一种扩繁艾美耳球虫的方法

摘要

本发明公开了一种扩繁艾美耳球虫的方法，所述方法包括：将艾美耳球虫卵囊接种于鸡的十二指肠，对接种后鸡进行培养，扩繁艾美耳球虫，收集粪便，获取粪便中的艾美耳球虫卵囊。本发明将艾美耳球虫孢子化卵囊在体外通过机械法研磨的方式使孢子囊释出，将孢子囊接种到鸡十二指肠，接种后感染成功率100％，对于不能经肌胃研磨的鸡球虫结构，如孢子囊，通过注射方式接种到十二指肠，孢子囊在胆汁和胰酶的作用下释放出子孢子，子孢子感染鸡后在体内完成裂殖生殖和孢子生殖，产生后代卵囊。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种扩繁艾美耳球虫的方法。

背景技术

鸡球虫病主要是由艾美耳球虫属的多种球虫引起的鸡的一种土源性肠道寄生虫病，此病是通过球虫卵囊传播，因鸡吞食大量的孢子化卵囊而感染，可引起鸡只增重、产蛋减少，饲料利用率降低，严重感染时可导致鸡死亡。研究表明，鸡球虫在感染鸡的过程中需要经过两次脱囊，即孢子囊从卵囊释出和子孢子从孢子囊释出的过程，球虫在鸡体内脱囊过程需要两次刺激，第一次刺激是卵囊在肌胃中被机械磨破，释放出孢子囊；第二次刺激是在小肠，孢子囊的斯氏体在胆汁和胰酶的作用下产生裂口而释放出子孢子，释出的子孢子入侵肠上皮细胞，在肠道内进行裂殖生殖和配子生殖生成卵囊，随着肠上皮细胞的破裂，卵囊进入肠腔，随粪便排出到体外。

现有技术主要采用卵囊经口接种后感染鸡，扩繁艾美耳球虫，孢子化卵囊必须要经过肌胃的研磨这一刺激才能使卵囊壁破碎，如CN108148761A公开一种提高柔嫩艾美耳球虫卵囊产量的组合物及其制备方法，可通过防治肠道炎症、抑制盲肠内厌氧菌的繁殖、促进组织细胞再生、加快肠道粘膜修复等作用来提高柔嫩艾美耳球虫卵囊的产量，减少卵囊扩繁所用的鸡只数量，减低人力、物力、时间成本，从而大大提高鸡球虫疫苗的生产效率；CN106754379A公开了一种兔中型艾美耳球虫早熟株及其制备方法、应用，所述方法包括：通过兔粪便采集和分离纯化得到兔中型艾美耳球虫强毒株孢子化卵囊，将所述兔中型艾美耳球虫强毒株孢子化卵囊感染断奶仔兔，经过多次传代后得到潜隐期缩短的第N代兔中型艾美耳球虫卵囊，即兔中型艾美耳球虫早熟株；相对于兔中型艾美耳球虫野外流行株而言，本发明制备的兔中型艾美耳球虫早熟株纯净、且致病力较弱，可直接用于制备疫苗；但经口接种的方式存在感染效率低、卵囊产量低以及并不适用于所有艾美耳球虫的问题。

综上所述，如何提供一种感染效率、卵囊产量高，且适用性广的扩繁艾美耳球虫的方法，是艾美耳球虫应用领域亟需解决问题之一。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种扩繁艾美耳球虫的方法，所述方法采用全新接种策略，设计并控制接种过程，感染效率、卵囊产量高，且适用性广，可对多种艾美耳球虫进行扩繁。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种扩繁艾美耳球虫的方法，所述方法包括：

将艾美耳球虫卵囊接种于鸡的十二指肠，对接种后鸡进行培养，扩繁艾美耳球虫，收集粪便，获取粪便中扩繁后艾美耳球虫卵囊。

本发明将艾美耳球虫卵囊接种到鸡十二指肠，操作简单，鸡存活率100％，接种后鸡感染率100％，本发明发现艾美耳球虫孢子化卵囊在感染鸡的过程中经肌胃研磨脱囊不是必要的，脱囊在肠道也能完成，脱囊后的子孢子在鸡体内进行裂殖生殖和孢子生殖，高效产生后代卵囊。

此外，随着基因编辑技术的发展，以鸡艾美耳球虫为载体表达外源抗原的技术已经逐渐成熟。不同于其他顶复门寄生虫，艾美耳球虫目前还不能在体外进行连续培养或完成整个生活史，遗传发育还需要在鸡体内完成，所以电转染后子孢子的接种途径是获得阳性后代的关键步骤。对于寄生在盲肠、小肠后段的鸡球虫(柔嫩艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫)，子孢子可经泄殖腔接种，而对于寄生于小肠前段的球虫(巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫)较有效的方式就是将子孢子注射到其寄生部位。

优选地，所述艾美耳球虫包括巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫或毒害艾美球虫。

优选地，所述接种包括将艾美耳球虫卵囊注射入鸡的十二指肠中。

本发明将巨型艾美耳球虫卵囊通过注射的方式接种到鸡十二指肠，操作简单，且鸡成活率及感染率均为100％。

优选地，所述艾美耳球虫卵囊的注射量为1～10

优选地，所述接种前还包括分离艾美耳球虫卵囊的步骤。

优选地，所述分离艾美耳球虫卵囊包括：

将艾美耳球虫孢子化卵囊经口接种鸡，收集感染后鸡的粪便，向粪便中加入水，过滤，对过滤后液体进行离心，弃去上清，向沉淀中加入饱和盐水，离心并收集上清，加入水，离心并收集沉淀，得到艾美耳球虫卵囊。

优选地，所述过滤包括：依次经70～90目金属网筛(例如可以是72目、75目、80目、82目、85目、86目、88目或89目)、100～120目金属网筛(例如可以是102目、105目、108目、110目、102目、106目、110目、112目、115目、118目或119目)和190～210目滤布过滤(例如可以是192目、195目、200目、202目、205目、206目、208目或209目)。

优选地，所述分离艾美耳球虫卵囊包括：

(1’)将巨型艾美耳球虫孢子化卵囊感染1～3周龄无球虫鸡，收集感染后鸡的7～9日的粪便，向粪便中加入3～5倍体积清水后搅拌均匀，依次经70～90目金属网筛、100～120目金属网筛、190～210目滤布过滤；

(2’)将过滤后液体于1000～2000rpm离心1～5min，弃去上清，重复2～4次，向沉淀中加入2～4倍体积盐水，2000～3000rpm离心1～5min，收集上清，加入3～6倍体积清水，2500～3000rpm离心1～5min，收集沉淀，向沉淀中加入1％的氯胺-T溶液，于25～30℃恒温孢子化20～30h，置于0～4℃冰箱备用。

优选地，所述接种前还包括研磨的步骤。

优选地，所述研磨包括：

将艾美耳球虫孢子化卵囊置于缓冲液中，离心后弃去上清；向沉淀中加入次氯酸钠溶液，离心并收集上清；向上清中加入缓冲液，离心并弃去上清；向沉淀中加入缓冲液和玻璃珠，置于漩涡混匀仪上研磨，加缓冲液冲洗，得到孢子囊悬浮液。

本发明将艾美耳球虫孢子化卵囊在体外通过机械法研磨的方式使孢子囊释出，将孢子囊接种到鸡十二指肠，接种后感染成功率100％，对于不能经肌胃研磨的鸡球虫结构，如孢子囊，通过注射方式接种到十二指肠，孢子囊在胆汁和胰酶的作用下释放出子孢子，子孢子感染鸡后在体内完成裂殖生殖和孢子生殖，产生后代卵囊。

优选地，所述缓冲液包括PBS缓冲液。

优选地，所述次氯酸钠溶液的质量分数为20％～30％，包括但不限于21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％或29％。

优选地，所述玻璃珠的直径为400～625μm，包括但不限于401μm、402μm、405μm、410μm、450μm、480μm、500μm、560μm、580μm、600μm、610μm、615μm、620μm或624μm。

优选地，所述研磨包括：

将艾美耳球虫孢子化的卵囊置于灭菌PBS洗涤2～4次，离心后弃去上清；向沉淀中加入8～11倍体积的质量分数为20％～30％的次氯酸钠溶液，离心，收集上清，向上清中加入3～6倍体积灭菌PBS，离心，弃去上清，向沉淀中加入2～6mL灭菌PBS和灭菌玻璃珠，置于漩涡混匀仪上研磨，加入灭菌PBS冲洗，得到孢子囊悬浮液。

作为优选的技术方案，所述扩繁艾美耳球虫的方法包括以下步骤：

(1)将艾美耳球虫孢子化卵囊经口接种鸡，收集感染后鸡的粪便，向粪便中加入水，过滤，对过滤后液体进行离心，弃去上清，向沉淀中加入盐水，离心并收集上清，加入水，离心并收集沉淀，得到艾美耳球虫卵囊；

(2)将步骤(1)得到艾美耳球虫卵囊通过注射接种于鸡的十二指肠，对接种后鸡进行培养，扩繁艾美耳球虫，收集粪便，获取粪便中扩繁后艾美耳球虫卵囊。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的扩繁艾美耳球虫的方法直接将艾美耳球虫卵囊接种到鸡十二指肠，操作简单，鸡存活率100％，接种后鸡感染率100％，发现艾美耳球虫孢子化卵囊在感染鸡的过程中经肌胃研磨脱囊不是必要的，脱囊在肠道也能完成，脱囊后的子孢子在鸡体内进行裂殖生殖和孢子生殖，能够高效产生后代卵囊，且扩充可扩繁艾美耳球虫的种类。

附图说明

图1为本发明实施例1中鸡排卵囊曲线图；

图2为本发明实施例2中鸡排卵囊曲线图；

图3为本发明实施例3中鸡排卵囊曲线图；

图4为本发明对比例1中鸡排卵囊曲线图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例以巨型艾美耳球虫为例采用本发明方法进行扩繁。

一、实验方法

1.卵囊的制备

(1)使用巨型艾美耳球虫孢子化卵囊感染两周龄清远麻黄母鸡(南海种禽公司)，收集感染后8日的粪便，向粪便中加入4倍体积清水后搅拌均匀；

(2)依次经80目金属网筛、100目金属网筛、200目滤布过滤，将过滤后液体转移至离心管内，1600rpm离心2min，弃去上清，重复3次直至上清澄清；向沉淀中加入3倍体积盐水，2300rpm离心2min；收集上清，加入5倍体积清水，2800rpm离心2min；收集沉淀，向沉淀中加入1％的氯胺T溶液中，于28℃C恒温孢子化24h后置于4℃冰箱备用。

2.接种

设置处理后注射接种组(CZ组)：选取5只两周龄无球虫清远麻黄母鸡(南海种禽公司)，接种前禁食8h；将鸡称重后根据体重注射麻醉药，将鸡仰卧保定，使其腹部完全暴露，腹部除毛，先用75％的酒精棉球消毒，再用碘伏消毒，最后再用75％酒精脱碘；铺设创巾，暴露出腹部切口，在鸡龙骨左下侧做长约1.5cm的皮肤切口，分离皮下脂肪、腹部肌肉和腹膜，找到十二指肠，将其牵引出腹腔，再用注射器将制备的卵囊注射进入十二指肠；将十二指肠还纳回腹腔，采用连续缝合的方式缝合腹膜、腹部肌肉和皮肤，取下创巾，用碘伏对皮肤缝合处进行消毒，将鸡放回鸡笼。观察接种后鸡恢复情况，同时饮喂多维葡萄糖。

3.检查是否感染成功

采用饱和盐水漂浮法，从接种后第6天开始排查CZ组鸡粪便中是否有卵囊。

4.感染虫种鉴定

采用麦克马斯特法测定每日每只鸡粪便中卵囊数量，计算每日排卵囊量，绘制排卵囊曲线，确定排卵囊期和排卵囊高峰，同时根据巨型艾美耳球虫卵囊特征鉴定鸡感染的是否为巨型艾美耳球虫。

二、实验结果：

CZ组鸡在接种后第7天开始排卵囊，排卵囊期为接种后第7～11天，记每日每只鸡排卵囊量如表1所示，以接种后天数(dpi)为横坐标，排卵囊量为纵坐标绘制排卵囊曲线，如图1所示。

表1

测量卵囊大小，计算平均值，结果如表2所示，根据《禽病学》第九版列出的巨型艾美耳球虫卵囊大小为21.5～42.5μm×16.5～29.8μm，平均30.5×20.7μm；《球虫生物学》中列出的卵囊大小为21～42μm×16～30μm，表明CZ组鸡排出的卵囊为巨型艾美耳球虫卵囊。

表2

实施例2

本实施例以巨型艾美耳球虫孢子囊为例采用本发明方法进行扩繁。

一、实验方法

1.孢子囊的制备

取巨型艾美耳球虫孢子化卵囊置于50mL离心管中，4000rpm离心10min，弃去上清，加入灭菌PBS洗涤3次，离心后弃去上清，向沉淀中加入10倍体积的30％次氯酸钠溶液，冰上静置10min后1500rpm离心10min，收集上清；向上清中加入5倍体积灭菌PBS，4000rpm离心10min，弃去上清，向沉淀中加入5mL灭菌PBS和灭菌玻璃珠，置于漩涡混匀仪上研磨，直至所有孢子囊释出，加入灭菌PBS冲洗，得到孢子囊悬浮液。

2.十二指肠接种孢子囊

选取5只两周龄无球虫麻黄母鸡，接种前禁食8h，将鸡称重后根据体重注射麻醉药，将鸡仰卧保定，使其腹部完全暴露，腹部除毛，先用75％的酒精棉球消毒，再用碘伏消毒，最后再用75％酒精脱碘；铺设创巾，暴露出腹部切口，在鸡龙骨左下侧做长约1.5cm的皮肤切口，分离皮下脂肪、腹部肌肉和腹膜，找到十二指肠，将其牵引出腹腔，再用注射器将孢子囊悬液注射进入十二指肠，将十二指肠还纳回腹腔，采用连续缝合的方式缝合腹膜、腹部肌肉和皮肤，取下创巾，用碘伏对皮肤缝合处进行消毒，将鸡放回鸡笼，观察鸡恢复情况，同时饮喂多维葡萄糖。

3.检查是否感染成功

采用饱和盐水漂浮法，从接种后第6天开始排查鸡粪便中是否有卵囊。

4.感染虫种鉴定

采用麦克马斯特法测定每日每只鸡粪便中卵囊数量，计算每日排卵囊量，绘制排卵囊曲线，确定排卵囊期和排卵囊高峰，同时根据巨型艾美耳球虫卵囊特征鉴定鸡感染的是否为巨型艾美耳球虫。

二、实验结果

十二指肠接种孢子囊的鸡在接种后第7天开始排卵囊，排卵囊期为接种后第7～9天，记每日每只鸡排卵囊量(如表3所示)，以接种后天数为横坐标，排卵囊量为纵坐标绘制排卵囊曲线(如图2所示)。

表3

测量卵囊大小，计算平均值，结果如表4所示，根据《禽病学》第九版列出的巨型艾美耳球虫卵囊大小为21.5～42.5μm×16.5～29.8μm，平均30.5×20.7μm；《球虫生物学》中列出的卵囊大小为21～42μm×16～30μm，表明十二指肠接种孢子囊组鸡排出的卵囊为巨型艾美耳球虫卵囊。

表4

实施例3

本实施例以柔嫩艾美耳球虫为例采用本发明方法进行扩繁。

一、实验方法

1.卵囊的制备

(1)使用柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊感染两周龄清远麻黄母鸡(南海种禽公司)，收集感染后7～9日的粪便，向粪便中加入4倍体积清水后搅拌均匀；

(2)依次经80目金属网筛、100目金属网筛、200目滤布过滤，将过滤后液体转移至离心管内，1600rpm离心2min，弃去上清，重复3次直至上清澄清；向沉淀中加入3倍体积盐水，2300rpm离心2min；收集上清，加入5倍体积清水，2800rpm离心2min；收集沉淀，向沉淀中加入1％的氯胺T溶液中，于28℃C恒温孢子化24h后置于4℃冰箱备用。

2.接种

选取5只两周龄无球虫清远麻黄母鸡(南海种禽公司)，接种前禁食8h；将鸡称重后根据体重注射麻醉药，将鸡仰卧保定，使其腹部完全暴露，腹部除毛，先用75％的酒精棉球消毒，再用碘伏消毒，最后再用75％酒精脱碘；铺设创巾，暴露出腹部切口，在鸡龙骨左下侧做长约1.5cm的皮肤切口，分离皮下脂肪、腹部肌肉和腹膜，找到十二指肠，将其牵引出腹腔，再用注射器将制备的卵囊注射进入十二指肠；将十二指肠还纳回腹腔，采用连续缝合的方式缝合腹膜、腹部肌肉和皮肤，取下创巾，用碘伏对皮肤缝合处进行消毒，将鸡放回鸡笼。观察接种后鸡恢复情况，同时饮喂多维葡萄糖。

3.检查是否感染成功

采用饱和盐水漂浮法，从接种后第6天开始排查粪便中是否有卵囊。

4.感染虫种鉴定

采用麦克马斯特法测定每日每只鸡粪便中卵囊数量，计算每日排卵囊量，绘制排卵囊曲线，确定排卵囊期和排卵囊高峰，并根据排卵囊期、排卵囊高峰和形态学判断感染鸡感染的是否为柔嫩艾美耳球虫。

二、实验结果

十二指肠接种柔嫩艾美耳球虫卵囊的鸡在接种后第7天开始排卵囊，排卵囊期为接种后第7～11天，记每日每只鸡排卵囊量(如表5所示)，以接种后天数为横坐标，排卵囊量为纵坐标绘制排卵囊曲线(如图3所示)。

表5

对比例1

本对比例以巨型艾美耳球虫为例采用经口接种方法进行扩繁。

一、实验方法

1.卵囊的制备

(1)使用巨型艾美耳球虫孢子化卵囊感染两周龄无球虫麻黄母鸡，收集感染后8日的粪便，向粪便中加入4倍体积清水后搅拌均匀，依次经80目金属网筛、100目金属网筛、200目滤布过滤；

(2)将过滤后液体转移至离心管内，1600rpm离心2min，弃去上清，重复3次直至上清澄清，向沉淀中加入3倍体积盐水，2300rpm离心2min；收集上清，加入5倍体积清水，2800rpm离心2min；收集沉淀，向沉淀中加入1％的氯胺T溶液中，于28℃恒温孢子化24h后置于4℃冰箱备用。

2.口服接种

设置处理后口服接种组(CK组)：选取5只两周龄无球虫麻黄母鸡，处理前禁食8h；将鸡称重后根据体重注射麻醉药，将鸡仰卧保定，使其腹部完全暴露，腹部除毛，先用75％的酒精棉球消毒，再用碘伏消毒，最后再用75％酒精脱碘；铺设创巾，暴露出腹部切口，在鸡龙骨左下侧做长约1.5cm的皮肤切口，用剪刀钝性分离皮下脂肪、腹部肌肉和腹膜，找到十二指肠，将其牵引出腹腔，采用连续缝合的方式缝合腹膜、腹部肌肉和皮肤，取下创巾，用碘伏对皮肤缝合处进行消毒，将鸡放回鸡笼，待鸡苏醒后经口接种卵囊，观察鸡恢复情况，同时饮喂多维葡萄糖。

3.检查是否感染成功

采用饱和盐水漂浮法，从接种后第6天开始排查CK组鸡粪便中是否有卵囊。

4.感染虫种鉴定

采用麦克马斯特法测定每日每只鸡粪便中卵囊数量，计算每日排卵囊量，绘制排卵囊曲线，确定排卵囊期和排卵囊高峰，同时根据巨型艾美耳球虫卵囊特征鉴定鸡感染的是否为巨型艾美耳球虫。

二、实验结果

CK组鸡在接种后第7天开始排卵囊，排卵囊期为接种后第7～10天，记每日每只鸡排卵囊量(如表6)，以接种后天数为横坐标，排卵囊量为纵坐标绘制排卵囊曲线(如图4)。

表6

测量卵囊大小，计算平均值，结果如表7所示，根据《禽病学》第九版列出的巨型艾美耳球虫卵囊大小为21.5～42.5μm×16.5～29.8μm，平均30.5×20.7μm；《球虫生物学》中列出的卵囊大小为21～42μm×16～30μm，CK组鸡排出的卵囊为巨型艾美耳球虫卵囊。

表7

对比例2

一、实验方法

设置处理后不接种组(CN组)：选取5只两周龄无球虫麻黄母鸡，禁食8h，将鸡称重后根据体重注射麻醉药，将鸡仰卧保定，使其腹部完全暴露，腹部除毛，先用75％的酒精棉球消毒，再用碘伏消毒，最后再用75％酒精脱碘；铺设创巾，暴露出腹部切口，在鸡龙骨左下侧做长约1.5cm的皮肤切口，用剪刀钝性分离皮下脂肪、腹部肌肉和腹膜，找到十二指肠，将其牵引出腹腔，注射生理盐水；将十二指肠还纳回腹腔，采用连续缝合的方式缝合腹膜、腹部肌肉和皮肤，取下创巾，用碘伏对皮肤缝合处进行消毒，将鸡放回鸡笼；观察鸡恢复情况，同时饮喂多维葡萄糖。

采用饱和盐水漂浮法，从接种后第6天开始排查CK组鸡粪便中是否有卵囊。

二、实验结果

CN组鸡粪便中无卵囊。

对比实施例1、实施例2和对比例1中鸡排卵囊量，结果如表8，表明本发明扩繁方式可同等替换传统接种方式，且对扩繁球虫无显著影响的条件下，增加扩繁物种的多样性，扩充可扩繁艾美耳球虫的种类。

表8

综上所述，本发明的扩繁艾美耳球虫的方法直接将艾美耳球虫卵囊接种到鸡十二指肠，操作简单，鸡存活率100％，接种后鸡感染率100％，发现艾美耳球虫孢子化卵囊在感染鸡的过程中经肌胃研磨脱囊不是必要的，脱囊在肠道也能完成，脱囊后的子孢子在鸡体内进行裂殖生殖和孢子生殖，能够高效产生后代卵囊，且扩充可扩繁艾美耳球虫的种类，对现有扩繁手段进行补充。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。