一株提高肠道放线菌门相对丰度、抑制促炎症因子表达量的凝结芽孢杆菌

摘要

本发明公开了一株提高肠道放线菌门相对丰度、抑制促炎症因子表达量的凝结芽孢杆菌，属于微生物领域。本发明的菌株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CCFM1041有效缓解肠易激综合症状，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CCFM1041降低IBS小鼠结肠扩张评分、抑制结肠肥大细胞的激活、降低PAR‑2的表达，并降低血清皮质酮的浓度、能够显著提升肠易激综合症状小鼠肠道内放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度、抑制了促炎细胞因子(IL‑1β，IL‑6与TNF‑α)的表达，因此，本发明的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CCFM1041在制备肠易激综合症的产品(如药品或保健品等)中，具有巨大的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一株提高肠道放线菌门相对丰度、抑制促炎症因子表达量的凝结芽孢杆菌， 属于微生物领域。

背景技术

肠易激综合征(Irritable bowel syndrome，IBS)是一种具有肠道功能性障碍的慢性肠道 疾病，通常伴随着腹痛、腹胀与排便习惯的变化。现行的IBS常用诊断标准是多位胃肠病学 学者共同制订的“Rome IV标准”。根据该标准规定的粪便状态，IBS被分为四个亚型，腹泻型 IBS(IBS-D)、便秘型IBS(IBS-C)、腹泻便秘混合型(IBS-M)与未确定型(IBS-U)，具有 不同的临床表现。据统计，目前的肠易激综合症状(IBS)患病率大于10％，且女性的IBS 发病率高于男性。然而，由于社会对IBS的认知的缺乏，预计超过三分之一符合IBS罗马Ⅲ 标准的IBS患者仍未被正式诊断为IBS。这表明，IBS的潜在患者仍然众多。

环境变化、情绪变化、肠道感染等因素直接引起的免疫激活(肠道炎症等)、内脏超敏症 状(心理压力、脑肠轴紊乱等)及肠道菌群紊乱(多样性及组成改变)，均被认为可能是IBS 的共同诱因。研究发现，肠道菌群参与了宿主的免疫应答、神经信号传导等多个生理生化过 程，并对数个疾病的发生发展具有显著影响。与健康人相比，IBS患者肠道菌群的多样性显 著降低，肠道菌群的组成发生了显著变化。而免疫系统对肠道菌群过度的免疫反应能够诱发 产生肠道损伤性炎症，这说明肠道菌群的紊乱极可能在IBS的发病中具有重要作用。

在先前的研究中，IBS被认为不涉及到患者器质性病变及生化指标异常，但最新的IBS 相关研究推翻了该结论。证据显示，IBS患者的肠道具有一种非常轻的、低度的粘膜炎症、 并伴随着轻微的纤维化与溃疡。这种肠道炎症同样被报道能够引起患者免疫应答的变化，先 天免疫激活状态。因此，机体的免疫过度激活，被认为可能是IBS的共同诱因。目前，已有 大量研究证明了益生菌恢复细胞因子平衡的能力。一项针对IBS患者的安慰剂对照随机临床 试验表明，12周的婴儿双歧杆菌导致IL-10/IL-12比率增加，与健康患者中发现的水平相似。 此外，也有研究报道，益生菌长双歧杆菌可降低小鼠体内的促炎因子TNF-α。而嗜热链球菌、 嗜酸乳杆菌、双歧双歧杆菌和保加利亚乳杆菌的益生菌组合可降低小鼠体内的TNF-α、干扰 素-γ和PGE 2水平这些研究表明，益生菌可以调节先天性和适应性免疫，从而潜在地赋予治 疗益处并治疗IBS中的免疫失调。

对IBS而言，饮食是公认的可能诱发IBS的因素。普遍认为，在饮食中限制短链碳水化 合物(Fermentable oligo-,di-,and monosaccharides and polyols，FODMAPs)有助于缓解IBS 患者的腹痛、腹胀、排便频率等临床症状。然而，关于低FODMAP饮食并非都是统一支持 的声音。部分临床试验发现，不同亚型IBS患者对低FODMAP饮食的响应具有显著差异，效果与患者的基因型也具有一定相关性。且低FODMAP饮食由于改变了患者的饮食习惯， 并限制摄入部分饮食成分，从而对肠道菌群组成与代谢具有显著的影响，这可能是不利于人体健康的。而除膳食疗法外，药物疗法同样被应用于IBS的治疗中。诸如抗痉挛药物、5-HT受体抑制剂、利福昔明抗抑郁药物等药物被报道具有一定IBS缓解功效，但带来的诸如致使患者口干、眼涩、缺血性结肠炎、低血压及性功能障碍等数个副作用相比于膳食疗法更是巨大的。因此，新型的IBS治疗方法的开发是势在必行的。

随着肠道菌群在人类健康中的重要性与日俱增，人们对可以调节肠道菌群的干预措施及 其与宿主的相互作用的兴趣也逐渐增长。除饮食外与FMT外，益生菌是人们最熟知的，亦是 最公认的能够调节人体肠道菌群的物质。

如何通过对益生菌预防IBS的发生甚至缓解IBS的症状，将会对食品科学、微生物学以 及预防医学等各方面产生巨大的影响。

发明内容

本发明提供了一种凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)GDMCC No.60538在制备改善肠易 激综合症的微生物菌剂中的应用；所述凝结芽孢杆菌GDMCC No.60538记载于公开号为 CN111004731B的中国发明专利文本中；在本发明中，将凝结芽孢杆菌GDMCCNo.60538以 凝结芽孢杆菌CCFM1041命名。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为包括细胞形态为营养细胞的凝结芽孢杆 菌生物制剂或细胞形态为芽孢的凝结芽孢杆菌生物制剂。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂中，凝结芽孢杆菌的芽孢数为不低于5×10

在本发明的一种实施方式中，所述细胞形态为营养细胞的凝结芽孢杆菌生物制剂，是将 凝结芽孢杆菌在MRS培养基中活化培养后，离心获得凝结芽孢杆菌菌体，洗涤后收集菌体用 保护剂重悬，得到凝结芽孢杆菌生物制剂；或者，再将重悬的菌体干燥得到凝结芽孢杆菌菌 粉生物制剂。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂具有以下至少一种功能：

(a)降低IBS小鼠结肠扩张评分，缓解外部刺激造成的小鼠内脏痛觉增强；

(b)提高肠易激综合症状小鼠的肠道菌群多样性；

(c)改善小鼠肠道菌群组成，主要包括提高肠易激综合症小鼠肠道放线菌门相对丰度；

(d)缓解肠易激综合症；

(e)改善结肠组织的病理损伤；

(f)抑制结肠组织中促炎症因子的表达量。

本发明提供了一种凝结芽孢杆菌GDMCC No.60538在制备改善肠易激综合症的产品中 的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品、保健品、饲料或饲料添加剂。

在本发明的一种实施方式中，所述产品中，凝结芽孢杆菌的芽孢数为不低于5×10

在本发明的一种实施方式中，所述药品含有凝结芽孢杆菌、药物载体和/或药用辅料。

在本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。

在本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。

在本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含黏合剂、填充剂、崩解剂和/或润滑剂。

在本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含增溶剂、助溶剂、潜溶剂和/或防腐剂。

在本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或 口服液。

在本发明的一种实施方式中，所述产品具有以下至少一种功能：

(a)降低IBS小鼠结肠扩张评分，缓解外部刺激造成的小鼠内脏痛觉增强；

(b)提高肠易激综合症状小鼠的肠道菌群多样性；

(c)改善小鼠肠道菌群组成，主要包括提高肠易激综合症小鼠肠道放线菌门相对丰度；

(d)缓解肠易激综合症；

(e)改善结肠组织的病理损伤；

(c)抑制结肠组织中促炎症因子的表达量。

有益效果

本发明的菌株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CCFM1041有效缓解肠易激综合症状，具 体体现在：

(1)本发明的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CCFM1041降低IBS小鼠结肠扩张评分， 缓解外部刺激造成的小鼠内脏痛觉增强。

(2)本发明的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CCFM1041能够抑制结肠肥大细胞的激 活，降低PAR-2的表达，并降低血清皮质酮的浓度。

(3)本发明的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CCFM1041能够改善IBS小鼠肠道菌群 的严重的失调症状，包括提高小鼠肠道菌群多样性水平(提高Observed_OTUs多样性指数及 Shannon多样性指数)。

(4)本发明的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CCFM1041能够显著提升肠易激综合症 状小鼠肠道内放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度。

(5)本发明的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CCFM1041缓解了小鼠结肠所受的组织 病理学损伤，抑制了促炎细胞因子(IL-1β，IL-6与TNF-α)的表达。这说明凝结芽孢杆菌(B. coagulans)CCFM1041能够缓解结肠炎症。

(6)本发明的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CCFM1041能够抑制结肠肥大细胞的激 活，降低PAR-2的表达，并降低血清皮质酮的浓度，从而缓解IBS小鼠的内脏超敏症状。

本发明的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CCFM1041在制备肠易激综合症的产品(如药 品或保健品等)中，具有巨大的应用前景。

附图说明

图1：小鼠腹部回撤反射评分标准。

图2：小鼠腹部撤回反射评分；其中，A为气体压力在0.1mL条件下的评分结果，B为气体压力在0.2mL条件下的评分结果；备注：小写字母a～c表示该数据具有统计学差异(P<0.05)。

图3：小鼠结肠组织中肥大细胞类胰蛋白酶的水平。

图4：小鼠结肠组织病理学分析(放大倍数＝5×；比例尺＝200μm)；其中，A组为空白组； B组为模型组，C组为凝结芽孢杆菌GBI-30，6086组；D组为凝结芽孢杆菌CCFM1041组；E组为凝结芽孢杆菌BC-21组；F组为凝结芽孢杆菌BC-30组；G组为凝结芽孢杆菌BC-60 组；H组为凝结芽孢杆菌BC-90组；注：黑色箭头指示该位置存在炎性细胞浸润，红色箭头 指示该位置存在少量淤血。

图5：小鼠结肠促炎细胞因子及抑炎细胞因子的表达；其中，A为小鼠结肠组织中IL-1β 的表达量；B为小鼠结肠组织中IL-6的表达量；C为小鼠结肠组织中IL-10的表达量；D为 小鼠结肠组织中TNF-α的表达量；注：小写字母表示组间具有显著性差异(P<0.05)。

图6：小鼠肠道菌群的多样性分析；其中，A为Observed_OTUs多样性指数，B为Shannon 多样性指数。

图7：小鼠肠道菌群的进化分枝图。

图8：造模组、空白组、凝结芽孢杆菌CCFM1041组之间差异属的线性判别分析得分，其中，A为空白组和造模组之间差异属的线性判别分析得分，B为CCFM1041组和造模组之 间差异属的线性判别分析得分。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的鼠柠檬酸杆菌DBS100购自美国ATCC菌种保藏库，所涉及的凝 结芽孢杆菌GBI-30，6086购自美国Ganeden公司，所述凝结芽孢杆菌BC21(VYNDL1M1)、凝结芽孢杆菌BC30(VHuBXY1M1)、凝结芽孢杆菌BC60(VJSNJ4M1)、凝结芽孢杆菌BC90(VGZTR1M1)公开于江南大学食品生物技术中心菌种保藏库。

下述实施例中涉及的培养基如下：

MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二胺2g/L、三水磷酸氢二甲2.6g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸锰0.25 g/L、吐温-80 1g/L、蒸馏水1000g/L。

MRS固体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二胺2g/L、三水磷酸氢二甲2.6g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸锰0.25 g/L、吐温-80 1g/L、琼脂20g/L、蒸馏水1000g/L。

产芽孢培养基(g/L)：酵母膏0.7g/L、蛋白胨1g/L、葡萄糖1g/L、硫酸铵0.2g/L、七水硫酸镁0.2g/L、磷酸氢二钾1g/L。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

小鼠结肠扩张内脏敏感性的检测：

腹部撤退反射(Abdominal withdrawal reflex，AWR)法测定小鼠结肠扩张内脏敏感性。 各组小鼠禁食16h后进行实验。实验开始后，用4％异氟烷麻醉小鼠，并继续以2％异氟烷持 续麻醉小鼠。将儿童尿导管(6Fr，2mm外径)以液体石蜡进行润滑，从肛门插入小鼠的降 结肠中。将尿道管与小鼠尾部用胶带固定，并将小鼠放置到透气塑料盒中。在塑料盒中，小 鼠仅能前后行走，不能转身。待小鼠适应30min后，以逐步打气加压的方式进行结肠直肠扩 张。压力从0.1、0.2至0.3ml逐步上升，每个压力扩张20s。更换压力时需将气体排空，每 次20秒的扩张之后均有5min休息时间。在评估结束后，将球囊放气并撤回。AWR评分标 准如图1所示，0分-无明显反应；1分-短暂头部摆动再停止；2分-腹部肌肉收缩；3分-腹部 提起；4分-弓背、抬起骨盆。该评分由两名不知道小鼠详细分组的实验人员进行。

实施例1：凝结芽孢杆菌CCFM1041对肠易激综合征小鼠内脏敏感性的缓解作用

(1)凝结芽孢杆菌芽孢悬液的制备

将活化后的凝结芽孢杆菌菌种按2mL/100mL的接种量，接种至产芽孢培养基中，在37℃ 下，250r/min摇瓶培养48h，制备得到凝结芽孢杆菌芽孢悬液。

(2)乳酸林格氏液的制备

在1L蒸馏水中加入9g氯化钠，0.12g氯化钾，0.24g氯化钙，0.2g碳酸氢钠，制备得到乳酸林格氏液。

(3)建立小鼠IBS模型

使用鼠柠檬酸杆菌感染与避水应激压力结合法，建立小鼠IBS模型。将80只C57BL/J 小鼠被随机分为8组(每组10只)，分组方式如表1所示。

小鼠适应一周后开始实验，实验时间为30天。实验第1天，空白组小鼠灌胃0.2ml无菌 生理盐水，其余组小鼠灌胃鼠柠檬酸杆菌DBS100(1.2×10

第2天到第8天，所有小鼠皮下注射0.5ml乳酸林格氏溶液，以防止腹泻引起的脱水。

第9天到第17天的具体处理方法详见表1；

实验第18天至第30天，所有小鼠均接受避水应激压力(Water avoidance stress，WAS)。 WAS装置为一个直径27cm、高33cm的水桶。桶底装有一个直径4cm、高9cm的干燥平台。水桶中装水，水位低于平台1厘米。每天将小鼠置于平台上1小时，如果小鼠掉进水里，立即捞起并用毛巾擦干。空白组小鼠在无水条件下放置于平台上1h。

除上述处理外，从第2天至第29天，对照组小鼠和模型组小鼠灌胃给予无菌生理盐水(0.2 ml/只/天)。其他组小鼠灌胃给予相应凝结芽孢杆菌芽孢悬液0.2ml(5×10

表1：各组的具体处理方法(1)

表2：各组的具体处理方法(2)

(3)用腹部撤退反射(Abdominal withdrawal reflex，AWR)法测定小鼠结肠扩张内脏敏 感性。

将步骤(2)实验结束后的各组小鼠禁食16h后用腹部撤退反射法测定小鼠结肠扩张内 脏敏感性，结果如图2A～B所示。

结果显示：在0.2ml和0.1ml的气体压力下，凝结芽孢杆菌CCFM1041均具有较好的效 果；其中，在0.2ml气体压力下，空白组和造模组的AWR评分分别0.5和3.5，CCFM1041 组为1.2，GBI-30,6086组为1.6，BC-21组为3.7，BC-30组为3，BC60组为3.6，BC90组为 3.9。与其他实验组比较，凝结芽孢杆菌CCFM1041可以显著降低小鼠内脏敏感性，最为接近 空白组，这说明凝结芽孢杆菌CCFM1041具有缓解内脏超敏症状的功效。

(4)将步骤(2)实验结束后的各组小鼠使用异氟烷麻醉处死后，收集小鼠的血清，并 精确取0.1g结肠组织，以预冷过的无菌生理盐水匀浆，以3000×g，4℃条件离心5min收集 上清液。用相应的ELISA试剂盒测定小鼠结肠组织中PAR-2、肥大细胞类胰蛋白酶含量及血 清中的皮质酮水平，其中，肥大细胞类胰蛋白酶含量的结果如图3所示。

结果显示，由图3可知，空白组和造模组中小鼠的结肠肥大细胞类胰蛋白酶表达量为别 为210pg/mg protein和440pg/mg protein，实验组中CCFM1041组为220pg/mgprotein，GBI-30, 6086组为260pg/mg protein，BC-21组为420pg/mg protein，BC-30组为450pg/mg protein， BC-60组为390pg/mg protein，BC-90组为430pg/mg protein；可见，CCFM1041组的效果优 于GBI-30,6086组。

同时，用相应的ELISA试剂盒测定小鼠结肠组织中PAR-2、血清中的皮质酮水平，可知 在凝结芽孢杆菌CCFM1041干预后，小鼠结肠组织中PAR-2、血清中的皮质酮水平的表达水 平均有所下降，接近空白组。进一步提示凝结芽孢杆菌CCFM1041具有较优秀的改善小鼠肠 道敏感症状的作用。

实施例2：凝结芽孢杆菌CCFM1041对肠易激综合征小鼠结肠组织的影响

具体实施方式同实施例1，区别在于，实验结束后，将小鼠解剖后，取新鲜结肠组织放 入多聚甲醛固定液，浸泡后，过夜冲洗。将样品依次经70％、80％、90％各级乙醇溶液脱水， 各30min，再放入95％、100％各2次，每次20min进行脱水。放入1/2纯酒精，1/2二甲苯等量混合液15min，二甲苯前洗液15min、二甲苯后洗液15min至透明为止。放入二甲苯和 石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50～60分钟来除去透明剂。将处理 好的样品进行包埋切片、展片、烤片、H&E染色与封片。

观察小鼠结肠组织的病理切片，结果如图4所示，空白组，CCFM1041组和GBI-30,6086 组小鼠结肠无明显病理性症状，造模组小鼠的结肠中出现了低度炎性损伤，具体表现为轻微 的炎性细胞浸润症状，而其余凝结芽孢杆菌处理组(BC-21组，BC-30组，BC-60组，BC-90 组)也均呈现出炎症细胞浸润现象，在用凝结芽孢杆菌CCFM1041处理的小鼠中，没有观察 到明显的组织病理学损伤，这表明该菌株可能具有缓解肠道炎症的功效。

实施例3：凝结芽孢杆菌CCFM1041对肠易激综合征小鼠结肠促炎细胞因子及抗炎细胞 因子的调节作用

具体实施方式同实施例1，区别在于，实验结束后，分别将小鼠解剖，精确取0.1g结肠 组织，以预冷过的无菌生理盐水匀浆，以3000×g，4℃条件离心5min收集上清液。用相应的 ELISA试剂盒测定小鼠结肠组织中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α表达量，结果如图5A～D所示。

由图5A可知，IL-1β的表达量在空白组和造模组中分别为38pg/mg protein和58pg/mg protein，在CCFM1041组中为45pg/mg protein，在GBI-30,6086组中为48pg/mgprotein，在BC-21组中为51pg/mg protein，在BC-30中为53pg/mg protein，在BC-60中为53pg/mg protein，在BC-90中为55pg/mg protein。相比于其他凝结芽孢杆菌处理组，凝结芽孢杆菌 CCFM1041的摄入显著降低了小鼠结肠中促炎症因子1β的表达量，最为接近空白组。

由图5B可知，空白组小鼠、造模组的结肠组织中IL-6表达量分别为44pg/mgprotein和 64pg/mg protein，凝结芽孢杆菌CCFM1041组中IL-6表达量为41pg/mgprotein，而 GBI-30,6086组中IL-6表达量为：48pg/mg protein，可见CCFM1041组的效果优于GBI-30,6086 组。

由图5C可知，空白组小鼠、造模组的结肠组织中IL-10表达量分别为72pg/mgprotein 和134pg/mg protein，凝结芽孢杆菌CCFM1041组中IL-10表达量为87pg/mgprotein，而 GBI-30,6086组中IL-10表达量为：98pg/mg protein，可见CCFM1041组的效果优于 GBI-30,6086组。

由图5D可知，空白组小鼠、造模组的结肠组织中TNF-α表达量分别为13pg/mgprotein 和17pg/mg protein，凝结芽孢杆菌CCFM1041组中TNF-α表达量为8pg/mgprotein，而 GBI-30,6086组中TNF-α表达量为：9.2pg/mg protein，可见CCFM1041组的效果优于 GBI-30,6086组。

这说明经凝结芽孢杆菌CCFM1041处理后，小鼠结肠促炎细胞因子IL-1β，IL-6，IL-10 与TNF-α的表达量有显著降低，并能够恢复至正常水平，与实施例2结果吻合。

在过去的实验中，研究人员研究发现凝结芽孢杆菌专利菌株Unique IS2的摄入无法改善 患者体内促炎症因子IL-6、IL-12、TNF-α、INF-γ的水平(Randomized clinicaltrial:the effect of probiotic Bacillus coagulans Unique IS2 vs.placebo on thesymptoms management of irritable bowel syndrome in adults,DOI:10.1038/s41598-019-48554-x)；可见，凝结芽孢杆菌CCFM1041 对促炎症因子的缓解作用有其菌株特异性。

实施例4：凝结芽孢杆菌CCFM1041对肠易激综合征小鼠肠道菌群多样性和组成分析

80只C57BL/J小鼠分组、造模及处理方法同实施例1。实验结束后，通过粪便DNA提取试剂盒提取小鼠粪便DNA，对粪便菌群进行16S rDNA V4区的扩增。并对PCR产物的回 收与纯化，最后通过Illumina Miseq平台测序与生物信息学分析。检测结果如图6A～B、图7～8 所示。

结果显示，由图6A～B可知，凝结芽孢杆菌CCFM1041在Observed_OTUs多样性指数及Shannon多样性指数上，均具有较好的效果，表明该菌具备改善肠道菌群多样性的功效。

由图7～8可知，造模组和其余凝结芽孢杆菌处理组中放线菌门(Actinobacteria)的丰度 出现下降，而CCFM1041组小鼠肠道中放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度则显著高于造 模组和其余实验处理组(图7和图8)。

因此，实验结果表明凝结芽孢杆菌CCFM1041的摄入可以线束改善了IBS小鼠的肠道菌 群组成，病提升肠道内放线菌门(Actinobacteria)相对丰度的提升，从而维持肠道稳态。

实施例5：凝结芽孢杆菌CCFM1041在制备缓解肠易激综合征的药品中的应用

将凝结芽孢杆菌CCFM1041以2-4％的接种量接种到产芽孢培养基中在37℃下，250r/min 摇瓶培养48h，离心并洗涤芽孢，用生理盐水重悬浮，使芽孢浓度≥5×10

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。