端粒长度作为职业性农药接触人群游离三碘甲状腺原氨酸改变生物标志物的用途

摘要

本申请公开一种端粒长度作为职业性农药接触人群游离三碘甲状腺原氨酸改变生物标志物的用途，扩增端粒基因的引物包括：上游引物序列如SEQ IDNO：1所示，下游引物序列如SEQ ID NO：2所示；扩增内参基因的引物包括：上游引物序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物序列如SEQ ID NO：4所示。本申请经研究发现，端粒长度可作为生物标志物用于职业性农药接触人群游离三碘甲状腺原氨酸异常的易感性分析，端粒长度缩短的职业性农药接触人群更容易游离三碘甲状腺原氨酸异常。有望在职业性农药接触人群甲状腺功能紊乱监测方面提供实践参考指标。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种端粒长度变化作为职业性农药接触人群游离三碘甲状腺原氨酸改变的生物标志物用途。

背景技术

端粒是真核生物染色DNA末端的特殊结构，早在20世纪80年代中期，科学家们就发现了端粒酶，当细胞DNA复制终止时，在端粒酶的帮助下DNA就能够通过端粒依赖模版的复制，补偿由去除引物引起的末端缩短，因此在端粒的保持过程中，端粒酶至关重要；但随着细胞分裂次数的增加，端粒的长度逐渐缩短，当端粒变得不能再短时，细胞就不再分裂而会死亡。近年来，科学家们通过大量研究发现，端粒的长度或许和很多疾病的发病直接相关。

全球每年农药使用总量达30亿千克，每公顷农植物耕地面积的农药使用量为2.38～32.22千克。其中，中国每公顷农业用地面积的农药使用量约10.93千克，位居全球第5位。亚洲发展中国家的农业从业者总数达2500万，63.79％的农业从业者仍超量使用农药，48.2％的农业从业者不规范使用农药，面临着农药所致健康危害风险。

农药不仅造成中毒事件，还可产生多种不良健康效应，干扰机体正常的生理功能，诱发甲状腺生理异常和(或)病理表现。农药具有影响农业从业者甲状腺激素水平的作用。农药使用与接触是造成农业从业者外周血中游离三碘甲状腺原氨酸水平升高的潜在职业危害因素，而游离三碘甲状腺原氨酸被视作农药中毒患者病情及其愈后的监测评估指标。

发明内容

本申请提供一种端粒长度变化作为生物标志物在职业性农药接触人群游离三碘甲状腺原氨酸改变易感性分析中的用途。

具体地，提供一种扩增端粒基因和内参基因的引物在制备职业性农药接触人群游离三碘甲状腺原氨酸改变易感性分析检测产品中的用途。

可选的，扩增端粒的引物包括：

上游引物序列(5'→3')

CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT(SEQ ID NO：1)；

下游引物序列(5'→3')

GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT(SEQ ID NO：2)。

可选的，扩增内参基因的引物包括：

上游引物序列(5'→3')

CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC(SEQ ID NO：3)；

下游引物序列(5'→3')

CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA(SEQ ID NO：4)。

可选的，所述内参基因为RPLP0(ribosomal protein lateral stalk subunitP0，核糖体磷酸化蛋白大亚基P0)基因；所述扩增内参基因的引物以该内参基因序列为靶序列进行引物设计。

可选的，扩增端粒基因的引物以“TTAGGG”为单位的重复序列为目标序列进行设计得到。

可选的，所述易感性分析检测产品为试剂或试剂盒。

本申请还提供一种职业性农药接触人群游离三碘甲状腺原氨酸改变易感性分析检测试剂或试剂盒，包括扩增端粒基因和内参基因的引物；

所述扩增端粒基因的引物包括：

上游引物序列(5'→3')

CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT(SEQ ID NO：1)，

下游引物序列(5'→3')

GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT(SEQ ID NO：2)；

所述扩增内参基因的引物包括：

上游引物序列(5'→3')

CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC(SEQ ID NO：3)，

下游引物序列(5'→3')

CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA(SEQ ID NO：4)。

所述试剂盒为实时荧光定量PCR试剂盒，所述的试剂盒中还包括：荧光定量PCR反应体系试剂(2×TB Green II Mix和50×ROX Reference Dye)、无核酸酶双蒸水等常规组分。

本申请还提供一种端粒长度作为生物标志物在制备职业性农药接触人群游离三碘甲状腺原氨酸改变易感性分析检测产品中的用途。

可选的，所述端粒长度变化的计算公式为：

端粒相对长度(T/S)＝2

Ct

Ct

本申请经研究发现，端粒长度可作为生物标志物用于职业性农药接触人群游离三碘甲状腺原氨酸改变的易感性分析，端粒长度缩短的职业性农药接触人群更容易游离三碘甲状腺原氨酸异常。有望在职业性农药接触人群甲状腺功能紊乱监测方面提供实践参考指标。

附图说明

图1为农药接触者A01的内参基因表达和端粒基因表达的扩增曲线(其中(a)为内参基因，(b)为端粒基因)。

图2为农药接触者A01的内参基因表达和端粒基因表达的溶解曲线(其中(a)为内参基因，(b)为端粒基因)。

图3为非农药接触者C07的内参基因表达和端粒基因表达的扩增曲线(其中(a)为内参基因，(b)为端粒基因)。

图4为非农药接触者C07的内参基因表达和端粒基因表达的溶解曲线(其中(a)为内参基因，(b)为端粒基因)。

具体实施方式

下面将结合本申请对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

游离三碘甲状腺原氨酸水平升高一定程度反映甲状腺病变，而甲状腺又是农药的作用靶器官。当甲状腺功能正常状态时，端粒长度改变通常见于年长者。当甲状腺出现生理异常和(或)病理状态，端粒长度发生改变可能取决于个体基因遗传性状。

本申请经研究发现，端粒长度可作为生物标志物用于职业性农药接触人群游离三碘甲状腺原氨酸异常的易感性分析，端粒长度缩短的职业性农药接触人群更容易游离三碘甲状腺原氨酸异常。

以下以实施例进行具体说明：

实施例1

(1)研究对象

本实验纳入150名农业从业者，包括72名农药使用者和78名非农药使用对照者。所有研究对象均签署知情同意书，完成相应流行病学调查，并提供1-3mL外周血标本。

(2)外周血基因组DNA提取与检测

采用基因组DNA柱式小量提取试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)提取外周血中基因组DNA。随后，使用NanoDrop微量核酸浓度定量仪(Fisher公司)进行DNA样本浓度测定，以琼脂糖凝胶电泳法进行DNA样本质量检查。

(3)端粒基因和内参基因引物设计和合成

端粒基因引物设计：

以“TTAGGG”为单位的重复序列(SEQ ID NO：5)为靶序列进行引物设计：

应用Primer3引物设计软件，对端粒基因序列设计引物，其中引物长度设为40bp，TM值设定80度左右，GC含量<55％，引物设计对应靶序列描述如下：TAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA

筛选出的扩增端粒基因的引物如下：

上游引物序列(5'→3')

CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT(SEQ ID NO：1)

下游引物序列(5'→3')

GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT(SEQ ID NO：2)

内参基因引物设计：以“RPLP0，ribosomal protein lateral stalk subunit P0，基因(SEQ ID NO：6)为靶序列进行引物设计。

应用Primer3引物设计软件，对内参基因序列设计引物，其中引物长度设为<30bp，TM值设定在65度左右，GC含量<53％，引物设计对应靶序列描述如下：

ATGAGATGAAATGGCCTCTCTTGAGACTGAGCTGCCAACCTGGCAATTATTGTCTGCTAAGGGTTCTCTTTATTCACCCTTACTTGGACTTCCTTTCCTGTAGGGAATCTCACGTAAAATGAAATCTTCCCTCCCCCAGGGTGTCCGCAATGTTGCCAGTGTCTGTCTGCAGATTGGCTACCCAACTGTTGCATCAGTAC

筛选出的扩增内参基因的引物如下：

上游引物序列(5'→3')

CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC(SEQ ID NO：3)

下游引物序列(5'→3')

CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA(SEQ ID NO：4)

端粒基因和内参基因引物合成：委托上海生工公司合成。

(4)端粒基因和内参基因表达量的PCR检测

定量PCR反应体系：按表1试剂配置PCR反应体系。

表1定量PCR反应体系

定量PCR反应程序：按表2设置PCR反应程序。

表2定量PCR反应程序

端粒引物检测体系和内参引物检测体系均以受试者的外周血基因组DNA为模板。

实验数据处理与分析

读取下载端粒(即以受试者DNA为模板，利用端粒引物扩增出的端粒基因)和内参基因(即以受试者DNA为模板，利用内参引物扩增出的内参基因)的最终Ct值。

计算端粒相对长度，端粒相对长度(T/S)＝2

结果

以其中农药接触者A01和非农药接触者C07为例，农药接触者A01的内参基因表达的扩增曲线如图1中(a)所示，农药接触者A01的端粒基因表达的扩增曲线如图1中(b)所示；农药接触者A01的内参基因表达的溶解曲线如图2中(a)所示，农药接触者A01的端粒基因表达扩增曲线如图2中(b)所示；非农药接触者C07的内参基因表达的扩增曲线如图3中(a)所示，非农药接触者C07的端粒基因表达的扩增曲线如图3中(b)所示；非农药接触者C07的内参基因表达的溶解曲线如图4中(a)所示，非农药接触者C07的端粒基因表达扩增曲线如图4中(b)所示。

在150名农业从业者中，端粒长度的最小值和最大值分别为0.16和3.57，平均值为0.86。其中，78名非农药使用人群和72名农药使用人群的端粒长度均值分别为0.95±0.54和0.76±0.28(p＝0.010)，而两组人群的平均年龄分别为42±11和45±11岁(p＝0.061)。以0.86作为长端粒或短端粒的分类截断值，非农药使用和农药使用人群的短端粒检出率分别为53.8％和76.4％(p＝0.004)。

在150名农业从业者中，游离三碘甲状腺原氨酸的最小值和最大值分别为3.48和6.79pmol/L，平均值为4.82pmol/L。其中，78名非农药使用人群和72名农药使用人群的均值分别为4.62±0.53和5.03±0.54pmol/L(p<0.001)。以>4.82pmol/L作为游离三碘甲状腺原氨酸相对升高的截断值，非农药使用和农药使用人群的游离三碘甲状腺原氨酸升高检出率分别为33.3％和62.5％(p<0.001)。

在短端粒亚组人群中，非农药使用和农药使用人群的游离三碘甲状腺原氨酸升高检出率分别为33.3％(14/42)和63.6％(35/55)(p＝0.003)；在长端粒亚组中，非农药使用和农药使用人群的游离三碘甲状腺原氨酸升高检出率分别为33.3％(12/36)和58.8％(10/17)(p＝0.079)。

多因素Logistic回归分析表明，在矫正年龄、性别和体重指数等因素的条件下，对于短端粒人群而言，农药接触造成游离三碘甲状腺原氨酸水平升高的风险是非接触者的15.66倍(95％置信区间:3.79-64.64)。然而，在长端粒人群中，农药接触并非是造成游离三碘甲状腺原氨酸水平升高的独立风险因素。

结果如表3所示：

表3不同端粒长度对农药接触所致游离三碘甲状腺原氨酸水平升高风险的影响

由以上结果可知，农业从业者的农药接触可能升高外周血游离三碘甲状腺原氨酸水平，并取决于端粒长短的改变；外周血短端粒的农业从业人群的农药接触更易出现游离三碘甲状腺原氨酸水平升高；由此，农药接触农业从业者的游离三碘甲状腺原氨酸水平监测需同时考虑端粒长度检测，以期早期识别和筛选甲状腺激素紊乱高危人群。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州医学院

北京市科学技术研究院城市安全与环境科学研究所

<120> 端粒长度作为职业性农药接触人群游离三碘甲状腺原氨酸改变生物标志物的

用途

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 1

cggtttgttt gggtttgggt ttgggtttgg gtttgggtt 39

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 2

ggcttgcctt acccttaccc ttacccttac ccttaccct 39

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 3

cagcaagtgg gaaggtgtaa tcc 23

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

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<220>

<223> Artificial sequence

<400> 4

cccattctat catcaacggg tacaa 25

<210> 5

<211> 484

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 5

tagggttagg gttagggtta gggttagggt tagggttagg gttagggtta gggttagggt 60

tagggttagg gttagggtta gggttagggt tagggttagg gttagggtta gggttagggt 120

tagggttagg gttagggtta gggttagggt tagggttagg gttagggtta gggttagggt 180

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ggttagggtt agggttaggg ttagggttag ggttagggtt agggttaggg ttagggttag 360

ggttagggtt agggttaggg ttagggttag ggttagggtt agggttaggg ttagggttag 420

ggttagggtt agggttaggg ttagggttag ggttagggtt agggttaggg ttagggttag 480

ggtt 484

<210> 6

<211> 475

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 6

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