槟榔碱用于建立人口腔损伤细胞模型的方法和应用

摘要

本发明公开了槟榔碱用于建立人口腔损伤细胞模型的方法和应用，涉及口腔护理产品功效性检测技术领域。本发明中造模刺激物所选用的槟榔碱是槟榔里面的主要成分，在模拟咀嚼槟榔产品所带来的口腔危害上，其对口腔细胞的损伤作用相比LPS或其他细胞因子更具有针对性，根据槟榔碱作用的靶细胞，选择了人牙龈成纤维细胞作为检测细胞，同时，进行了剂量的优化，可以更真实并且准确的反映在咀嚼槟榔过程中对口腔的损伤，能够更准确的用于检测槟榔产品的安全性，同时，本发明可应用于多种活性物质的功效评价，更好的验证出口腔护理产品的抗损伤有效性。

说明书

技术领域

本发明涉及口腔护理产品功效性检测技术领域，具体为槟榔碱用于建立人口腔损伤细胞模型的方法和应用。

背景技术

槟榔是继香烟、酒和含咖啡因饮料后的第四的嗜好品，同时也是四大南药之一。咀嚼槟榔会产生心理兴奋感，具有成瘾性，会引起多种口腔问题，如牙齿变黑、口腔溃疡、牙周病、牙龈癌等，同时也是口腔黏膜下纤维恶性变主要致病因素，例如口腔黏膜下纤维化、口腔白斑和口腔鳞状细胞癌等。

槟榔碱是从槟榔中分离出来的一种生物碱，被认为是槟榔的主要有效成分。然而，研究表明，槟榔碱也可诱导细胞毒性，如口腔粘膜上皮细胞和成纤维细胞。在反复咀嚼槟榔制品的过程中，槟榔纤维摩擦可引起口腔黏膜出现微创伤或溃疡，使槟榔碱扩散进入微循环中，长期咀嚼槟榔产品可导致损伤不愈、局部形成炎症微环境，此外，槟榔碱的毒性可能会减弱组织的再生程序的反应，从而引发口腔问题发生进一步的恶化。临床上，很难实质测量有多少槟榔碱渗透上皮屏障后影响到更深层次的细胞。

随着经济水平的提升，口腔的护理产品也受到了更多的关注，尤其是针对咀嚼槟榔人群的口腔护理产品需求迫切，这也是各大口腔类产品公司和研究机构的重要研究方向。同时，咀嚼槟榔带来的口腔危害成为槟榔制造行业的痛点，不少企业致力于研发更安全槟榔产品。因此，需要一种有效、方便可实施的研究模型，以进一步评价使用槟榔产品安全性，同时也更有利于针对槟榔咀嚼人群的口腔护理产品开发。

目前，有关口腔损伤的细胞模型多为细胞炎症或者是衰老模型，针对槟榔碱毒性危害建立的细胞评价模型研究较少。细胞炎症模型多为利用LPS、IL-1a等刺激口腔上皮细胞，其炎症状态可通过CCK-8法检测细胞增殖能力，ELISA酶联免疫吸附剂测定炎症相关因子进行评估。衰老模型主要是利用连续传代培养或者紫外辐照、过氧化氢等刺激物刺激健康的人牙龈成纤维细胞，通过测定细胞活力、ROS、基质金属蛋白酶蛋白或基因表达情况进行评估。以上两种模型并没有很强的针对性，难以反映槟榔引起口腔损伤的真实状况，因此，需要一种能够有效、真实反映咀嚼槟榔所引起的口腔损伤细胞模型，以便通过更为完善的检测体系评价槟榔产品的安全性以及口腔类护理产品。

发明内容

本发明目的在于针对目前存在的现状，为解决上述问题，本发明提供一种槟榔碱建立人口腔损伤细胞模型的方法及应用，可以有效解决背景技术中的问题。针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案:

槟榔碱在建立人口腔损伤细胞模型中的应用。

槟榔碱用于建立人口腔损伤细胞模型的方法，包括以下步骤：

S101、细胞培养，将人口腔细胞以1×10

S102、细胞铺板，用胰酶消化培养好的人口腔细胞，消化时间为0.5-5分钟，制成细胞悬液后以1×10

S103、细胞刺激，分为空白组和实验组，弃去旧培养基，空白组每孔加入内含1-20％胎牛血清的DMEM培养基，实验组每孔加入含槟榔碱终浓度为1-250μg/mL且含1-20％胎牛血清的DMEM培养基，将孔板置于37±1℃、5±1％CO

S104、样品制备，刺激过后，将人口腔细胞消化下来，用胰酶消化刺激完成的人口腔细胞，消化时间为1-15分钟，清洗1-3次，制成细胞悬液备用；

S105、指标测定，按照试剂盒的详细说明书进行指标测定。

优选的，步骤101所述的细胞选择人牙龈成纤维细胞、人口腔上皮细胞、人口腔黏膜成纤维细胞、人口腔角质形成细胞、人角质形成细胞，培养容器选择T10、T25、T75、T175细胞瓶或5cm、6cm、10cm细胞皿，细胞的接种密度为1×10

优选的，步骤S102所述的消化时间为1-4分钟，制成细胞悬液密度为1×10

优选的，步骤S103所述的槟榔碱的终浓度为1-200μg/mL，其中胎牛血清含量为1-15％，孔板可选择6、24、48、96孔板，培养时间为6-72小时。

优选的，步骤S104所述的消化时间为3-10分钟，清洗次数为2-3次。

优选的，步骤S105中，所述的试剂盒为CCK-8试剂盒、ROS检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、细胞凋亡与坏死检测试剂盒染色、线粒体膜电位检测试剂盒、SOD检测试剂盒、GSH-PX检测试剂盒、LDH检测试剂盒MDA检测试剂盒等。

本发明的有益效果：

(1)本发明中造模刺激物所选用的槟榔碱是槟榔里面的主要成分，在模拟咀嚼槟榔产品所带来的口腔危害上，其对口腔细胞的损伤作用相比LPS或其他细胞因子更具有针对性。

(2)本发明根据槟榔碱作用的靶细胞，选择了人牙龈成纤维细胞作为检测细胞，同时，进行了剂量的优化，可以更真实并且准确的反映在咀嚼槟榔过程中对口腔的损伤。

(3)本发明能够更准确的用于检测槟榔产品的安全性，同时，本发明可应用于多种活性物质的功效评价，更好的验证出口腔护理产品的抗损伤有效性。

附图说明

图1为不同浓度槟榔碱刺激下细胞存活率影响；

图2为不同浓度槟榔碱刺激下细胞的ROS生成影响；

图3为不同浓度槟榔碱刺激下细胞的凋亡率影响；

图4为不同浓度槟榔碱刺激下细胞的坏死率影响；

图5为铁皮石斛多糖对槟榔碱刺激的缓解作用。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图表，对本发明的技术方案进行进一步详细的描述，但本发明并不局限于下述实施例。基于本发明中的实施例，在本领域中的普通技术人员没有做出创造性劳动的前提下所取得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1槟榔碱用于建立人口腔损伤细胞模型的方法

步骤1：细胞培养，将人牙龈成纤维细胞以1×10

步骤2：细胞铺板，用胰酶消化培养好的人牙龈成纤维细胞，消化时间为1-3分钟，制成细胞悬液后以1×10

步骤3：细胞刺激，弃去旧培养基，每孔加入含槟榔碱终浓度为1-150μg/mL且含5-15％胎牛血清的DMEM培养基。将96孔板置于37±1℃、5±1％CO

步骤4：指标测定，按照CCK-8试剂盒的详细说明书进行指标测定。

实施例2槟榔碱用于建立人口腔损伤细胞模型的方法

步骤1：细胞培养，将人牙龈成纤维细胞以1×10

步骤2：细胞铺板，用胰酶消化培养好的人牙龈成纤维细胞，消化时间为1-3分钟，制成细胞悬液后以1×10

步骤3：细胞刺激，弃去旧培养基，每孔加入含槟榔碱终浓度为1-150μg/mL且含5-15％胎牛血清的DMEM培养基，将6孔板置于37±1℃、5±1％CO

步骤4：样品制备，刺激过后，将人牙龈成纤维细胞消化下来，用胰酶消化刺激完成的人口腔细胞，消化时间为3-8分钟，清洗2-3次，制成细胞悬液备用；

步骤5：指标测定，按照ROS检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、细胞凋亡与坏死检测试剂盒染色的详细说明书进行指标测定。

实施例3槟榔碱用于建立人口腔损伤细胞模型的应用

步骤1：细胞培养，将人牙龈成纤维细胞以1×10

步骤2：细胞铺板，用胰酶消化培养好的人牙龈成纤维细胞，消化时间为1-3分钟，制成细胞悬液后以1×10

步骤3：细胞刺激，弃去旧培养基，每孔加入含终浓度为1-3mg/mL的铁皮石斛多糖和终浓度为1-150μg/mL槟榔碱且含5-15％胎牛血清的DMEM培养基，将96孔板置于37±1℃、5±1％CO

步骤4：指标测定，按照CCK-8试剂盒详细说明书进行指标测定。对比案例1一种建立正常人口腔细胞模型的方法

步骤1：细胞培养，将人牙龈成纤维细胞以1×105/mL密度接种于25T中，加入适量内含10％胎牛血清的DMEM培养基，置于37±1℃、5±1％CO

步骤2：细胞铺板，用胰酶消化培养好的人牙龈成纤维细胞，消化时间为1-3分钟，制成细胞悬液后以1×10

步骤3：样品制备，刺激过后，用胰酶消化刺激完成的人牙龈成纤维细胞，消化时间为3-8分钟，清洗2-3次，制成细胞悬液备用；

步骤4：指标测定，按照CCK-8试剂盒、ROS检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、细胞凋亡与坏死检测试剂盒染色的详细说明书进行指标测定。

为了进一步说明本发明方案的技术效果，下面对部分实施例及对比例制备得到的乳液性能及微观结构进行试验分析。

实验例1不同浓度槟榔碱刺激下细胞存活率影响

以本发明的实施例1进行细胞存活率试验，结果见图1。

从图1可看出，相对于对比例1，随着实施例1的槟榔碱浓度的升高，其对细胞损害逐步增强，细胞存活率不断下降。同时，所选槟榔碱浓度对人牙龈成纤维细胞的毒性作用具有一定的梯度性，说明槟榔碱会损伤人牙龈成纤维细胞的活力，同时，本发明所选的槟榔碱浓度梯度较为适合。

实验例2不同浓度槟榔碱刺激下细胞的ROS生成影响

以本发明的实施例2进行ROS生成试验，结果见图2。

与对比例1对比，随着实施例2的槟榔碱浓度的升高，人牙龈成纤维细胞的活性氧水平也在提高。说明槟榔碱可以显著提高人牙龈成纤维细胞ROS的生成，同时，ROS水平也可以作为评判槟榔碱处理人牙龈成纤维细胞受损程度的指标之一。

实验例3不同浓度槟榔碱刺激下细胞的凋亡率影响

以本发明的实施例2进行细胞凋亡检测试验，结果见图3。

与对比例1对比，随着实施例2的槟榔碱浓度的升高，人牙龈成纤维细胞的凋亡率也在提高。说明槟榔碱可以显著提高人牙龈成纤维细胞的凋亡率，同时，细胞凋亡率也可以作为评判槟榔碱处理人牙龈成纤维细胞受损程度的指标之一。

实验例4不同浓度槟榔碱刺激下细胞的坏死率影响

以本发明的实施例2进行细胞坏死检测试验，结果见图4。

与对比例1对比，随着实施例2的槟榔碱浓度的升高，人牙龈成纤维细胞的坏死率也在提高。说明槟榔碱可以显著提高人牙龈成纤维细胞的坏死率，同时，细胞坏死率也可以作为评判槟榔碱处理人牙龈成纤维细胞受损程度的指标之一。

实验例5不同浓度铁皮石斛多糖对槟榔碱刺激的缓解作用

以本发明的实施例3进行细胞存活率试验，结果见图5。

与对比例1对比，实施例1.2显著地降低了人牙龈成纤维细胞的存活率，通过添加不同浓度的铁皮石斛多糖，人牙龈成纤维细胞的存活率相对于实施例1.2得到显著提升，但依旧比对比例1的存活率低，说明铁皮石斛多糖具有缓解槟榔碱对人牙龈成纤维细胞损伤的作用，同时，本发明所述模型可以应用于评价活性物质对缓解槟榔碱损伤口腔细胞的作用。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。