一种饲料添加剂、制备方法及其在制备治疗猫传染性腹膜炎药物中的应用

摘要

本发明提供了一种饲料添加剂、制备方法及其在制备治疗猫传染性腹膜炎药物中的应用，属于饲料添加剂技术领域。本发明通过采用特定质量份数的苦瓜、大蒜、鱼腥草、香蕉皮、绿茶、大米和蜂蜜作为原料，制得饲料添加剂，克服了现有技术中猫传染性腹膜炎治疗药物稀缺的问题。本发明原料成本较低，且容易获取，并意外发现该饲料添加剂具有治疗猫传染性腹膜炎的效果，不会出现药物残留，不仅没有细胞毒性，还能抑制FIPV病毒的复制，在体外实验中具有抗FIPV病毒的作用，为猫传染性腹膜炎的治疗提供了新思路。

说明书

技术领域

本发明涉及饲料添加剂技术领域，尤其涉及一种饲料添加剂、制备方法及其在制备治疗猫传染性腹膜炎药物中的应用。

背景技术

猫传染性腹膜炎(Feline Infectious Peritonitis)是由猫传染性腹膜炎病毒引起的一种慢性、渐进性、致死性传染病，以腹膜炎，大量腹水积聚及致死率较高为主要特征。猫传染性腹膜炎病毒主要感染0.5～5岁的猫，12月龄以下的猫易感性增强，以纯种猫，多只猫混养及流浪猫更易感，病程可能是突发性(幼猫经常发生)或缓慢性且持续数周。

目前治疗猫传腹的药物有抑制免疫及抗炎症作用的高剂量类固醇，细胞毒性药物；预防二次细菌感染的广谱抗生素、抗病毒药物；以及支持疗法：强制进食(以食道或胃管)，输液以矫正脱水，胸腔穿刺术以舒缓呼吸症状等，但均非直接治愈手段。猫传腹以前的死亡率高达95％，一度被称作猫咪绝症，现有的猫传腹药物主要是两种国外研发的药物，能够将猫传腹的治愈率从零提高到35％左右。但这两种药物的价格非常昂贵，且还未在国内上市，只能通过代购的渠道获得，市面上的造假情况也比较严重。因此，市场亟需一种对猫传腹具有治疗作用的产品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种饲料添加剂、制备方法及其在制备治疗猫传染性腹膜炎药物中的应用，以解决现有技术中猫传染性腹膜炎治疗药物稀缺的问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种饲料添加剂，由包含如下质量份数的原料制备得到：

苦瓜15～25份、大蒜15～25份、鱼腥草15～25份、香蕉皮5～15份、绿茶5～15份、大米2～7份、蜂蜜2～7份、水15～25份。

本发明还提供了上述饲料添加剂的制备方法，包含如下步骤：

将原料进行破碎，得到粉碎物料；

将粉碎物料与水混合，搅拌5～10天，得到混合物料；

将混合物料进行酶解，得到酶解物；

将酶解物静置12～15天，然后进行压榨，固液分离，收集液相组分；

将所述液相组分液静置1～3天，收集上清液并调节浓度，即得饲料添加剂。

优选的，所述破碎的粒径为40～60目。

优选的，所述搅拌的转速为40～60r/min。

优选的，所述酶解采用淀粉酶，所述淀粉酶与混合物料的重量比为0.1～0.3g:1kg；

所述酶解采用的温度为55～60℃。

优选的，所述酶解的时间为5～10天，所述酶解伴随搅拌，所述搅拌的转速为40～60r/min。

优选的，所述饲料添加剂的浓度为1～6mg/ml。

本发明还提供了上述饲料添加剂在制备治疗猫传染性腹膜炎药物中的应用。

本发明的技术效果和优点：

本发明采用常见廉价的原料以特定配比制备成饲料添加剂，原料成本较低，且容易获取。并意外发现该饲料添加剂具有治疗猫传染性腹膜炎的效果，不会出现药物残留，不仅没有细胞毒性，还能抑制FIPV病毒的复制，在体外实验中具有抗FIPV病毒的作用，为猫传染性腹膜炎的治疗提供了新思路。本发明通过实验证实了所述饲料添加剂在3mg/mL浓度下对CRFK细胞没有毒性，半数安全浓度(CC50)为6mg/mL；在mRNA水平上，本发明饲料添加剂能够使FIPV-79-1146的7b基因的表达量降低，说明其可以抑制FIPV病毒7b基因的复制，具有抗猫传染性腹膜炎病毒的作用。

附图说明

图1为不同浓度各组细胞指数图；

图2为不同浓度处理第60小时各组细胞指数统计图；

图3为qRT-PCR实验测量的FIPV病毒相关基因mRNA的表达量；

具体实施方式

本发明提供了一种饲料添加剂，由包含如下质量份数的原料制备得到：

苦瓜15～25份、大蒜15～25份、鱼腥草15～25份、香蕉皮5～15份、绿茶5～15份、大米2～7份、蜂蜜2～7份。

在本发明中，所述饲料添加剂的原料包括苦瓜15～25份，优选为18～22份，进一步优选为19～21份。

在本发明中，所述饲料添加剂的原料包括大蒜15～25份，优选为16～24份，进一步优选为18～23份。本发明对所述大蒜的种类没有特殊要求，紫皮蒜或白皮蒜均可。

在本发明中，所述饲料添加剂的原料包括鱼腥草15～25份，优选为17～23份，进一步优选为18～22份。

在本发明中，所述饲料添加剂的原料包括香蕉皮5～15份，优选为9～14份，进一步优选为10～12份。

在本发明中，所述饲料添加剂的原料包括绿茶5～15份，优选为7～13份，进一步优选为9～11份。

在本发明中，所述饲料添加剂的原料包括大米2～7份，优选为3～6份，进一步优选为4～5份。

在本发明中，所述饲料添加剂的原料包括蜂蜜2～7份，优选为3～6份，进一步优选为4～5份。

在本发明中，所述饲料添加剂的原料包括水15～25份，优选为18～22份，进一步优选为19～21份，所述水优选为去离子水。

在本发明中，所述饲料原料优选舍弃霉变、腐烂、变质的原料，避免杂菌污染。

本发明还提供了一种上述饲料添加剂的制备方法，包含如下步骤：

将原料进行破碎，得到粉碎物料；

将粉碎物料与水混合，搅拌5～10天，得到混合物料；

将混合物料进行酶解，得到酶解物；

将酶解物静置12～15天，然后进行压榨，固液分离，收集液相组分；

将所述液相组分静置1～3天，收集上清液并调节浓度，即得饲料添加剂。

在本发明中，所述破碎的粒径优选为40～60目，进一步优选为42～48目。

在本发明中，所述粉碎物料与水混合优选在304不锈钢酶化罐中进行；所述粉碎物料与水混合后搅拌5～10天，优选为6～8天；所述搅拌的转速优选为40～60r/min，进一步优选为45～55r/min；所述搅拌优选在常温、常压条件下进行。

在本发明中，所述酶解优选采用淀粉酶，所述淀粉酶与混合物料的重量比优选为0.1～0.3g:1kg，进一步优选为0.15～0.25g:1kg；所述酶解采用的温度优选为55～60℃，进一步优选为57～58℃；所述酶解的时间优选为5～10天，进一步优选为6～9天；所述酶解过程中伴随搅拌，所述搅拌的转速优选为40～60r/min，进一步优选为45～55r/min。

在本发明中，所述酶解结束后将酶解物进行静置12～15天，优选为13～14天，在静置过程中，优选加入山梨酸钾以防止污染杂菌，山梨酸钾用量为100kg原料添加0.5kg山梨酸钾。

在本发明中，所述液相组分进行静置1～3天，优选为静置1.5～2.5天；所述饲料添加剂的浓度优选为1～6mg/ml，进一步优选为2～4mg/ml，制得后优选采用密封容器保存，常温备用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

挑选无霉变、腐烂、变质的原料，将生姜、大蒜、洋葱去皮，所有原料洗净、控干。

取处理后的苦瓜200g、大蒜200g、鱼腥草200g、香蕉皮100g、绿茶100g、大米50g、蜂蜜50g，采用50目破碎机进行破碎，加入100ml水，转入304不绣钢酶化罐。

将物料以50r/min的速度，在常温、常压下连续搅拌7天，7天后加入0.15g淀粉酶混合搅拌，待酶解搅拌至第14天时，停止搅拌，静置14天，过程中防止污染杂菌。

将物料转入压榨机压榨，使其固液分离，将分离得到的液体转入储液罐，经过自然沉淀2天后取上清液，采用双蒸水调节浓度至3mg/ml，即得饲料添加剂，转入密封容器内，入库常温保存待用。

实施例2

挑选无霉变、腐烂、变质的原料，将生姜、大蒜、洋葱去皮，所有原料洗净、控干。

取处理后的苦瓜100g、大蒜100g、鱼腥草100g、香蕉皮50g、绿茶50g、大米25g、蜂蜜25g，采用50目破碎机进行破碎，加入50ml水，转入304不绣钢酶化罐。

将物料以50r/min的速度，在常温、常压下连续搅拌10天，10天后加入0.07g淀粉酶混合搅拌，待酶解搅拌至第16天时，停止搅拌，静置15天，过程中防止污染杂菌。

将物料转入压榨机压榨，使其固液分离，将分离得到的液体转入储液罐，经过自然沉淀2天后取上清液，调节浓度至6mg/ml，即得饲料添加剂，转入密封容器内，入库常温保存待用。

实施例3

挑选无霉变、腐烂、变质的原料，将生姜、大蒜、洋葱去皮，所有原料洗净、控干。

取处理后的苦瓜1kg、大蒜1kg、鱼腥草1kg、香蕉皮500g、绿茶500g、大米250g、蜂蜜250g，采用50目破碎机进行破碎，加入500ml水，转入304不绣钢酶化罐。

将物料以50r/min的速度，在常温、常压下连续搅拌5天，5天后加入0.75g淀粉酶混合搅拌，待酶解搅拌至第15天时，停止搅拌，静置13天，过程中防止污染杂菌。

将物料转入压榨机压榨，使其固液分离，将分离得到的液体转入储液罐，经过自然沉淀2天后取上清液，即得饲料添加剂，调节浓度至5mg/ml，转入密封容器内，入库常温保存待用。

实验例1实验准备

取实施例1所得调节浓度之前的上清液，测定浓度为900mg/mL，测定浓度后使用0.22mm过滤膜进行过滤除菌，并在4℃冰箱中保存备用，在后续实验中以含胎牛血清的DMEM作为稀释缓冲液。

从液氮中取出CRFK细胞(分离自华中农业大学实验室)冻存瓶后快速放进37℃恒温水浴箱内融解，放在水平离心机上1200rpm，离心5min。回到超净台缓慢掉倒掉液体，加入1mL的1×PBS重悬细胞，再放在水平离心机上1200rpm，离心5min。用1mL新的DMEM培养基重悬细胞沉淀。向25-cm

本研究中使用FIPV-79-1146毒株(分离自华中农业大学实验室)。CRFK细胞增值约为80％时加入FIPV-79-1146毒株稀释液。加入病毒三小时后，用1×PBS洗涤两次，再加入5mL含2％FBS的DMEM培养基。收集含有病毒的细胞在液氮中冻融三次后，4℃10000g离心15min。将病毒液分装，每管1mL，储存于-80℃冰箱保存备用。感染前一天将2×10

数据采用T检验，不显著(P>0.05)、**(P<0.01)、***(P<0.001)、****(P<0.0001)。

实验例2细胞毒性检测

使用实时无标记细胞分析系统(RTCA)检测目的产品对细胞的毒性。在25-cm

由图1和图2可知，饲料添加剂浓度为3mg/mL时对CRFK细胞没有毒性，半数安全浓度(CC

实验例3荧光定量PCR

采用荧光定量PCR鉴定饲料添加剂对猫肾脏细胞中猫传染性腹膜炎病毒复制的抑制作用：CRFK细胞培养在6孔板中培养24h后，用MOI为1的FIPV-79-1146毒株感染1h后，分别加入3mg/mL和6mg/mL的饲料添加剂处理各孔20h。本实验所用PCR引物基于猫科冠状病毒7b基因的共有保守序列设计。正向引物序列为5'-GGAAGTTTAGATTTGATTTGGCAATGCTAG(SEQ IDNo.1)，反向引物序列为5'-AACAATCACTAGATCCAGACGTTAGCT(SEQ ID No.2)。以GAPDH作为内参基因，使用2

由图3可知，在mRNA水平上，本发明饲料添加剂能够使FIPV-79-1146的7b基因的表达量降低。根据半数最大效应浓度(EC

在安全浓度范围内，本发明饲料添加剂在浓度为3mg/mL和6mg/mL时，都能抑制FIPV病毒7b基因的复制，具有抗猫传染性腹膜炎病毒的作用。

由以上实施例可知，本发明提供了一种饲料添加剂，在3mg/mL浓度下对CRFK细胞没有毒性，半数安全浓度(CC

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 武汉世纪迈得生命科技有限公司

任辛

<120> 一种饲料添加剂、制备方法及其在制备治疗猫传染性腹膜炎药物中的应用

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggaagtttag atttgatttg gcaatgctag 30

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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