果优于单菌，后续对益生菌对口腔健康状况的影响作进一步分析。

复合菌粉组的口腔健康状态，整体有了良好的改变，尤其是牙龈指数，得到了显著的改善(p<0.05)，而安慰剂组的口腔状态没有显著的改善。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。