一种生物联合氨化预处理提高玉米秸秆水解产还原糖的方法

摘要

本发明公开了一种生物联合氨化预处理提高玉米秸秆水解产还原糖的方法。涉及生物质能源技术领域。包括以下步骤：平菇固态发酵；氨化预处理。本发明相比于传统的生物预处理，缩短发酵时间，提高酶解率，减少碳水化合物的损失。采用碳酸铵为氨化剂，区别于氨水，价格更加低廉、毒性和腐蚀性都较低，在储藏运输中无需特殊的设备，更具有安全性。相比于以氢氧化钠为主的碱预处理，条件更加温和，无需洗涤，不会产生大量废水，对设备要求低，对环境更加友好。对纤维素成分损失小，还原糖产量高，不会产生抑制剂，更有利于后续发酵。

说明书

技术领域

本发明涉及生物质能源技术领域，更具体的说是涉及一种生物联合氨化预处理提高玉米秸秆水解产还原糖的方法。

背景技术

目前，能源短缺已经成为世界的关键性问题，生物质能源作为一种全球可利用的可再生和可回收能源，是解决能源问题重要的方案之一。木质纤维素生物质由于成本低、来源广、储量大和可再生等优势已成为生物燃料的主要来源。木质纤维素生物质主要是由纤维素、半纤维素和木质素组成，其中纤维素和半纤维素是可发酵糖的潜在来源，木质素在纤维素和半纤维素间相互缠绕，形成一道天然的物理屏障，从而降低纤维素酶对纤维素的可及性。为了实现木质纤维素生物质的高价值利用，有必要采取有效的预处理方法来克服天然生物质的顽固性，增加纤维素对纤维素酶水解的可及性。

通常采用的预处理方法主要包括三类，即化学、物理和生物预处理。生物预处理因其环保和操作简单等特点而备受关注，但仍存在处理技术发酵周期长，碳水化合物损失大，产糖率低等缺点。化学预处理中的碱性预处理存在污染化境、产生抑制剂和易腐蚀设备等不足。

因此，如何提供一种提高玉米秸秆水解产还原糖的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种生物联合氨化预处理提高玉米秸秆水解产还原糖的方法。解决生物预处理耗时长、效率低、化合物损失多，传统处理需要耐腐蚀设备、且产生废水、后处理过程繁琐复杂，污染环境等问题。

氨的毒性和腐蚀性不强，挥发性强，易回收利用，通过改变纤维素的结晶度和形态，可以提高纤维素的酶解率。本发明采用的氨化剂在安全、运输、储存等方面更有优势，玉米秸秆经过平菇固态发酵后，再用少量的碳酸铵处理还原糖产量可得到显著的提高。另外，此发明减少了大量洗涤废水的排放成本，不需大型设备，操作简单，更有利于商业化生产。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种生物联合氨化预处理提高玉米秸秆水解产还原糖的方法，包括以下步骤：

(1)平菇固态发酵：称取一定量的玉米秸秆粉，调节水分含量，灭菌后接入平菇种子液，发酵培养，烘干，得到生物预处理的玉米秸秆粉；

(2)氨化预处理：称取一定量生物预处理的玉米秸秆粉、氨化剂和水搅拌均匀，密闭条件下储存，待氨化结束后，烘干，得氨化预处理后的玉米秸秆粉，加入纤维素酶水解得到还原糖溶液。

进一步的，步骤(1)调节水分含量用去离子水；发酵培养、储存使用设备为恒温培养箱；

步骤(2)密闭条件：置于压紧密闭的容器中。

优选的：步骤(1)玉米秸秆粉的粒径为20～40目；

调节水分含量至80％；

灭菌：采用高压灭菌：压强100kPa，温度121℃，灭菌时间40min；

平菇的菌种：糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)保藏编号CGMCC 5.930；

进一步的，糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)保藏编号CGMCC 5.930购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

平菇种子液的制备方法：糙皮侧耳接于PDA培养基活化7d，再取3个直径0.5cm菌饼接于PDA液体培养基，在25℃，转速160r/min，避光培养7d；使用时，匀浆5～10s；

平菇种子液接入的质量占比为10％；

发酵的温度：恒温28℃，时间14～28天。

优选的：步骤(2)生物预处理的玉米秸秆粉、氨化剂的质量比为1：0.05～0.2，生物预处理的玉米秸秆粉的固含量为30％～70％；

储存：恒温30℃恒温，时间7～11天；

所述纤维素酶：0.01g/mL的纤维素酶溶液；

纤维素酶酶活：100FPU/g；

水解还需加入pH值为4.8，0.05moL/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液；

纤维素酶溶液和醋酸-醋酸钠缓冲溶液的体积比为3：7；

氨化预处理后的玉米秸秆粉、纤维素酶的质量比：0.2g：30mg；

水解的条件：温度50℃，转速150r/min的水浴摇床中水解48h。

进一步的，生物预处理的玉米秸秆粉的固含量＝生物预处理的玉米秸秆粉质量/(生物预处理的玉米秸秆粉质量+水质量)；

使用的纤维素酶酶活为100FPU/g，酶解时每克玉米秸秆需要15FPU纤维素酶(即，15FPU/g)，使用时把纤维素酶配制成0.01g/mL的溶液加入到酶解体系中，即，0.2g玉米秸秆中加入3mL(0.01g/mL)的纤维素酶溶液和7mL pH值为4.8(0.05moL·L

优选的：步骤(2)氨化剂为碳酸铵。

优选的：步骤(2)水解后还包括离心：10000r/min，时间10min。

本发明还提供了上述的方法在生物能源、环境保护、化工生产中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种生物联合氨化预处理提高玉米秸秆水解产还原糖的方法，取的技术效果：

1、相比于传统的生物预处理，缩短发酵时间，提高酶解率，减少碳水化合物的损失。

2、采用碳酸铵为氨化剂，区别于氨水，价格更加低廉、毒性和腐蚀性都较低，在储藏运输中无需特殊的设备，更具有安全性。

3、相比于以氢氧化钠为主的碱预处理，条件更加温和，无需洗涤，不会产生大量废水，对设备要求低，对环境更加友好。

4、对纤维素成分损失小，还原糖产量高，不会产生抑制剂，更有利于后续发酵。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种生物联合氨化预处理提高玉米秸秆水解产还原糖的方法。

实施例中未提及的原料、设备均为常规市售原料和设备，例如：糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)保藏编号CGMCC 5.930购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；在此不再赘述。

平菇种子液的制备方法：糙皮侧耳接于PDA培养基活化7d，将培养7d后的菌株平板用打孔器取3块直径0.5cm的菌饼接于PDA液体培养基，在25℃，转速160r/min，避光培养7d；使用时，匀浆5～10s。

实施例1

称取20～40目玉米秸秆10g，在250mL锥形瓶中加去离子水调至水分含量80％，高压蒸汽灭菌(压强100kPa，温度121℃)40min后，接种平菇液体种子液1mL，放置28℃恒温培养箱中21天，结束发酵后烘干，得生物预处理的玉米秸秆粉；

依据50％固含量{固含量＝生物预处理的玉米秸秆粉质量/(生物预处理的玉米秸秆粉质量+水质量)}，将生物预处理的玉米秸秆粉质量计10％(w/w)碳酸铵溶于所需的水，再与生物预处理的玉米秸秆粉混合，搅拌均匀后置于密闭容器中，在30℃恒温培养箱中储存11天，结束后烘干；

称取氨化预处理后的玉米秆0.2g、3ml 0.01g/mL纤维素酶溶液(纤维素酶酶活：100FPU/g)和7mL pH值为4.8(0.05moL·L

实施例2

称取20～40目玉米秸秆10g，在250ml锥形瓶中加去离子水调至水分含量80％，高压蒸汽灭菌(压强100kPa，温度121℃)40min后，接种平菇液体种子液1mL，放置28℃恒温培养箱中14天，结束发酵后烘干，得生物预处理的玉米秸秆粉；

依据50％固含量{固含量＝生物预处理的玉米秸秆粉质量/(生物预处理的玉米秸秆粉质量+水质量)}，将生物预处理的玉米秸秆粉质量计15％(w/w)碳酸铵溶于所需的水，再与生物预处理的玉米秸秆粉混合，搅拌均匀后置于密闭容器中，在30℃恒温培养箱中储存7天，结束后烘干；

称取氨化预处理后的玉米秆0.2g、3ml 0.01g/mL纤维素酶溶液(纤维素酶酶活：100FPU/g)和7mL pH值为4.8(0.05moL·L

实施例3

称取20～40目玉米秸秆10g，在250mL锥形瓶中加去离子水调至水分含量80％，高压蒸汽灭菌(压强100kPa，温度121℃)40min后，接种平菇液体种子液1mL，放置28℃恒温培养箱中28天，结束发酵后烘干，得生物预处理的玉米秸秆粉；

依据50％固含量{固含量＝生物预处理的玉米秸秆粉质量/(生物预处理的玉米秸秆粉质量+水质量)}，将生物预处理的玉米秸秆粉质量计15％(w/w)碳酸铵溶于所需的水，再与生物预处理的玉米秸秆粉混合，搅拌均匀后置于密闭容器中，在30℃恒温培养箱中储存11天，结束后烘干；

称取氨化预处理后的玉米秆0.2g、3ml 0.01g/mL纤维素酶溶液(纤维素酶酶活：100FPU/g)和7mL pH值为4.8(0.05moL·L

实施例4

称取20～40目玉米秸秆10g，在250mL锥形瓶中加去离子水调至水分含量80％，高压蒸汽灭菌(压强100kPa，温度121℃)40min后，接种平菇液体种子液1mL，放置28℃恒温培养箱中28天，结束发酵后烘干，得生物预处理的玉米秸秆粉；

依据50％固含量{固含量＝生物预处理的玉米秸秆粉质量/(生物预处理的玉米秸秆粉质量+水质量)}，将生物预处理的玉米秸秆粉质量计10％(w/w)碳酸铵溶于所需的水，再与生物预处理的玉米秸秆粉混合，搅拌均匀后置于密闭容器中，在30℃恒温培养箱中储存9天，结束后烘干；

称取氨化预处理后的玉米秆0.2g、3ml 0.01g/mL纤维素酶溶液(纤维素酶酶活：100FPU/g)和7mL pH值为4.8(0.05moL·L

对比实验

1、与未经氨化预处理的原料相比：

称取玉米秸秆0.2g、3ml 0.01g/mL纤维素酶溶液(纤维素酶酶活：100FPU/g)放入50mL离心管中，在50℃、150r/min的水浴摇床中水解48h，将产物离心，吸取上清液通过DNS法测还原糖产量205mg/g。

2、调整工艺步骤、原料配比：

称取20～40目玉米秸秆10g，在250mL锥形瓶中加去离子水调至水分含量80％，高压蒸汽灭菌(压强100kPa，温度121℃)40min后，接种平菇液体种子液1mL，放置28℃恒温培养箱中28天，结束发酵后烘干，得生物预处理的玉米秸秆粉。

称取生物预处理的玉米秸秆粉0.2g，3ml 0.01g/mL纤维素酶溶液(纤维素酶酶活：100FPU/g)和7mL pH值为4.8(0.05moL·L-1)的醋酸-醋酸钠缓冲溶液放入50mL离心管中，在50℃、150r/min的水浴摇床中水解48h，将产物离心，吸取上清液通过DNS法测还原糖产量为210mg/g。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。