一种Dox调控的记录猪组织分化与器官发生的谱系示踪技术

摘要

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种将40种整合条形码片段与强力霉素(Doxycycline，Dox)调控CRISPR/Cas9编辑产生的indels相结合用于研究哺乳动物细胞在发育、再生和器官形成过程的谱系示踪研究方法。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种将40种整合条形码片段与强力霉素(Doxycycline，Dox)调控CRISPR/Cas9编辑产生的indels相结合用于研究哺乳动物细胞在发育、再生和器官形成过程的谱系示踪研究方法。

背景技术

器官移植是指将健康器官移植到另一个个体内，并使之迅速恢复功能的手术。器官移植手术已成为挽救终末期器官衰竭患者的重要医疗手段。但是通过捐赠获得的供体器官数量非常有限，据统计，中国每年实施的器官移植手术则只有1万例左右，却有100多万病人在等待器官供体，绝大多数病人只能痛苦地接受没有可供移植的器官供体的现实。对于器官移植需求的压力越来越大，器官短缺已成为一个全球性问题，而异种器官移植是目前公认的解决人类器官供体严重不足的有效途径。经过探索异种器官移植的研究取得很大进展，但是要真正走向临床仍然存在很多障碍，例如免疫排斥问题，凝血问题等。因此如果能够利用猪生产出人类化器官可以很好地解决这个问题。

CRISPR/Cas9系统可实现高效的基因编辑，包括定点插入、敲除及突变。最早科学家利用人的皮肤组织诱导生成多能干细胞，将它们移植到猪的早期胚胎，成功培育出一批人猪嵌合胚胎，证明了利用猪的身体生产出人类器官是可行的。因此，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，敲除掉猪受精卵中一些决定器官生成的关键基因，使得这些猪的胰脏、心脏等器官不能正常发育，形成了器官“空位”，然后将人类的多能干细胞注射到上述经基因编辑的猪胚胎中，构建猪与人嵌合胚胎，有望使猪长出含有人类细胞的器官。利用多能干细胞嵌合动物胚胎生产含有功能性人类器官可以减轻或消除异种器官移植所面临的最大障碍，为器官移植提供新的出路。

猪不仅是重要的经济动物，其作为人源化器官生产的供体有很多优势：猪的生理代谢过程都与人类更加接近；猪来源广、产仔多、繁殖周期短、生长速度快；猪的遗传背景研究清楚，且无太多的伦理争论。虽然猪是培育人源化器官的优良动物，但是尚不清楚哺乳动物猪器官发育的细胞图谱。尚未见在猪中进行谱系示踪技术的报道。

因此，开发一种简便、体外可调控的，直接用于显微注射动物受精卵的、可在体内外同时进行单细胞水平上的谱系示踪方法，是研究猪组织器官发育和利用猪解决器官移植短缺的关键。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种谱系示踪方法，用于解决现有技术中的问题。

为了实现本发明目的。第一方面，本发明提供了一种基于CRISPR/Cas12a技术的特异靶向猪Rosa26基因的crRNA，crRNA的序列如SEQ ID NO.:1所示。

具体地，所述crRNA的序列也可理解为crRNA的编码序列。

术语“编码序列”“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。

第二方面，本发明提供了一种含有上述crRNA的载体。

优选地，所述载体是CRISPR/Cas12a打靶载体，也即载体上携带有Cas12a的编码基因。所述Cas12a的编码基因是本领域所公知的。

更优选地，所述载体上还可以包括转录表达所必须的启动子、终止子、抗性基因、核定位序列(NLS)等载体常见元件。

优选地，所述载体包括质粒(表达质粒、克隆载体、小环、微载体、双微小染色体)、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。

如本文所用，术语“载体”是指包含完整复制子的非染色体核酸，使得当置于允许的细胞内时，载体可以被复制，例如通过转化过程。

第三方面，本发明提供了一种供体载体，所述供体载体含有用于靶向Rosa26打靶位点的左、右同源臂序列，所述左同源臂的DNA序列如SEQ ID NO.:2所示，所述右同源臂的DNA序列如SEQ ID NO.:3所示。

更具体地，所述左、右同源臂序列克隆自猪的基因组。

优选地，左、右同源臂之间可连接任意需要插入到猪基因组中的目标序列，如本发明具体实施例的目标序列包括Cas9的编码基因、EGFP的编码基因等。

更优选地，所述左、右同源臂序列之间还连接有任意一种元件：Tet应答元件、目的基因Cas9、EGFP、转录终止信号bGH poly(A)signal。所述EGFP-P2A-Cas9的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

优选地，所述供体载体上序列依次为左同源臂(SEQ ID NO.:2)、Tet应答元件(SEQID NO.:5)、EGFP-P2A-Cas9(SEQ ID NO.:4)、TRE3G(SEQ ID NO.:6)、右同源臂(SEQ IDNO.:3)。

本发明所述EGFP即增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein)。在另一种具体实施例中，所述EGFP可以由本领域所公知的任意荧光蛋白所代替，示例性的，本领域所公知的荧光蛋白包括：GFP、tdTomato、YFP、mApple、mCherry、YPet、CyPet等。

本发明所述Tet应答元件即四环素(Tetracycline，Tet)的表达基因，其可以受四环素衍生物(例如多西环素/强力霉素Dox)的诱导而表达，可实现基因编辑体系的开启或关闭。

第四方面，本发明提供了一种基于CRISPR/Cas12a技术的猪Rosa26基因编辑载体组合物，所述载体组合物包括上述CRISPR/Cas12a打靶载体和供体载体。

第五方面，本发明提供了一组用于猪的谱系示踪载体组合物，所述谱系示踪载体组合物中包含由不同整合条形码标记的待编辑序列。

优选地，所述基因编辑载体组合物中可以由1-100个不同的整合条形码进行标记，根据需求可以具体地选择10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个；本发明具体实施例中优选了40种整合条形码，实现了谱系示踪的功能。

更具体地，所述谱系示踪载体组合物中包括40个载体，所述40个载体中每个载体上含有PB转座子，同时每个载体上还含有相同的Cas9编辑区和各自不同的整合条形码；

所述Cas9编辑区的序列如SEQ ID NO.:6所示；所述Cas9编辑区的组成是whiteB-bri1-bam3-whiteL-ade2-bGH poly(A)signal-mU6-ade2 sgRNA-hU6-bam3sgRNA-bU6-whiteB sgRNA。

其中，所述whiteB sgRNA靶向的是上述组成中的whiteB基因；所述bam3sgRNA靶向的是上述组成中的bam3基因；所述ade2 sgRNA靶向的是上述组成中的ade2基因。

所述整合条形码包括以下任意一种或多种：GTCAGATG、TGATGTGA、CTGGAGAG、TGGACCCT、AGTGCTAC、GTTCGTAG、TTATCATT、CGCACATA、GTGCTGTC、AGCCGGCG、GGCGCTGC、GCAGTGTC、TAAATTAA、GGTTTCAG、CGTACTCG、CGGTCTGA、CACAGCCA、ATGTGTAT、TAAATTGG、GCTATTTG、AGGACAAA、ATTGCTTG、GTCCTAGG、TTAGAGTT、TCATCGGG、TATGAGGG、TAACTTGG、GCATAGTT、ACCGATCA、AATGTATT、GTTGCTAC、TGACTCAG、CCGTAGGG、CACTGGAT、TGGAGTCC、AATTATTT、GTGATGCC、CGACAGTG、TACTATTC、TGGCGGGG。

具体地，所述整合条形码的序列如本发明表1记载。

所述Cas9编辑区和各自不同的整合条形码的连接方式是：整合条形码-Cas9编辑区。

本发明所述PB转座子属于DNA型转座子，是PB转座系统的必要成分。Piggy Bac(PB)转座系统凭借其转座效率高，宿主范围广等优势，近年来已在哺乳动物细胞中得到了广泛的应用。进一步，本发明所述谱系示踪载体通过PB转座子以多拷贝形式传递。

优选地，所述谱系示踪载体组合物中的载体上还带有荧光蛋白的编码基因，便于通过检测荧光蛋白的表达情况观察基因表达的情况。

更具体地，所述谱系示踪载体组合物中的载体上携带的是红色荧光蛋白tdTmomato。所述红色荧光蛋白tdTmomato还可以由其他荧光蛋白所替代。

本发明的第六个方面提供了一种可用于显微注射受精卵的载体体系，所述载体体系包含本发明第四方面所述基因编辑载体组合物和第五方面所述谱系示踪载体组合物。

应用所述载体体系直接注射猪受精卵可以实现基于四环素衍生物调控的Cas9编辑，具有可诱导、可稳定表达的特点。

优选地，所述四环素衍生物包括但不限于多西环素/强力霉素(dox)。

另一方面，本发明提供了以上载体体系的应用。本发明所述载体体系可以直接转染目标细胞，随着发育对目标细胞进行追踪，并通过Dox诱导来控制Cas12a基因的表达。

另一方面，本发明提供了一种针对猪的谱系示踪的方法，所述方法包括将以下成分显微注射到目标细胞：

优选地，所述目标细胞是受精卵或非受精卵

1)10ng/μl供体载体；

2)100ng/μl的Cas12a mRNA；

3)100ng/μl的crRNA；更具体地，本发明第一方面所述crRNA，其序列如SEQ IDNO.:1所示

4)第五方面所述谱系示踪载体组合物；

5)100ng/μl的PB(PB转座酶)mRNA；

以上所述Cas12a和PB的编码序列都是本领域公知的，相应的mRNA也是公知的。

更具体地，所述方法所针对的是研究猪从早期胚胎到器官形成期的发育情况。

具体地，所述方法具体包括以下步骤：

步骤1：制备以下质粒：制备待导入的CRISPR/Cas12a打靶质粒、同源重组模板载体和40个谱系示踪载体；

步骤2：37℃水浴酶切同源重组载体和40个谱系示踪载体；

步骤3：PB转座酶、cas12a酶、crRNA的体外转录；

步骤4：对供体猪进行同期发情、超速排卵以及人工授精；

步骤5：从供体猪输卵管冲取受精卵；

步骤6：待导入的DNA模版和RNA按比例混合均匀，显微注射受精卵；

步骤7：受精卵于体外培养，加入Dox溶液进行调控，Dox通过结合rtTA3G诱导Cas9的表达，Cas9在crRNA的引导下介导条形码基因的编辑。

优选地，本发明提供的谱系示踪载体体系的应用可基于Dox调控在体外任意胚胎阶段实现可诱导的单细胞水平谱系示踪和基因表达谱分析，当Dox存在时使得Cas9表达，靶基因被修饰，修饰的靶基因可作为特异的谱系示踪标签。

优选地，所述方法还包括对以上处理得到的胚胎进行测序，根据测序结果形成细胞谱系。

另一方面，本发明提供了以上方法制备得到的细胞、细胞群体、动物。

优选地，所述细胞包括受精卵、胚胎细胞；

优选地，所述细胞群体包括胚胎；更具体地，早期胚胎，囊胚时期的胚胎。

优选地，所述细胞的来源是哺乳动物，更具体地是猪。

同时，本发明提供了以上细胞、细胞群体、动物在研究动物发育中的应用。在本发明中所述动物优选为猪。

附图说明

图1为本发明所述猪Rosa26基因打靶载体图谱。

图2为本发明所述猪Rosa26基因CRISPR/Cas12a基因编辑打靶载体及同源重组载体示意图。

图3为本发明所述谱系示踪载体的结构示意图。

图4是酶切电泳图，A是同源重组载体酶切电泳图，B是纯化得到的同源重组片段，大小为10654bp，C是谱系示踪载体酶切得到的片段，大小为6072bp。

图5为本发明实施例3中pig Rosa26 crRNA、PB酶mRNA、Cas12a mRNA体外转录电泳图。

图6为本发明显微注射后荧光蛋白的检测结果图。

图7为本发明对猪进行谱系示踪结果分析图，图A为3个剪切位点(Site1-3依次对应于ade2、bam3、whiteB)中不同突变的数量的统计图，图B为依据累积突变成功构建的细胞谱系图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

打靶载体图谱如图1所示，打靶位点位于猪Rosa26基因中，pig-Rosa26crRNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

供体载体的部分结构如图2所示，供体载体的结构主要包括上游同源臂5-LHA、EGFP-P2A-Cas9、下游同源臂3-RHA，其中上、下游同源臂从猪基因组上克隆。左、右同源臂的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，长度分别为961bp和1009bp，EGFP-P2A-Cas9核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，同源重组载体片段序列如SEQ ID NO:5所示。

谱系示踪载体以PB(PB转座子)载体为骨架，插入谱系示踪序列和40个不同的整合条形码片段(intBC)，谱系示踪序列和整合条形码片段在本发明中也称为谱系示踪片段，其结构如图3所示。谱系示踪载体由2部分组成，第一部分的目标位点由整合条形码intBC和三个用于Cas9编辑的靶点组成，此序列插入到红色荧光tdTomato的3’UTR中。第二部分为编码三个独立转录的sgRNA(由不同的启动子mU6、hU6和bU6控制)，以允许记录多个不同的信号。

(1)谱系示踪序列whiteB(位点3)-bri1-bam3(位点2)-whiteL-ade2(位点1)-bGHpoly(A)signal-mU6-ade2 sgRNA-hU6-bam3 sgRNA-bU6-whiteB sgRNA由通用生物公司合成，合成序列大小2132bp，结构示意图如图3所示，编码上述序列的DNA序列如SEQ ID NO:6所示。

(2)用限制性内切酶AscI和NotI酶切原PB载体质粒pPL149-PB-EF1a-tdTomato-Puro，回收得到6316bp。

(3)将(2)回收得到的pPL149-PB-EF1a-tdTomato-Puro片段和(1)合成的谱系示踪序列进行连接，连接体系：T4 Buffer 2μl，酶切得到的PB载体片段0.02pmol，谱系示踪序列0.06pmol，T4 DNA Ligase 1μl，补水至20μl，16℃过夜连接，得到无整合条形码的谱系示踪载体。

(4)设计40中整合条形码，具体序列见表1。在整合条形码5’端添加ggccgc序列，3’端添加a，即为F引物；而将整合条形码形成反向互补序列后，在5’端添加ctagt，3端’添加gc，即为R引物，以表1中序号为1的整合条形码为例，其F引物为ggccgcGTCAGATGa(intBC-F1，如SEQ ID NO.:8)，其R序列为ctagtCATCTGACgc(intBC-R1，如SEQ ID NO.:9)，其余整合条形码的引物设计同理。

引物由北京擎科生物公司合成，40个F和R引物的连接体系为T4 Buffer 1μl，IntBC1～40-F 2.5μl，IntBC1～40-R 2.5μl，补水至10μl；95℃，5分钟，结束后稀释50倍，备用。

(5)无整合条形码的谱系示踪载体酶切：10*NEBuffer 5μl，无整合条形码的谱系示踪质粒3ug，SpeI 2μl，NotI 2μl，补水至50μl，回收酶切后片段8462bp。

(6)构建40个带有整合条形码的谱系示踪载体：利用T4 DNA Ligase将酶切后无整合条形码的谱系示踪载体片段8462bp与步骤(4)的40个intBC片段分别进行连接，得到40个带有整合条形码intBC的谱系示踪质粒。

本发明所使用的40种整合条形码如表1所示：

表1、40种整合条形码

将实施例1所构建的同源重组载体进行酶切，具体酶切体系如下：10*NEBuffer 10μl，质粒20μg，NsiI 5μl，SalI 5μl，补水至100μl，酶切后片段10654bp，酶切电泳结果见图4所示。

将实施例1的带有40个不同整合条形码的谱系示踪质粒进行酶切，具体酶切体系如下：10*NEBuffer 5μl，质粒3μg，PspXI 2μl，EcoRI 2μl，补水至50μl，酶切后片段6072bp，酶切电泳结果如图5所示。

酶切产物纯化：配制合适浓度的琼脂糖凝胶，电泳分离DNA片段。当DNA片段分离后，将凝胶置于紫外灯下，快速切下含目的DNA片段的凝胶，回收纯化DNA，操作如下：

(1)在紫外灯下分离目的凝胶片段，置于干净EP管中，称其质量。胶块体积换算公式：100μl＝l00mg。

(2)向EP管内加入3倍体积的Buffer GDP，震荡混合后放入50℃水浴锅中使胶块充分溶解，时间为7-10min。

(3)取出平衡柱HiPure DNA Column和收集管Collection Tube，并按要求正确安置好。将(2)中溶液转入HiPure DNA Column管内，而后12000rpm离心1min，重复离心一次。

(4)吸取150μl Buffer GDP加入到HiPure DNA Column中，静止1分钟，离心条件同上。

(5)吸取已添加过无水乙醇Buffer DW2 500μl加入HiPure DNAColumn，离心条件同上，弃滤液，重复离心一次。

(6)继续离心2min，条件不变。

(7)取一新的Collection Tube，将HiPure DNA Column安放好，并向HiPure DNAColumn中加入Rnase-free ddH2O 25μl，室温条件下静置2min。

(8)12000rpm离心1min收集DNA，-20℃保存。

图4的实验结果酶切成功，获得的目标序列的条带单一，可用于之后的实验。

将实施例1构建得到的打靶载体、以及PB酶、cas12a进行体外转录，体外转录引物序列见表2，具体转录RNA情况见图5。

表2、体外转录引物序列

继续将以上转录得到的crRNA、PB mRNA、Cas12a mRNA，以及同源重组载体片段、40个谱系示踪片段共同注射猪受精卵。具体操作如下：

(1)供体猪子宫角输精24小时后，采用手术法将子宫暴露于窗口表面，从输卵管冲取出受精卵并记录两侧卵巢黄体的发育情况。

(2)挑选透明带清晰、胞质均匀于早期可见的受精卵进行显微注射，将注射的体外转录获得的Cas12a mRNA、PB mRNA、crRNA稀释到100ng/μl，pig Rosa26 honor稀释到10ng/μl，每个40个谱系示踪片段均稀释到10ng/μl，进行显微注射，显微注射后，对荧光进行检测。

(3)受精卵于体外培养，加入Dox(Dox的工作浓度为4μg/ml)溶液培养至相应时间。

将上述受精卵继续培养发育至2/4细胞期间，经荧光显微镜拍照，可见明显的荧光，具体情况如图6所示，依据检查结果显示成功在猪早期胚胎导入CRISPR/Cas12a打靶体系和谱系示踪载体体系。

进一步检测三个打靶位点的打靶情况，结果如图7所示，三个打靶位点均累积大量突变，依据累积突变成功构建哺乳动物猪细胞谱系。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种Dox调控的记录猪组织分化与器官发生的谱系示踪技术

<141> 2022-06-17

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aacaccgtaa tttctactct tgtagattct atattcccac agtcttgagt aatttctact 60

cttgtagatc catctccacc ccactataat ta 92

<210> 2

<211> 961

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcttcctgct cttctcttgt cactgattgg ccgcttctcc tcccgccgtg tgtgaaaaca 60

caaatggcgt gttttggttg gagtaaagct cctgtcagtt acagcctcgg gagtgcgcag 120

cctcccagga actctcgcat tgccccctgg gtgggtaggt aggtggggtg gagagagctg 180

cacaagaggg cgctgtcggc ctcctgcggg gggaggggag ggtcagtgaa agtggctccc 240

gcgcgggcgt cctgccaccc tcccctccgg gggagtcggt ttacccgccg cctgctcggc 300

tttggtatct gattggctgc tgaagtcctg ggaacggccc cttgttattg gcttgggtcc 360

caaatgagcg aaaccactac gcgagtcggc agggaggcgg tctttggtac ggccctcccc 420

gaggccagcg ccgcagtgtc tggcccctcg cccctgcgca acgtggcagg aagcgcgcgc 480

aggaggcggg ggcgggctgc cgggccgagg cttctgggtg gtggtgactg cggctccgcc 540

ctgggcgtcc gccgcctgaa ggacgagact agctctacct gctctcggac ccgtgggggt 600

ggggggtgga ggaagtgagt ggggggtcgg tcctgctggc ttgtgggtgg gaggcgcatg 660

ttctccaaaa acccgcgcga gctgcaatcc tgagggagct gcagtggagg aggcggagag 720

aaggcgcacc cttctccgca gggggagggg agtgccgcaa tacctttatg ggagttctct 780

gctgcctcct tttcctaagg accgccctgg gcctagaaaa atccctccct cccccgcgat 840

ctcgtcatcg cctccatgtc agtttgctcc ttctcgatta tgggcgggat tcttttgccc 900

tggcttaacc tgattcttgg gcgttgtcct gcaggggatt gagcaggtgt acgaggacga 960

g 961

<210> 3

<211> 1009

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttatgcattg agactgcgtg ttattactaa agatctttgt gtcgcaattt cctgatgaag 60

ggagataggt taaaaagcac ggatctactg agttttacag tcatcccatt tgtagacttt 120

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ctcacttgca tccttacggt cagataactc tcactcatac tttaagccca ttttgtttgt 240

tgtacttgct catccagtcc cagacatagc attggctttc tcctcacctg ttttaggtag 300

ccagcaagtc atgaaatcag ataagttcca ccaccaatta acactaccca tcttgagcat 360

aggcccaaca gtgcatttat tcctcattta ctgatgttcg tgaatattta ccttgatttt 420

catttttttc tttttcttaa gctgggattt tactcctgac cctattcaca gtcagatgat 480

cttgactacc actgcgattg gacctgaggt tcagcaatac tcccctttat gtcttttgaa 540

tacttttcaa taaatctgtt tgtattttca ttagttagta actgagctca gttgccgtaa 600

tgctaatagc ttccaaacta gtgtctctgt ctccagtatc tgataaatct taggtgttgc 660

tgggacagtt gtcctaaaat taagataaag catgaaaata actgacacaa ctccattact 720

ggctcctaac tacttaaaca atgcattcta tcttcacaaa tgtgaaaaag gagttccctc 780

agtggactaa ccttatcttt tctcaacacc tttttctttg cacaattttc cacacatgcc 840

tacaaaaagt acttttctgc tcaagtcaca ctgagttgat tgctatttac caaaatcaaa 900

gtaacattat cagatctctg tagggtggtt ccctctggaa tgctaccctc catagtcctt 960

acccttcaag taaagagcat taattatagt ggggtggaga tgggaaatt 1009

<210> 4

<211> 5043

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttgtacagc tcgtccatgc cgagagtgat cccggcggcg gtcacgaact ccagcaggac 60

catgtgatcg cgcttctcgt tggggtcttt gctcagggcg gactgggtgc tcaggtagtg 120

gttgtcgggc agcagcacgg ggccgtcgcc gatgggggtg ttctgctggt agtggtcggc 180

gagctgcacg ctgccgtcct cgatgttgtg gcggatcttg aagttcacct tgatgccgtt 240

cttctgcttg tcggccatga tatagacgtt gtggctgttg tagttgtact ccagcttgtg 300

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cagctcgacc aggatgggca ccaccccggt gaacagctcc tcgcccttgc tcaccatagg 720

tccagggttc tcctccacgt ctccagcctg cttcagcagg ctgaagttag tagccttttt 780

cttttttgcc tggccggcct ttttcgtggc cgccggcctt ttgtcgcctc ccagctgaga 840

caggtcgatc cgtgtctcgt acaggccggt gatgctctgg tggatcaggg tggcgtccag 900

cacctctttg gtgctggtgt acctcttccg gtcgatggtg gtgtcaaagt acttgaaggc 960

ggcaggggct cccagattgg tcagggtaaa caggtggatg atattctcgg cctgctctct 1020

gatgggctta tcccggtgct tgttgtaggc ggacagcact ttgtccagat tagcgtcggc 1080

caggatcact ctcttggaga actcgctgat ctgctcgatg atctcgtcca ggtagtgctt 1140

gtgctgttcc acaaacagct gtttctgctc attatcctcg ggggagccct tcagcttctc 1200

atagtggctg gccaggtaca ggaagttcac atatttggag ggcagggcca gttcgtttcc 1260

cttctgcagt tcgccggcag aggccagcat tctcttccgg ccgttttcca gctcgaacag 1320

ggagtactta ggcagcttga tgatcaggtc ctttttcact tctttgtagc ccttggcttc 1380

cagaaagtcg atgggattct tctcgaagct gcttctttcc atgatggtga tccccagcag 1440

ctctttcaca ctcttcagtt tcttggactt gcccttttcc actttggcca ccaccagcac 1500

agaataggcc acggtggggc tgtcgaagcc gccgtacttc ttagggtccc agtccttctt 1560

tctggcgatc agcttatcgc tgttcctctt gggcaggata gactctttgc tgaagccgcc 1620

tgtctgcacc tcggtctttt tcacgatatt cacttggggc atgctcagca ctttccgcac 1680

ggtggcaaaa tcccggccct tatcccacac gatctccccg gtttcgccgt ttgtctcgat 1740

cagaggccgc ttccggatct cgccgttggc cagggtaatc tcggtcttga aaaagttcat 1800

gatgttgctg tagaagaagt acttggcggt agccttgccg atttcctgct cgctcttggc 1860

gatcatcttc cgcacgtcgt acaccttgta gtcgccgtac acgaactcgc tttccagctt 1920

agggtacttt ttgatcaggg cggttcccac gacggcgttc aggtaggcgt cgtgggcgtg 1980

gtggtagttg ttgatctcgc gcactttgta aaactggaaa tccttccgga aatcggacac 2040

cagcttggac ttcagggtga tcactttcac ttcccggatc agcttgtcat tctcgtcgta 2100

cttagtgttc atccgggagt ccaggatctg tgccacgtgc tttgtgatct gccgggtttc 2160

caccagctgt ctcttgatga agccggcctt atccagttcg ctcaggccgc ctctctcggc 2220

cttggtcaga ttgtcgaact ttctctgggt aatcagcttg gcgttcagca gctgccgcca 2280

gtagttcttc atcttcttca cgacctcttc ggagggcacg ttgtcgctct tgccccggtt 2340

cttgtcgctt ctggtcagca ccttgttgtc gatggagtcg tccttcagaa agctctgagg 2400

cacgatatgg tccacatcgt agtcggacag ccggttgatg tccagttcct ggtccacgta 2460

catatcccgc ccattctgca ggtagtacag gtacagcttc tcgttctgca gctgggtgtt 2520

ttccacgggg tgttctttca ggatctggct gcccagctct ttgatgccct cttcgatccg 2580

cttcattctc tcgcggctgt tcttctgtcc cttctgggtg gtctggttct ctctggccat 2640

ttcgatcacg atgttctcgg gcttgtgccg gcccatcact ttcacgagct cgtccaccac 2700

cttcactgtc tgcaggatgc ccttcttaat ggcggggctg ccggccagat tggcaatgtg 2760

ctcgtgcagg ctatcgccct ggccggacac ctgggctttc tggatgtcct ctttaaaggt 2820

caggctgtcg tcgtggatca gctgcatgaa gtttctgttg gcgaagccgt cggacttcag 2880

gaaatccagg attgtcttgc cggactgctt gtcccggatg ccgttgatca gcttccggct 2940

cagcctgccc cagccggtgt atctccgccg cttcagctgc ttcatcactt tgtcgtcgaa 3000

caggtgggca taggttttca gccgttcctc gatcatctct ctgtcctcaa acagtgtcag 3060

ggtcagcacg atatcttcca gaatgtcctc gttttcctca ttgtccagga agtccttgtc 3120

cttgataatt ttcagcagat cgtggtatgt gcccagggag gcgttgaacc gatcttccac 3180

gccggagatt tccacggagt cgaagcactc gattttcttg aagtagtcct ctttcagctg 3240

cttcacggtc actttccggt tggtcttgaa cagcaggtcc acgatggcct ttttctgctc 3300

gccgctcagg aaggcgggct ttctcattcc ctcggtcacg tatttcactt tggtcagctc 3360

gttatacacg gtgaagtact cgtacagcag gctgtgcttg ggcagcacct tctcgttggg 3420

caggttctta tcgaagttgg tcatccgctc gatgaagctc tgggcggaag cgcccttgtc 3480

caccacttcc tcgaagttcc agggggtgat ggtttcctcg ctctttctgg tcatccaggc 3540

gaatctgctg tttcccctgg ccagagggcc cacgtagtag gggatgcgga aggtcaggat 3600

cttctcgatc ttttcccggt tgtccttcag gaatgggtaa aaatcttcct gccgccgcag 3660

aatggcgtgc agctctccca ggtggatctg gtgggggatg ctgccgttgt cgaaggtccg 3720

ctgcttccgc agcaggtcct ctctgttcag cttcacgagc agttcctcgg tgccgtccat 3780

cttttccagg atgggcttga tgaacttgta gaactcttcc tggctggctc cgccgtcaat 3840

gtagccggcg tagccgttct tgctctggtc gaagaaaatc tctttgtact tctcaggcag 3900

ctgctgccgc acgagagctt tcagcagggt caggtcctgg tggtgctcgt cgtatctctt 3960

gatcatagag gcgctcaggg gggccttggt gatctcggtg ttcactctca ggatgtcgct 4020

cagcaggatg gcgtcggaca ggttcttggc ggccagaaac aggtcggcgt actggtcgcc 4080

gatctgggcc agcaggttgt ccaggtcgtc gtcgtaggtg tccttgctca gctgcagttt 4140

ggcatcctcg gccaggtcga agttgctctt gaagttgggg gtcaggccca ggctcagggc 4200

aatcaggttt ccgaacaggc cattcttctt ctcgccgggc agctgggcga tcagattttc 4260

cagccgtctg ctcttgctca gtctggcaga caggatggcc ttggcgtcca cgccgctggc 4320

gttgatgggg ttttcctcga acagctggtt gtaggtctgc accagctgga tgaacagctt 4380

gtccacgtcg ctgttgtcgg ggttcaggtc gccctcgatc aggaagtggc cccggaactt 4440

gatcatgtgg gccagggcca gatagatcag ccgcaggtcg gccttgtcgg tgctgtccac 4500

cagtttcttt ctcaggtggt agatggtggg gtacttctcg tggtaggcca cctcgtccac 4560

gatgttgccg aagatggggt gccgctcgtg cttcttatcc tcttccacca ggaaggactc 4620

ttccagtctg tggaagaagc tgtcgtccac cttggccatc tcgttgctga agatctcttg 4680

cagatagcag atccggttct tccgtctggt gtatcttctt ctggcggttc tcttcagccg 4740

ggtggcctcg gctgtttcgc cgctgtcgaa cagcagggct ccgatcaggt tcttcttgat 4800

gctgtgccgg tcggtgttgc ccagcacctt gaatttcttg ctgggcacct tgtactcgtc 4860

ggtgatcacg gcccagccca cagagttggt gccgatgtcc aggccgatgc tgtacttctt 4920

gtcggctgct gggactccgt ggataccgac cttccgcttc ttctttgggg ccatcttatc 4980

gtcatcgtct ttgtaatcaa tatcatgatc cttgtagtct ccgtcgtggt ccttatagtc 5040

cat 5043

<210> 5

<211> 3097

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggcgcgccgc gattaaggga tctgtagggc ggactagtct agggcgcagt agtccagggt 60

ttccttgatg atgtcatact tatcctgtcc cttttttttc cacagctcgc ggttgaggac 120

aaactcttcg cggtctttcc agtaagaatt cctcgatcga gggacctaat ttaagggtaa 180

gcttgcagcc aatgtcgacg ccaccatgag ccggctggac aagagcaaag tgatcaacag 240

cgccctggaa ctgctgaacg gcgtgggcat cgagggcctg accacccgga agctggccca 300

gaaactgggc gtggaacagc ccaccctgta ctggcacgtg aagaacaagc gggccctgct 360

ggacgccctg cccatcgaga tgctggaccg gcaccacacc cacagctgcc ctctggaagg 420

cgagagctgg caggacttcc tgcggaacaa cgccaagagc tacagatgcg ccctgctgag 480

ccaccgggac ggcgccaaag tgcacctggg caccagaccc accgagaagc agtacgagac 540

actggaaaac cagctggcct tcctgtgcca gcagggcttc agcctggaaa acgccctgta 600

cgccctgagc gccgtgggcc acttcaccct gggctgcgtg ctggaagaac aggaacacca 660

ggtcgccaaa gaggaaagag agacacccac caccgacagc atgccccccc tgctgaagca 720

ggccatcgag ctgttcgaca gacagggcgc cgagcccgcc ttcctgttcg gcctggaact 780

gatcatctgc ggcctcgaga agcagctgaa gtgcgagagc ggcggaccca ccgacgccct 840

ggacgacttc gacctggaca tgctgcccgc cgatgccctg gatgattttg atctggatat 900

gctccctgct gacgctctcg atgacttcga tctcgatatg ctgccaggct aacccgggga 960

attctaacta gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 1020

gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 1080

taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 1140

ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaga atagcaggca tgctggggaa 1200

cgcgtgaggg cctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac aaggctgtta 1260

gagagataat tggaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa aatacgtgac 1320

gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg cagttttaaa attatgtttt aaaatggact 1380

atcatatgct taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt ggctttatat atcttgtgga 1440

aaggacgaaa caccgggtct tcactggatc cggtaccgaa ttcgcttact aaaagccaga 1500

taacagtatg cgtatttgcg cgctgatttt tgcggtataa gaatatatac tgatatgtat 1560

acccgaagta tgtcaaaaag aggtgtgctt ctagaatgca gtttaaggtt tacacctata 1620

aaagagagag ccgttatcgt ctgtttgtgg atgtacagag tgatattatt gacacgcccg 1680

ggcgacggat agtgatcccc ctggccagtg cacgtctgct gtcagataaa gtctcccgtg 1740

aactttaccc ggtggtgcat atcggggatg aaagctggcg catgatgacc accgatatgg 1800

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acatcaaaaa cgccattaac ctgatgttct ggggaatata gaattcgcgg aagacctgtt 1920

ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc 1980

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tcttaagcca cgcccacaca tttcagtgat ctgtcgaatc ggatctgcta tggcagggcc 2100

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tttcagttag cctcccccgt ttaaactcat tactaaccgg tcaggcaccg ggcttgcggg 2400

tcatgcacca ggtgcgcggt ccttcgggca cctcgacgtc ggcggtgacg gtgaagccga 2460

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ccaggaggcc ttccatctgt tgctgcgcgg ccagccggga accgctcaac tcggccatgc 2700

gcgggccgat ctcggcgaac accgcccccg cttcgacgct ctccggcgtg gtccagaccg 2760

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gcgtggcggg gtagtcggcg aacgcggcgg cgagggtgcg tacggccctg gggacgtcgt 2940

cgcgggtggc gaggcgcacc gtgggcttgt actcggtcat tgggccagga ttctcctcga 3000

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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cttctttggt gactcgaact cgcttccgtc ggctgtccgt ttcatggtgg cggctctccc 120

tatagtgagt cgtattagcg gccgcctcga ctgaatgtcg ctagcttacg gaaagttggt 180

ataagacaaa agtgttgtgg aattgctcca ggcgatctga cggttcacta aacgagctct 240

gcttttatag gcgcccaccg tacacgccta aagcttatac gttctctatc actgataggg 300

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tcactgatag ggagtaaact ggtcatacgt tctctatcac tgatagggag taaactcctt 420

atacgttctc tatcactgat agggagtaaa gtctgcatac gttctctatc actgataggg 480

agtaaactct tcatacgttc tctatcactg atagggagta aagccaactc catatgttaa 540

ttaa 544

<210> 7

<211> 2132

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atcccggcaa tgggccaaga ggatcaggag ctattaattc gcggaggcag caaacaccca 60

tctgccgagc atttgggtca taacgatatc tctgggactt tggtacagct ttacttaggt 120

tactacaacg attaccgcgg tgggatacct gcagatttcg ggagaccaaa aactacggca 180

cgctccggac tccaatgacc acgttaatgg ctccttttcc aatcctcttg atatcgaaaa 240

actagctgaa aaatgtgatg acgcgtctgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 300

cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 360

aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 420

ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agagaatagc aggcatgctg gggagcgatc 480

gccagatccg attcgacaga tcactgaaat gtgtgggcgt ggcttaaggc gtcaggtggc 540

acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acaaagcttg 600

atccgacgcc gccatctcta ggcccgcgcc ggccccctcg cacagacttg tgggagaagc 660

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gttcctcaga ggaactgaca agcaccctaa catcctattg gaggctcact cacgtttttg 1080

atatcaagag gattggaaag ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc 1140

gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt ttatctgcaa tgctccaacc 1200

ttaaggtcgg gcaggaaatt taaatgaggg cctatttccc atgattcctt catatttgca 1260

tatacgatac aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat 1320

attagtacaa aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg cagttttaaa 1380

attatgtttt aaaatggact atcatatgct taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt 1440

ggctttatat atcttgtgga aaggacgaaa caccggttac tacaacgatt accggtttta 1500

gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc 1560

gagtcggtgc tttttttagc attccaaatt ctacctctcg cgaagtagtt gcggggatca 1620

ccgcgctgcc gcgttcccct ccgccaagcg ctgcgaccga cccttgggca ttcagtcccg 1680

caggagcgca agaggctcct gagcaacgcg caccacgtga ccgagcttgt ctgcccgcgc 1740

agtccactag acagacgcgc agaggtcggg cgggcctagg gccaatttcc catggttccc 1800

ttcatttgca tatatgatgt aataaggtta tggagactat taaacttagc cctaatcaaa 1860

ctatatgatg ataatgtgtg tggtacaaaa ggtcataact tattatatac tttgaaactt 1920

aaaaaagggt tacagtttag tcaccataac tgtaaaattt tttctattct tagctttata 1980

tagttcttga gaggccatgt ttatcgtgct cgcttcggca gcacatatac taaaagcagg 2040

agctattaat tcgcgggttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt 2100

atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gc 2132

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<212> DNA

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