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基于水痘-带状疱疹病毒的重组表达载体、重组病毒及用途

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本申请公开了一种基于水痘‑带状疱疹病毒的重组表达载体、重组病毒及用途，重组表达载体采用病毒载体，装载于病毒载体上的核酸分子包括用于编码gE糖蛋白全长或gE糖蛋白的部分片段的第一核苷酸序列、用于编码IE63蛋白全长或IE63蛋白的部分片段的第二核苷酸序列，以及用于连接第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的连接序列，所述重组病毒是将所述重组表达载体转染病毒包装细胞，然后经细胞培养制备而成，所述重组表达载体或所述重组病毒可以用于制备治疗或预防水痘‑带状疱疹病毒的疫苗和/或药物，具有安全性高、免疫效果理想、无需添加佐剂、适用范围广的优点。

著录项

公开/公告号CN114891830A

专利类型发明专利
公开/公告日2022-08-12

原文格式PDF
申请/专利权人武汉博沃生物科技有限公司;
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申请/专利号CN202210350360.9
发明设计人慕婷;徐龙;赵萍;吴月;谢亮;王申;米歇尔·克莱因;吴克;
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申请日2022-04-02
分类号C12N15/861(2006.01);C12N15/863(2006.01);C12N15/86(2006.01);C12N15/38(2006.01);C12N7/01(2006.01);C07K14/04(2006.01);A61K48/00(2006.01);A61P31/22(2006.01);
代理机构深圳紫藤知识产权代理有限公司 44570;
代理人黄威
地址 430000 湖北省武汉市东湖高新区高新大道858号生物医药产业园中小企业园A9-2栋
入库时间 2023-06-19 16:20:42

法律信息

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态
2022-08-30

实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/861 专利申请号:2022103503609 申请日:20220402

实质审查的生效

说明书

技术领域

本申请涉及生物制药领域，具体涉及一种基于水痘-带状疱疹病毒的重组表达载体、重组病毒及用途。

背景技术

水痘-带状疱疹病毒(Varicella-Zoster Virus,VZV)属于疱疹病毒，其是一种直径为150纳米至200纳米的双链DNA病毒，呈球形，完整病毒包括核心、衣壳、内膜以及包膜。VZV初次感染时表现为水痘症状，即使治好水痘，VZV仍可终生潜伏于人体的颅神经和背根神经节，待人体免疫力低下时可被重新激活引起复发性感染，表现为带状疱疹。有研究发现，带状疱疹的终生发病风险为25％至30％，80岁后风险上升至50％。VZV引起的疾病及其相关后遗症(如带状疱疹愈后神经痛)已成为公共卫生领域不可忽视的重要问题之一。

目前，通常采用抗病毒药物(例如阿昔洛韦、伐昔洛韦、泛昔洛韦等)治疗水痘和带状疱疹，但不能预防VZV感染，接种疫苗仍然是预防/控制水痘和带状疱疹最有效和最可靠的措施，但是当前尚无能够同时预防水痘和带状疱疹的双重功效疫苗上市。现上市的水痘疫苗均为减毒活疫苗(例如减毒Oka疫苗)，对带状疱疹无预防效果或预防效果不理想，并且水痘减毒活疫苗可能会给接种者带来多重风险，例如引发罕见的严重并发症、导致免疫受损个体感染等，此外，部分接种者会出现潜伏的VZV被重新激活而罹患带状疱疹的问题。

现上市的带状疱疹疫苗较少并均具有佐剂成分，主要为Merck公司的Zostavax和GSK公司的Shingrix，中国国家药品监督管理局于2019年批准了Shingrix的进口注册申请，填补了国内带状疱疹疫苗的空白。Zostava具有不适用于60岁以上人群、预防效果一般的缺点，并且Zostava无法用于预防水痘感染，有研究发现，接种Zostava后的五年内对带状疱疹的预防保护率约为50％，接种Zostava后的八年对带状疱疹的预防保护率不再具有统计学意义。Shingrix适用于50岁以上人群，并且对带状疱疹的预防保护率可达90％，可降低带状疱疹愈后神经痛的风险，但Shingrix使用的佐剂为GSK公司的AS01，具有反应原性，不适宜作为水痘疫苗而用于儿童。

因此，迫切需要研发一种能够同时预防水痘和带状疱疹的双重功效疫苗，并且具有安全性高、免疫效果理想、副作用低、无潜伏风险等优点。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本申请提供了一种基于水痘-带状疱疹病毒的重组表达载体、重组腺病毒及用途。

本申请的技术方案如下：

第一方面，本申请提供了一种重组表达载体，用于表达水痘-带状疱疹病毒的gE糖蛋白全长或gE糖蛋白的部分片段，以及IE63蛋白全长或IE63蛋白的部分片段，所述重组表达载体包括载体以及装载于所述载体上的核酸分子，所述核酸分子包括：

第一核苷酸序列，用于编码所述gE糖蛋白全长或gE糖蛋白的部分片段；

第二核苷酸序列，用于编码所述IE63蛋白全长或IE63蛋白的部分片段；以及

连接序列，用于连接所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列，包括用于编码自剪切多肽的第三核苷酸序列和/或用作内部核糖体进入位点的第四核苷酸序列；

其中，载体为腺病毒、安卡拉牛痘病毒或水泡性口炎病毒。

可选的，所述第一核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者所述第一核苷酸序列为与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有不低于80％的同源性的核苷酸序列。

可选的，所述第二核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者所述第二核苷酸序列为与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有不低于80％的同源性的核苷酸序列。

可选的，所述自剪切多肽为2A肽，2A肽例如选自P2A、E2A、F2A或T2A。

可选的，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示或者如SEQ ID NO.12所示。

可选的，所述载体为基因组中缺失E1编码区和E3编码区的AdC68型黑猩猩腺病毒。

进一步地，所述载体为基因组中缺失E1编码区和E3编码区的AdC68型黑猩猩腺病毒。

可选的，所述第一核苷酸序列与所述第二核苷酸序列通过同一个表达框表达。

可选的，所述第一核苷酸序列与所述第二核苷酸序列通过不同的表达框表达。

第二方面，本申请提供了一种重组病毒，所述重组病毒是将如第一方面中任意一种所述的重组表达载体转染病毒包装细胞，然后经细胞培养制备而成。

第三方面，本申请提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面中任意一种所述的重组表达载体或如第二方面中所述的重组病毒。

可选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的佐剂和/或辅料，所述药物组合物为适用于肌内、皮下或粘膜施用的剂型。

第四方面，本申请提供了如第一方面中任意一种所述的重组表达载体、或如第二方面中所述的重组病毒、或如第三方面中任意一种所述的药物组合物的用途，所述重组表达载体、所述重组病毒或所述药物组合物用于制备治疗或预防水痘-带状疱疹病毒的疫苗和/或药物。

有益效果：本申请提供了一种基于水痘-带状疱疹病毒的重组表达载体、重组腺病毒及用途，其中，重组表达载体的载体为病毒载体，装载于载体上的核酸分子包括用于编码gE糖蛋白全长或gE糖蛋白的部分片段的第一核苷酸序列、用于编码IE63蛋白全长或IE63蛋白的部分片段的第二核苷酸序列，以及用于连接第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的连接序列，连接序列包括用于编码自剪切多肽的第三核苷酸序列和/或用作内部核糖体进入位点的第四核苷酸序列。所述重组表达载体通过表达系统表达后能产生独立的gE糖蛋白或gE糖蛋白的部分片段，以及IE63蛋白全长或IE63蛋白的部分片段。

所述重组病毒是将所述重组表达载体转染病毒包装细胞，然后经细胞培养制备而成，所述重组病毒可以用于制备治疗或预防水痘-带状疱疹病毒的疫苗和/或药物，以重组病毒为重组腺病毒为例，将所述重组腺病毒施用于受试者能够引起较强的体液免疫反应以及广泛的CD4+T细胞和CD8+T细胞免疫，从而产生高滴度的VZV抗体，采用所述重组腺病毒制备的疫苗无需添加佐剂，无需使用特殊仪器/设备(例如基因枪)即可进行接种，能够有效预防水痘和带状疱疹，具有安全性高、适用人群更广、副作用小、无潜伏风险的优点。

实验发现，经有效量的重组病毒免疫的试验小鼠血清特异性IgG抗体滴度是经有效量的市售水痘减毒疫苗免疫的试验小鼠血清特异性IgG抗体滴度的2.5倍至3.1倍；经有效量的重组病毒免疫的试验小鼠脾细胞特异性IFN-γ平均斑点数是经有效量的市售水痘减毒疫苗免疫的试验小鼠脾细胞特异性IFN-γ平均斑点数的50倍至70倍。相较于市售带状疱疹疫苗，本申请的重组病毒具有无需添加佐剂、有效降低反应原性、安全性更高的优点，并且rAdC68XY3-gE-IE63诱导细胞免疫的效果优于市售带状疱疹疫苗；相较于市售水痘减毒活疫苗，本申请的重组病毒具有免疫效果更佳和安全性更高的优点。

附图说明

下面结合附图，通过对本申请的具体实施方式详细描述，将使本申请的技术方案及其有益效果显而易见。

图1为本申请实施例1中gE-IE63基因片段(未示出Kozak序列)的结构示意图。

图2为本申请实施例1中pAdC68XY3-gE-IE63重组表达载体的结构示意图。

图3为本申请实施例中涉及的部分PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道M代表Marker；泳道1代表以正常HEK293细胞的全基因组DNA为模板，并以正向引物gE-F和反向引物gE-R作为引物对进行PCR扩增而获得的PCR产物；泳道2代表以pAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒质粒DNA为模板，并以正向引物gE-IE63-F和反向引物gE-IE63-R作为引物对进行PCR扩增而获得的PCR产物；泳道3代表以rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒基因组DNA为模板，并以正向引物gE-IE63-F和反向引物gE-IE63-R作为引物对进行PCR扩增而获得的PCR产物；泳道4代表以pAdC68XY3-IE63-gE-1质粒为模板，并以正向引物IE63-gE-F和反向引物IE63-gE-R作为引物对进行PCR扩增而获得的PCR产物。

图4为本申请实验例中rAdC68XY3-gE-IE63和rAdC68XY3-IE63-gE-1感染HEK293细胞48h后获得的待检样品的蛋白质印迹(Western Blot,WB)图谱一(检测gE蛋白表达)，其中，泳道M代表蛋白分子量Maker，泳道1代表正常HEK293细胞的细胞培养上清液(阴性对照)，泳道2代表gE胞外区蛋白，泳道3代表rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒感染HK293细胞48h后获得的细胞培养上清液，泳道4代表rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒感染HK293细胞48h后获得的细胞裂解液，泳道5代表rAdC68XY3-IE63-gE-1重组腺病毒感染HK293细胞48h后获得的细胞培养上清液，泳道6代表rAdC68XY3-IE63-gE-1重组腺病毒感染HK293细胞48h后获得的细胞裂解液。

图5为本申请实验例中rAdC68XY3-gE-IE63和rAdC68XY3-IE63-gE-1感染HEK293细胞48h后获得的待检样品的蛋白质印迹(Western Blot,WB)图谱二(检测IE63蛋白的表达)，其中，泳道M代表蛋白分子量Maker，泳道1代表rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒感染HK293细胞48h后获得的细胞培养上清液，泳道2代表rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒感染HK293细胞48h后获得的细胞裂解液，泳道3代表rAdC68XY3-IE63-gE-1重组腺病毒感染HK293细胞48h后获得的细胞培养上清液，泳道4代表rAdC68XY3-IE63-gE-1重组腺病毒感染HK293细胞48h后获得的细胞裂解液，泳道5代表正常HEK293细胞的细胞培养上清液(阴性对照)。

图6为本申请实施例2中IE63-gE-1基因片段(未示出Kozak序列)的结构示意图。

图7为本申请实施例3中IE63-gE-2基因片段(未示出Kozak序列)的结构示意图。

具体实施方式

本申请研究了一种基于水痘-带状疱疹病毒的重组表达载体、重组腺病毒及用途，所述重组表达载体包括载体以及装载于所述载体上的核酸分子，其中载体为腺病毒、安卡拉牛痘病毒或水泡性口炎病毒。核酸分子包括第一核苷酸序列、第二核苷酸序列以及用于连接第一核苷酸序列与第二核苷酸序列的连接序列，其中，第一核苷酸序列用于编码gE糖蛋白全长或gE糖蛋白的部分片段，第二核苷酸序列用于编码IE63蛋白全长或IE63蛋白的部分片段，连接序列包括用于编码自剪切多肽的第三核苷酸序列和/或与内部核糖体进入位点互补的第四核苷酸序列。

如本申请所用，“第一”、“第二”、“第三”和“第四”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性，也并非指示或暗示先后顺序。

如本申请所用，“gE糖蛋白”是VZV基因组的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)ORF68编码的一种糖蛋白，gE糖蛋白属于I型膜蛋白，其是生成感染性VZV颗粒所必需的糖蛋白，也是VZV包膜中含量最丰富、免疫原性最强的糖蛋白。gE糖蛋白存在于VZV颗粒的表面以及VZV感染细胞的胞质内，在VZV不同的成熟阶段中，gE糖蛋白以不同的糖基化形式存在。gE糖蛋白的部分片段例如可以是gE糖蛋白胞外区蛋白，在本申请实施例中，编码gE糖蛋白胞外区蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

如本申请所用，“IE63蛋白”是VZV早期复制所必需的功能性蛋白之一，VZV感染细胞后会大量表达IE63蛋白，并且在感染的皮肤表面通常能检测到IE63蛋白，IE63蛋白也是VZV在潜伏时表达最为丰富的蛋白。在本申请实施例中，编码IE63蛋白全长的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

如本申请所用，“核酸分子”是指由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，例如可以是通过聚合酶链式反应(PCR)或通过体外翻译产生的脱氧核糖核酸(DNA)片段、核糖核酸(RNA)片段以及寡核苷酸片段中的任意一种，以及通过连接、切割、内切核酸酶作用或外切核酸酶作用中的任意一种或多种产生的片段，可以是单链的或双链的。在本申请实施例中，核酸分子包括编码区和非编码区，非编码区例如包括启动子、内含子、外显子以及终止子中的一种或多种，非编码区还可以任选地包括增强子或其他表达调控元件。在本申请实施例中，核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

如本申请所用，“内部核糖体进入位点”是指信使RNA(mRNA)5’端非编码区的一段RNA序列，英文全称为Internal Ribosome Entry Site，简称IRES，允许核糖体直接在此序列结合mRNA并起始翻译，从而使蛋白质翻译起始不依赖5’端的帽子结构，可直接从信使mRNA中间起始翻译，能使一个转录本转译产生两个独立的完整蛋白质。

如本申请所用，“自剪切多肽”是指一类长18至22个氨基酸残基的肽片段，能诱导细胞内含有自身的重组蛋白自我剪切，从而使与其两侧相连的蛋白质成为两个独立的完整蛋白质。在本申请实施例中，“自剪切多肽”为2A肽，2A肽例如可以是P2A、E2A、F2A或T2A。

如本申请所用，“载体”是指能够运输另一种核酸的核酸分子，在本申请实施例中，将病毒作为载体，病毒例如可以是腺病毒、安卡拉牛痘病毒(MVA)、水泡性口炎病毒(VSV)等，腺病毒例如可以是Ad5型人腺病毒、Ad26型人腺病毒、AdC3型黑猩猩腺病毒、AdC7型黑猩猩腺病毒、AdC68型黑猩猩腺病毒等。在本申请的至少一个实施例中，载体为基因组中缺失E1编码区和E3编码区并且将E4-orf6区域替换为人Ad5型腺病毒的E4-orf6区域的AdC68型黑猩猩腺病毒，其不能在正常人体细胞中复制生产，只能在HEK293、Vero等细胞中复制生产，具有高度的安全性。在本申请的另一个实施例中，载体为安卡拉牛痘病毒。在本申请的另一个实施例中，载体为水泡性口炎病毒。

如本申请所用，“表达载体”是指一种DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的核酸分子，所述控制序列能够实现所述核酸分子在合适的表达系统中表达。在本申请实施例中，rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒属于表达载体。在本申请实施例中，表达载体例如是pAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒质粒。

在本申请的一些实施例中，第一核苷酸序列与第二核苷酸序列通过同一个表达框表达。

在本申请的一些实施例中，第一核苷酸序列与第二核苷酸序列通过不同的表达框表达。

如本申请所用，“表达框”是指开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，其包含一段可以编码目的蛋白的核苷酸序列，并且该核苷酸序列上具有起始密码子和终止密码子。

本申请实施例提供的重组病毒是将所述重组表达载体转染病毒包装细胞，然后经细胞培养制备而成，其中细胞例如可以是昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞等，哺乳动物细胞例如可以是COS(绿猴细胞系)、CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)、小鼠细胞、人类细胞等。在本申请的一些实施例中，重组病毒为重组腺病毒，对应的病毒包装细胞为HEK293细胞。

本申请提供的药物组合物包括所述重组表达载体或所述重组腺病毒。

如本申请所用，“药物组合物”包括治疗目的的组合物和免疫/预防目的的组合物，其中，“治疗目的”是指改善或减轻水痘或带状疱疹的至少一种症状，可以延迟水痘或带状疱疹的恶化或进展，或可以延迟或阻止其他相关疾病或并发症的发作。所述免疫/预防目的是指可以刺激或引起生物体产生免疫应答以达到预防水痘或带状疱疹感染目的。药物组合物例如可以是以病毒作为载体的疫苗，如腺病毒VZV疫苗，药物组合物例如还可以是药物制剂。在本申请的一个实施例中，药物组合物包括rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒。

如本申请所用，“免疫”是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排出抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能，包括天然免疫和获得性免疫。在本申请的一个实施例中，通过对受试者注射有效量的rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒，而引起机体免疫系统针对免疫原(gE糖蛋白胞外蛋白和IE63蛋白)的免疫应答反应。

如本申请所用，“受试者”是指能够发生细胞免疫应答的任何生物体，包括人类和其他哺乳类动物，还包括已被VZV感染且尚未治愈、曾被VZV感染且已治愈或具有VZV感染风险的任何个体。落入本申请范围内的合适的哺乳类动物包括但不限于：灵长类、家畜(例如羊、牛、马、猴、猪等)、实验室试验动物(例如兔、鼠等)、宠物(例如猫、狗等)和圈养野生动物(例如狼、狐狸、鹿等)。在本申请实施例中，受试者为试验小鼠。

如本申请所用，“有效量”是指足以以统计上显著的方式导致正在治疗的疾病的一种或多种症状改善的给药剂量，或是能够刺激细胞免疫应答以达到预防疾病目的的给药剂量。有效量取决于众多因素，例如：药物的活性、采用的递送方式等，且可以由本领域技术人员根据对象的个体情况容易地确定。

在本申请的一些实施例中，药物组合物还包括药学上可接受的辅料。

如本申请所用，“辅料”是指生产药物组合物和调配处方时所用的赋形剂和附加剂，具有赋形、保护活性成分、提高稳定性、增溶、助溶、缓控释等重要功能，以使药物组合物达到一定的保质期和生物利用度，从而提高药物组合物的安全性和有效性。可与本申请的药物组合物共同施用的辅料包括但不限于糖、蛋白、氨基酸和高分子聚合物。

在本申请的一些实施例中，药物组合物为适用于肌内、皮下或粘膜施用的剂型。其中，适用于粘膜施用的所述药物组合物的剂型为口服剂、气溶胶吸入剂、滴鼻剂以及喷雾剂中的至少一种；适用于肌内或皮下施用的所述药物组合物的剂型为注射剂。

本领域技术人员可以理解的是，本申请还提供了药物组合物的免疫方式，包括：鼻喷给药、滴鼻给药、气溶胶吸入式给药、肌肉注射、皮下注射、口服给药等。优选采用肌肉注射的免疫方式。

本申请还提供了所述重组表达载体或所述重组病毒或所述药物组合物的用途，所述重组表达载体、所述重组病毒或所述药物组合物用于制备治疗或预防水痘-带状疱疹病毒的疫苗和/或药物。

本申请还提供了一种免疫方法，使用所述重组表达载体、所述重组病毒或所述药物组合物对受试者进行免疫，使得受试者体内同时产生IE63蛋白和gE糖蛋白以协同增效刺激受试者的细胞免疫应答反应，产生高滴度的VZV抗体。

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下列实施例中涉及的动物实验在GLP(Good Laboratory Practice)实验室条件下开展，并按照“动物福利伦理审查实验室动物指南”处理动物。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。

Ⅰ、本申请实施例中涉及细胞、质粒以及病毒的说明详见下表1：

表1本申请实施例中涉及细胞、质粒、病毒及动物的说明

Ⅱ、本申请实施例中涉及的基因片段、蛋白、试剂、溶液以及培养基的说明：

本申请实施例中涉及的除引物之外的基因片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

本申请实施例中涉及的所有引物是由武汉擎科生物技术有限公司合成。

本申请实施例中涉及的限制性内切酶(如：(如：NotI、KpnI、XmaI、BamHI和PacI))、归位内切酶(如：PI-SceI和I-CeuI)、连接酶(如：T4连接酶)、酶切缓冲液(10×NEBCutSmart buffer)、PCR反应混合液(2×PrimerSTAR mix)以及双蒸水(ddH

本申请实施例中涉及的胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒以及病毒RNA/DNA提取试剂盒均购自美国的Axygen公司。

本申请实施例中涉及的Lipofectamine

本申请实施例中涉及的PVDF(Polyvinylidene-Fluoride)膜购自美国默克(Merck)公司。

本申请实施例中涉及的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG购自上海碧云天生物技术有限公司。

本申请实施例中涉及的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)购自美国的KPL公司。

本申请实施例中涉及的MEM培养基和DMEM培养基均购自美国的Hyclone实验室，LB培养基为自行配制，每100mL的LB液体培养基中包括：1.0g的蛋白胨，0.5g的酵母粉，以及1.0g的NaCl，对于LB固体培养基是在LB液体培养基配方的基础上添加20g/L的琼脂。

本申请实验例中涉及的Elispot板购自深圳市达科为生物技术股份有限公司。

本申请实验例中涉及的碳酸钠缓冲液(pH为9.6)配方为：1000mL的碳酸钠缓冲液中，包括8.4g的碳酸氢钠(NaHCO

本申请实验例中涉及的PBST缓冲液为含有0.1％(质量百分数)吐温-20的PBS缓冲液。

本申请实验例中涉及的封闭液为含有10％(质量百分数)脱脂奶粉的PBS缓冲液。本申请实验例中涉及的RPMI-1640培养基购自SIGMA公司(货号为R6504)。

Ⅲ、重组病毒表达gE糖蛋白胞外区和IE63蛋白的实验过程说明

以rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒的表达为例进行说明，具体包括如下步骤：

S1、将HEK293细胞按5×10

S2、当单孔内HEK293细胞的汇合率达到90％时，将rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒接种于对应孔内，rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒按照感染复数(Multiplicity OfInfection,MOI)0.2进行接种，并设置未接种有rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒的HEK293细胞作为阴性对照，在37℃的条件下静置培养48h，培养结束后先将粘壁细胞刮于细胞培养液中，再将细胞培养液离心，并分别收集上清液和沉淀，将该上清液标记为细胞培养上清液；向沉淀中加入100μL的哺乳动物细胞裂解液并置于冰上裂解，裂解充分后3500×g离心5min，取上清标记为细胞裂解液；

S3、制备细胞培养上清液待检样品和细胞裂解液待检样品：分别取80μL的细胞培养上清液和80μL的细胞裂解液，然后分别加入20μL五倍浓缩的SDS-PAGE上样缓冲液(5×SDS-PAGE Loading Buffer)，并分别在100℃下煮沸5min，分别获得细胞培养上清液待检样品和细胞裂解液待检样品；

S4、结合聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western Blot,WB)技术检测步骤S300获得的细胞培养上清液待检样品和细胞裂解液待检样品中gE糖蛋白胞外区蛋白和IE63蛋白表达。

其中，结合SDS-PAGE和WB技术检测步骤S3获得的细胞培养上清液待检样品和细胞裂解液待检样品中gE糖蛋白胞外区蛋白表达的方法包括如下步骤：

S401、将步骤S3的细胞培养上清液待检样品和细胞裂解液待检样品进行8％SDS-PAGE电泳，电泳条件为：(ⅰ)保持电压100V的电压条件20min；(ⅱ)保持电压160V的电压条件80min；

S402、电泳结束后用湿转法将目的蛋白(gE糖蛋白胞外区蛋白)转印至PVDF膜，然后将附着有目的蛋白的PVDF膜浸泡于含5％(质量百分比)脱脂奶粉的PBST溶液中，在4℃下封闭过夜；

S403、采用PBST溶液清洗封闭后的PVDF膜两次，然后将PVDF膜浸泡于鼠抗gE蛋白单克隆抗体稀释液(稀释比例为1:5000)中，在37℃下孵育1h；

S404、采用PBST溶液清洗完成步骤S403的PVDF膜两次，然后将PVDF膜浸泡于辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG稀释液(稀释比例为1:5000)中，在37℃下孵育1h；

S405、采用PBST溶液清洗完成步骤S404的PVDF膜两次，然后将ECL显色液加至于PVDF膜的附着有目的蛋白的一面上，化学发光法显色。

结合SDS-PAGE和WB技术检测步骤S3获得的待检样品中IE63蛋白表达的方法参照步骤S401至S405进行，仅需将步骤S403中的鼠抗gE蛋白单克隆抗体稀释液替换为兔抗IE63多克隆抗体稀释液(稀释比例1:1000)。

本申请实施例中其他重组病毒的表达参照上述实验过程，其中，重组rMVA-gE-IE63病毒和rVSV-gE-IE63表达所使用的感染细胞均为BHK-21细胞，并且对应步骤S2中的MOI为5。

下面结合实施例、对比例和实验例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例1

本实施例提供了一种rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒，制备方法如下：

1.1、制备pShuttle-gE-IE63重组质粒

本实施例选择未插入外源基因的pShuttle-CMV质粒作为pShuttle-gE-IE63重组质粒的载体，pShuttle-CMV质粒为穿梭型质粒，其上含有CMV增强子、CMV启动子、T7启动子、嵌合内含子、bGH poly(A)加尾信号以及NotI和KpnI双酶切位点，并且具有卡那霉素(Kanamycin,Kana)抗性。

将gE-IE63基因片段插入至pShuttle-CMV质粒的多克隆位点以获得pShuttle-gE-IE63重组质粒，其中，图1示出了gE-IE63基因片段(未示出Kozak序列)的结构组成，gE-IE63基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示(包含Kozak序列)，gE-IE63基因片段包括编码gE糖蛋白胞外区的第一核苷酸序列、编码IE63蛋白全长的第二核苷酸序列，以及用于连接第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的第三核苷酸序列，其中，第一核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，第二核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，第三核苷酸序列为编码自剪切多肽P2A的核苷酸序列。gE-IE63基因片段还包括设置于起始密码子前面的Kozak序列，以及添加于第一核苷酸序列端部的用于编码Js信号肽的核苷酸序列，Js信号肽位于gE糖蛋白胞外区的N端。gE糖蛋白胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，IE63蛋白全长的氨基酸序列如SEQID NO.5所示，gE-IE63基因片段经表达形成的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

pShuttle-gE-IE63重组质粒的制备方法包括如下步骤：

S1.1.1、在gE-IE63基因片段的3’端和5’端分别添加NotI和KpnI酶切位点，然后进行基因合成；

S1.1.2、采用NotI和KpnI限制性内切酶对步骤S1.1.1合成的基因片段进行双酶切，酶切完全后采用胶回收试剂盒回收长度约为2517bp的目的基因片段；

S1.1.3、采用NotI和KpnI限制性内切酶对未插入外源基因的pShuttle-CMV质粒进行双酶切，酶切完全后采用胶回收试剂盒回收长度约为4093bp的质粒骨架；

S1.1.4、在T4连接酶的作用下，将步骤S1.1.2的目的基因片段与步骤S1.3的质粒骨架置于16℃连接过夜，获得连接产物；

S1.1.5、采用热激转化方式将步骤S1.1.4的连接产物导入至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，然后涂布于含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上，37℃静置培养过夜后挑取单菌落依次进行LB液态培养、提取质粒和质粒测序操作，测序结果正确的质粒即为pShuttle-gE-IE63重组质粒。

对上述步骤需要说明的是，步骤S1.1.3可以在步骤S1.1.1和步骤S1.1.2之前进行，也可以与步骤S1.1.1和步骤S1.1.2同时进行。

1.2、制备pAdC68XY3-gE-IE63重组表达载体

pAdC68XY3-gE-IE63重组表达载体为pAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒质粒，具有如图2所示的结构，选择自行构建的pShuttle-gE-IE63重组质粒和商购的pAdC68XY3-GFP重组质粒制备pAdC68XY3-gE-IE63重组表达载体，pAdC68XY3-gE-IE63重组表达载体的制备方法包括如下步骤：

S1.2.1、采用PI-SceI和I-CeuI归位内切酶对pShuttle-gE-IE63重组质粒进行双酶切，酶切完全后采用胶回收试剂盒回收长度约为3780bp的目的基因片段，目的基因片段包括gE-IE63基因片段以及用于表达gE糖蛋白胞外区蛋白和IE63蛋白的表达框，其中，gE糖蛋白胞外区蛋白和IE63蛋白共用一个表达框；

S1.2.2、采用PI-SceI和I-CeuI归位内切酶对pAdC68XY3-GFP重组质粒进行双酶切，酶切完全后采用胶回收试剂盒回收长度约为33062bp的载体骨架；

S1.2.3、在T4连接酶的作用下，将步骤1.2.1的目的基因片段与步骤1.2.2的载体骨架置于16℃连接过夜，获得pAdC68XY3-gE-IE63连接产物；

S1.2.4、采用热激转化方式将步骤S1.2.3的pAdC68XY3-gE-IE63连接产物导入至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，然后涂布于含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上，37℃静置培养过夜后挑取单菌落依次进行LB液态培养、提取质粒和质粒测序操作，测序结果正确的质粒即为pAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒质粒；

S1.2.5、采用PacI限制性内切酶酶切步骤S1.2.4的pAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒质粒，以使pAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒质粒线性化，其中，酶切体系为50μL，酶切体系包括：5μL的酶切缓冲液(10×NEB CutSmart buffer)，5μL的PacI限制性内切酶，10μg的pAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒质粒，余量为双蒸水(ddH2O)，酶切温度为37℃，酶切时间为3h，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后，采用PCR产物回收试剂盒回收酶切产物，并采用微量核酸定量仪对回收的酶切基因片段进行定量分析。

1.3、制备rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒以及鉴定rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒基因组中的gE-IE63基因片段

对步骤S1.2.5回收的酶切基因片段进行转染操作，采用LipofectamineTM2000试剂盒进行转染操作，并选择HEK293细胞作为表达系统。根据LipofectamineTM2000试剂盒的操作说明，将酶切基因片段转染于汇合度为60～70％的HEK293细胞内。

在LipofectamineTM2000试剂盒操作说明的“接种细胞”步骤中，用于培养HEK293细胞的培养基为MEM培养基，并在转染前2h将MEM培养基更换为DMEM培养基。转染5h后，更换培养基为含10％(体积百分比)胎牛血清的DMEM培养基。

转染隔日，在倒置显微镜下观察细胞病变，直至60％的HEK293细胞出现噬斑时收集细胞。将收集的细胞在室温(25℃)与-80℃之间反复冻融3次，然后在1200×g的转速下离心5min，收集上清液，获得的上清液中包含rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒，并将上清液分装后置于-80℃超低温冰箱保存备用。

针对gE-IE63基因片段设计用于PCR扩增的正向引物gE-IE63-F和反向引物gE-IE63-R，其中，正向引物gE-IE63-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物gE-IE63-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

采用病毒RNA/DNA提取试剂盒对上述保存的上清液进行全基因组提取操作，然后以提取的rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒基因组DNA为模板，在正向引物gE-IE63-F和反向引物gE-IE63-R的存在下进行PCR扩增，其中PCR反应体系为10μL，PCR反应体系由5μL的PCR反应混合液(2×PrimerSTAR mix)、1μL的正向引物gE-IE63-F、1μL的反向引物gE-IE63-R、0.5μL的模板以及3μL的ddH

PCR反应结束后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并将以正常HEK293细胞的全基因组DNA作为模板进行PCR获得的PCR产物作为阴性对照，将以pAdC68XY3-gE-IE63质粒作为模板进行PCR获得的PCR产物作为阳性对照，1％琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示。采用胶回收试剂盒切胶回收目的条带并测序，测序结果正确代表目的条带即为gE-IE63基因片段。

1.4、rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒的纯化及检定

1.4.1、小规模扩增rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒

具体包括如下步骤：

S1.4.1.1、提供汇合度为90％的HEK293细胞，将rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒按照MOI 2接种于所述HEK293细胞中，并置于37℃、5％(体积百分比)CO2的培养箱内静置培养；

S1.4.1.2、待培养至70％以上的HEK293变圆和脱落时，使用细胞刮将粘壁细胞刮下，然后将细胞培养液2265×g离心10min，并分别收集上清液和细胞沉淀；

S1.4.1.3、将步骤S1.4.1.2收集的细胞沉淀重悬于PBS缓冲液中，并在室温(25℃)与-80℃之间反复冻融3次，2265×g离心10min以收集上清液，并将收集的上清液与步骤S1.4.1.2收集的上清液合并，获得rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒保存液。

1.4.2、纯化rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒

具体包括如下步骤：

S1.4.2.1、在生物安全柜中，向一50mL的离心管中缓慢加入12mL密度为1.4g/mL的氯化铯溶液，然后加入9mL密度为1.2g/mL的氯化铯溶液，接着在不连续梯度的顶部加入13mL的rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒保存液，获得待纯化的rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒样品；

S1.4.2.2、将步骤S1.4.2.1中待纯化的rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒样品置于4℃、100000×g离心120min，离心后抽吸病毒带，获得含rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒的溶液；

S1.4.2.3、将步骤S1.4.2.2中含rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒的溶液转移至无菌的离心管内，向其中加入等体积的10mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH为7.9)，获得稀释的rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒悬液；

S1.4.2.4、另取一离心管，向其中加入20mL密度为1.35g/mL的氯化铯溶液，然后在氯化铯溶液的顶部加入15mL的步骤S5.2.3中稀释的rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒悬液，平衡所述离心管后，置于4℃、100000×g离心18h，离心后收集蓝白色病毒带；

S1.4.2.5、将步骤S1.4.2.4获得的蓝白色病毒带置于10000道尔顿的纤维素酯膜中，然后在4℃下透析至PBS溶液中以去除氯化铯，获得纯化的rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒溶液，加入10％(体积百分数)甘油后分装存于-80℃冰箱中以备用。

1.4.3、rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒的滴度检定

采用腺病毒滴度-TCID

1.4.4采用SDS-PAGE和WB技术鉴定rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒表达gE糖蛋白胞外区和IE63蛋白

如图4和图5所示，rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒感染HK293细胞48h后获得的细胞培养上清液待检样品和细胞裂解液待检样品中均能检测到gE糖蛋白胞外区蛋白，并且细胞裂解液待检样品中能够检测到IE63蛋白，说明rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒在HEK293细胞中成功地表达了gE糖蛋白胞外区蛋白和IE63蛋白。

实施例2

本实施例提供了一种rAdC68XY3-IE63-gE-1重组腺病毒，相较于实施例1的rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒，本实施例中rAdC68XY3-IE63-gE重组腺病毒的区别之处在于：将目的基因片段由“gE-IE6”替换为“IE63-gE-1”。图6示出了IE63-gE-1基因片段的结构组成(未示出Kozak序列)，IE63-gE-1基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示(未示出Kozak序列)，IE63-gE-1基因片段包括依次设置的第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、用于编码Js信号肽的核苷酸序列和第一核苷酸序列，其中，各个核苷酸序列的信息参照实施例1，IE63-gE-1基因片段经表达形成的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

本实施例中rAdC68XY3-IE63-gE-1重组腺病毒的制备方法参照实施例1进行，制备过程中构建的重组表达载体为pAdC68XY3-IE63-gE-1质粒，验证PCR中采用的引物对为：正向引物IE63-gE-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)和反向引物IE63-gE-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)，纯化的rAdC68XY3-IE63-gE-1重组腺病毒滴度为6.2×10

如图4和图5所示，rAdC68XY3-IE63-gE-1重组腺病毒感染HK293细胞48h后获得的细胞培养上清液待检样品和细胞裂解液待检样品中均能检测到gE糖蛋白胞外区蛋白，并且细胞裂解液待检样品中能够检测到IE63蛋白，说明rAdC68XY3-IE63-gE-1重组腺病毒在HEK293细胞中成功地表达了gE糖蛋白胞外区蛋白和IE63蛋白。

实施例3

本实施例提供了一种rAdC68XY3-IE63-gE-2重组腺病毒，相较于实施例1的rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒，本实施例中rAdC68XY3-IE63-gE重组腺病毒的区别之处在于：将目的基因片段由“gE-IE6”替换为“IE63-gE-2”。图7示出了IE63-gE-2基因片段的结构组成(未示出Kozak序列)，IE63-gE-2基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示(未包含Kozak序列)，IE63-gE基因片段包括依次设置的用于编码Js信号肽的核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列和第一核苷酸序列，其中，各个核苷酸序列的信息参照实施例1，IE63-gE-2基因片段经表达形成的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

本实施例中rAdC68XY3-IE63-gE-2重组腺病毒的制备方法参照实施例1进行，纯化的rAdC68XY3-IE63-gE-2重组腺病毒滴度为5.8×10

实施例4

本实施例提供了一种rAd5-gE-IE63重组腺病毒，相较于实施例rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒，本实施例中rAd5-gE-IE63重组腺病毒的区别之处仅在于：将载体由“pAdC68XY3”替换为人5型腺病毒载体rAd5-CMV-Dest，并且将gE-IE63基因片段插入至人5型腺病毒载体rAd5-CMV-Dest的E1区域。

本实施例中rAd5-gE-IE63重组腺病毒的制备方法参照实施例1进

行，纯化的rAd5-gE-IE63重组腺病毒为5.0×10

实施例5

本实施例提供了一种rMVA-gE-IE63重组腺病毒，相较于实施例rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒，本实施例中rMVA-gE-IE63重组腺病毒的区别之处仅在于：将载体由“pAdC68XY3”替换为安卡拉牛痘病毒MVA。

rMVA-gE-IE63重组腺病毒的制备方法包括如下步骤：

S4.1、构建pLW-73-gE-IE63表达载体：参照专利ZL200780035385.3构建获得pLW-73载体，将gE-IE63基因片段经PCR扩增后使用XmaI和BamHI双酶切以获得酶切产物，采用XmaI和BamHI双酶切pLW-73载体后获得的载体骨架与所述酶切产物连接，并将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态，37℃培养过夜后挑取测序正确的阳性克隆子。

S4.2、制备rMVA-gE-IE63重组腺病毒：将MVA病毒(Ankara株)按照MOI 0.01感染BHK-21细胞1h，然后将步骤S4.1构建的pLW-73-gE-IE63表达载体转染BHK-21细胞72h，离心收集细胞，采用DMEM重悬收集的细胞获得细胞悬浮液，将细胞悬浮液置于-60℃/37℃反复冻融三次后，超声1min，收集病毒液并分装，接着依照专利ZL200780035385.3记载的方法进行6～7轮空斑纯化，筛选获得阳性病毒；将阳性病毒按照MOI 5感染汇合度约90％的BHK-21细胞，37℃培养72h后离心，离心收集细胞，采用DMEM重悬收集的细胞获得细胞悬浮液，将细胞悬浮液置于-60℃/37℃反复冻融三次后，超声1min，收集病毒液，再将收集的病毒液进行氯化铯密度梯度离心纯化，获得纯化的rMVA-gE-IE63重组腺病毒液，采用SDS-PAGE和WB技术鉴定rMVA-gE-IE63重组腺病毒表达gE糖蛋白胞外区和IE63蛋白。

S4.3、测定rMVA-gE-IE63重组腺病毒的滴度：采用完全DMEM培养基对纯化的rMVA-gE-IE63重组腺病毒进行10倍系列稀释，对应10

实施例6

本实施例提供了一种rVSV-gE-IE63重组腺病毒，相较于实施例rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒，本实施例中rVSV-gE-IE63重组腺病毒的区别之处仅在于：将载体由“pAdC68XY3”替换为水泡性口炎病毒VSV。

S5.1、构建重组表达载体：参照文献(N D Lawson,E A Stillman,M A Whitt andJ K Rose.Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA[J].PNAS,1995:Vol.92,4477-4481)构建获得pVSVFL(+)质粒，同时依照文献方法从pET28a载体中扩增T7终止子，并分别同N、P、L基因进行融合PCR后插入pSK(+)质粒中以获得pSK-N质粒、pSK-P和pSK-L质粒；继续参照文献方法，在gE-IE63基因片段经PCR扩增后的产物的5’端加入MluI酶切位点，并在3’端加入NheI酶切位点，然后使用MluI和NheI分别双酶切pVSVFL(+)质粒和gE-IE63基因片段，接着采用T4连接酶将酶切后的载体和基因片段相连获得连接产物，将连接产物转化至DH5α大肠杆菌感受态，37℃培养过夜后挑取测序正确的阳性克隆子，获得重组pVSV-gE-IE63质粒；

S5.2、制备rVSV-gE-IE63重组腺病毒：采用含有10％FBS的DMEM培养基培养BHK-21细胞，待细胞汇合度约为70％时，将vTF7-3病毒按照MOI 10感染BHK-21细胞，37℃培养30min后将pVSV-gE-IE63质粒、pSK-N质粒、pSK-P和pSK-L质粒使用lip 2000转染BHK-21细胞，pVSV-gE-IE63质粒：pSK-N质粒：pSK-P：pSK-L质粒的质量比为10：5：4：2，并将转染后的细胞继续置于37℃培养56h，离心收集细胞，并置于-60℃/37℃反复冻融三次，12000r/min离心5min，并收集上清液；取5mL的上清液再次感染BHK-21细胞，置于37℃培养48h后收集裂解物，1250×g离心10min收集上清，然后将上清经0.22μm过滤以去除绝大多数饿痘病毒，获得rVSV-gE-IE63重组腺病毒。

S5.3、rVSV-gE-IE63重组腺病毒的扩增与纯化：将步骤S5.2制得的rVSV-gE-IE63重组腺病毒按照MOI 0.1感染BHK-21细胞，37℃培养48h后离心收集细胞，并置于-60℃/37℃反复冻融三次，12000r/min离心5min，收集病毒上清液；取20mL的病毒上清液加入至一SW40离心管中，并从离心管的底部缓慢加入20mL的10％蔗糖溶液，置于28000r/min离心2h，弃上清并收集沉淀，采用PBS缓冲液重悬沉淀以制得纯化的rVSV-gE-IE63重组腺病毒液，采用SDS-PAGE和WB技术鉴定rVSV-gE-IE63重组腺病毒表达gE糖蛋白胞外区和IE63蛋白。

S4.3、测定rVSV-gE-IE63重组腺病毒的滴度：将浓度为5×10

对比例1

本对比例提供了一种rAdC68XY3-gE重组腺病毒，相较于实施例1的rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒，本实施例中rAdC68XY3-IE63-gE重组腺病毒的区别之处在于：将目的基因片段由“gE-IE6”替换为“gE”，gE基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，其由如SEQ IDNO.1所示的第一核苷酸序列、添加于第一核苷酸序列端部的用于编码Js信号肽的核苷酸序列以及设置于起始密码子前面的Kozak序列组成，Js信号肽位于gE糖蛋白胞外区的N端。

本实施例中rAdC68XY3-IE63-gE-2重组腺病毒的制备方法参照实施例1进行，其中，鉴定rAdC68XY3-gE重组腺病毒基因组中的gE基因片段所用的引物对为：正向引物gE-F和反向引物gE-R，其中，正向引物gE-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，反向引物gE-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。如图4所示，rAdC68XY3-gE重组腺病毒感染HK293细胞48h后获得的细胞培养上清液待检样品和细胞裂解液待检样品中均能检测到gE糖蛋白胞外区蛋白，说明rAdC68XY3-gE重组腺病毒在HEK293细胞中成功地表达了gE糖蛋白胞外区蛋白。纯化的rAdC68XY3-gE重组腺病毒滴度为2.9×10

对比例2

本对比例提供了一种rAdC68XY3-GFP重组腺病毒，制备方法包括如下步骤：

S1’、采用PacI限制性内切酶酶切pAdC68XY3-GFP重组病毒质粒，以使pAdC68XY3-GFP重组病毒质粒线性化，其中，酶切体系为50μL，酶切体系包括：5μL的酶切缓冲液(10×NEB CutSmart buffer)，5μL的PacI限制性内切酶，10μg的pAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒质粒，余量为双蒸水(ddH

S2’、步骤S1’中酶切完全后，采用PCR产物回收试剂盒回收酶切产物，并采用微量核酸定量仪对回收的酶切基因片段进行定量分析；

S3’、将步骤S2’回收的酶切基因片段进行转染操作，采用LipofectamineTM2000试剂盒进行转染操作，并选择HEK293细胞作为表达系统，根据LipofectamineTM2000试剂盒的操作说明，将酶切基因片段转染于汇合度约为70％的HEK293细胞内，其中，在LipofectamineTM2000试剂盒操作说明的“接种细胞”步骤中，用于培养HEK293细胞的培养基为MEM培养基，并在转染前2h将MEM培养基更换为DMEM培养基，转染5h后，更换培养基为含10％(质量百分比)胎牛血清的DMEM培养基；

S4’、在步骤S3’的转染隔日，在倒置显微镜下观察细胞病变，直至60％的HEK293细胞出现噬斑时收集细胞，将收集的细胞在室温(25℃)与-80℃之间反复冻融三次，然后在1200×g的转速下离心5min，收集上清液，获得的上清液中包含rAdC68XY3-GFP重组腺病毒；

S5’、将步骤S4’的上清液按照上述5.1和5.2依次进行小规模扩增和纯化操作，获得纯化的rAdC68XY3-GFP重组腺病毒，纯化的rAdC68XY3-GFP重组腺病毒滴度为1.0×10

实验例1

本实验例旨在比较实施例1至实施例6、对比例1和对比例2的重组病毒以及市售水痘减毒活疫苗的特异性IgG抗体几何平均滴度差异。

选取五十四只试验小鼠(约3～7天时间适应环境)，动物经检验检疫后随机分为八组，每组六只，每组的具体情况详见下表2：

表2为实验例1中分组情况一览表

对各组的试验小鼠进行肌肉注射免疫，每只每次免疫0.1mL，每3周免疫一次，共免疫二次，第二剂免疫二十一天后眼眶取血，其中，每只试验小鼠接受的对应重组病毒的免疫量均过量，以确保每只试验小鼠均被有效感染。采用酶联免疫反应(Enzyme LinkedImmunoSorbent Assay,ELISA)法检测试验小鼠血清中特异性IgG抗体滴度，包括如下步骤：

实验结果如表3所示：

表3实验组1至实验组8以及阴性对照组的小鼠血清特异性IgG抗体滴度一览表

由表3的实验数据可知，实验组1至实验组6中重组病毒的特异性IgG抗体几何平均滴度明显优于实验组7、实验组8以及阴性对照组的特异性IgG抗体几何平均滴度，说明rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒、rAdC68XY3-IE63-gE-1重组腺病毒、rAdC68XY3-IE63-gE-2重组腺病毒、rAd5-gE-IE63重组腺病毒、rMVA-gE-IE63重组腺病毒以及rMVA-gE-IE63重组腺病毒均能诱导机体产生特异性IgG抗体，并且rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒诱导机体产生特异性IgG抗体的水平最高。例如，实验组1的特异性IgG抗体几何平均滴度是实验组7的特异性IgG抗体几何平均滴度的3.1倍，并且是实验组8的特异性IgG抗体几何平均滴度的1.3倍，说明：gE糖蛋白的胞外区蛋白和IE63蛋白对刺激免疫应答具有协同增效的作用，能够诱导产生更多的特异性IgG抗体。相较于市售水痘减毒活疫苗，实验组1至实验组6的重组病毒具有诱导机体产生抗体水平高、无需添加佐剂、安全性高、免疫效果理想的优点。

由实施组1至实验组3的实验数据可知，rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒的免疫效果明显优于rAdC68XY3-IE63-gE-1重组腺病毒和rAdC68XY3-IE63-gE-2重组腺病毒，并且rAdC68XY3-IE63-gE-1重组腺病毒的免疫效果优于和rAdC68XY3-IE63-gE-2重组腺病毒，原因可能是：相较于IE63蛋白，gE蛋白更有利于诱导机体产生抗体，而编码gE蛋白的核苷酸序列与编码Js信号肽的核苷酸序列直接相连，当蛋白表达时，有利于表达的gE蛋白更好地与Js信号肽结合，从而使更多的gE蛋白分泌至细胞外发挥免疫作用。

实验例2

本实验例旨在比较实施例1至实施例6、对比例1和对比例2的重组病毒、市售水痘减毒活疫苗以及市售带状疱疹疫苗对小鼠脾细胞特异性T细胞免疫效果差异。

选取六十只试验小鼠(约3～7天时间适应环境)，动物经检验检疫后随机分为八组，每组六只，每组的具体情况详见下表4：

表4为实验例1中分组情况一览表

对各组的试验小鼠进行肌肉注射免疫，每只每次免疫0.1mL，每3周免疫一次，共免疫二次，第二剂免疫二十一天后取各组试验小鼠的脾细胞，其中，每只试验小鼠接受的对应重组病毒的免疫量均过量，以确保每只试验小鼠均被有效感染。采用酶联免疫斑点技术(Enzyme Linked Immunospot Assay,ELISpot)方法检测小鼠脾细胞特异性T细胞免疫效果，包括如下步骤：

Sa’、向预包被有干扰素-γ(IFN-γ)和IL-4抗体的Elispot板加入RPMI-1640培养基，每孔加入200μL的RPMI-1640培养基，室温静置10min后倒去液体以备用；

Sb’、配制含有多肽刺激物的脾细胞悬浮液，其中，脾细胞悬浮液的溶液为含有10％(质量百分数)胎牛血清的RPMI 1640培养基，脾细胞悬浮液中脾细胞的浓度为5×10

Sc’、向完成步骤Sa’的Elispot板中加入步骤Sb’的脾细胞悬浮液，每种脾细胞悬浮液做三个复孔，每孔加入100μL的脾细胞悬浮液，然后将Elispot板置于37℃孵育54h；

Sd’、步骤Sc’孵育结束后，按照Elispot板的说明书进行斑点显色操作，并使用酶联斑点成像系统进行斑点计数，计算5×10

实验结果如表5所示：

表5实验组1至实验组9以及阴性对照组的特异性IFN-γ平均斑点数一览表

由表5的实验数据可知，实验组1的特异性IFN-γ平均斑点数为934，实验组9的特异性IFN-γ平均斑点数为878，实验组7的特异性IFN-γ平均斑点数为13，说明单独使用gE糖蛋白作为免疫原，以及将gE糖蛋白和IE63蛋白联合作为免疫原均可以诱导较强的特异性T细胞免疫，但gE糖蛋白和IE63蛋白联合作为免疫原诱导T细胞免疫的效果更佳。

实验组1的细胞免疫效果明显优于其他实验组和阴性对照组，其中，实验组1的细胞免疫效果略高于实验组9，但实验组9所对应的市售带状疱疹疫苗需要额外添加佐剂，实验组1所对应的rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒制成疫苗无需添加佐剂，具有安全性更高的优点。

此外，实验组1至6以及实验组8和实验组9的特异性IL-4平均斑点数之间差异不大，说明无论是单独使用gE糖蛋白作为免疫原，还是将gE糖蛋白和IE63蛋白联合作为免疫原，其诱导的特异性T细胞免疫均偏向于Th1(IFN-γ)，而非Th2(IL-4)，有利于预防带状疱疹疾病。

实验例3

本实验例旨在比较实施例1至实施例6、对比例1和对比例2的重组病毒、市售水痘减毒活疫苗以及市售带状疱疹疫苗的中和抗体滴度差异。

实验例3的分组情况与实施例1相同。

对各组的试验小鼠进行肌肉注射免疫，每只每次免疫0.1mL，每3周免疫一次，共免疫二次，第二剂免疫二十一天后眼眶取血，其中，每只试验小鼠接受的对应重组病毒的免疫量均过量，以确保每只试验小鼠均被有效感染。采用中和法检测小鼠血清对水痘-带状疱疹病毒的中和抗体效价，包括如下步骤：

Sa”、配制VZV稀释液，VZV稀释液中VZV的浓度为2×10

Sb”、将150μL的步骤Sa”中VZV稀释液、150μL的热灭活血清(将稀释后的待测小鼠血清经热灭活处理后而获得)以及5μL的豚鼠补体相混合，然后置于37℃孵育1h，获得病毒血清混合物；

Sc”、提供每孔内长满MRC-5单层细胞的24孔板，每孔内加入100μL的步骤Sb”获得的病毒血清混合物，每种病毒血清混合物做两个复孔，然后置于37℃孵育2h，孵育2h后每孔加入2mL的病毒维持液(含2％(质量百分数)胎牛血清的MEM液体培养基)，继续置于37℃孵育7天；

Sd”、孵育结束后，去除培养基，固定细胞，并用考马斯蓝溶液(按照质量百分比计算，0.5％的考马斯蓝、45％的甲醇以及10％的乙酸，余量为去离子水)染色10min，然后用蒸馏水洗涤平板，对斑点计数，取使空斑数减少50％的血清稀释度的倒数作为VZV中和抗体效价。

实验结果如表6所示：

表6实验组1至实验组9以及阴性对照组的小鼠血清中抗VZV中和抗体的几何平均滴度一览表

由表6的实验数据可知，实验组8的小鼠血清中抗VZV中和抗体的几何平均滴度为34，实验组1的小鼠血清中抗VZV中和抗体的几何平均滴度为57，实验组9的小鼠血清中抗VZV中和抗体的几何平均滴度为29，说明单独使用gE糖蛋白作为免疫原，以及将gE糖蛋白和IE63蛋白联合作为免疫原均可以诱导产生针对VZV的特异性中和抗体。

实验组1至实验组6以及实验组8的免疫效果均优于实验组7，说明：实验组7所对应的市售水痘减毒活疫苗仅适用于预防水痘，而实验组1至实验组6以及实验组8对应的重组病毒制成疫苗不但可以用于预防水痘，还可以用于预防带状疱疹，并且实验组1至实验组6的免疫效果优于实验组8的免疫效果，说明将gE糖蛋白和IE63蛋白联合作为免疫原具有明显的免疫优势。

综合实验例1至实验例3可知，相较于市售带状疱疹疫苗，本申请实施例的重组病毒具有显著的优势，第一方面，本申请实施例的重组病毒具有预防水痘和带状疱疹的双重功效，而市售带状疱疹疫苗仅能预防带状疱疹；第二方面，本申请实施例的重组病毒诱导细胞免疫的效果略优于市售带状疱疹疫苗，并且采用本申请实施例的重组病毒制成的疫苗无需添加佐剂，从而极大地降低了反应原性，具有安全性高、副作用小、适用人群广泛的优点。相较于市售水痘减毒活疫苗，本申请实施例的重组病毒具有显著的优势，第一方面，本申请实施例的重组病毒具有预防水痘和带状疱疹的双重功效，而市售的水痘减毒活疫苗仅能预防水痘；第二方面，市售水痘减毒活疫苗主要引起体液免疫反应，而本申请实施例的重组病毒能够引起中和抗体应答以及广泛的CD4+T细胞和CD8+T细胞免疫，从而免疫效果更佳；第三方面，本申请实施例的重组病毒诱导产生的特异性IgG抗体几何平均滴度能够达到市售水痘减毒活疫苗的3.1倍，且中和抗体滴度水平差异较小。

此外，相较于rAdC68XY3-IE63-gE-1重组腺病毒、rAdC68XY3-IE63-gE-2重组腺病毒、rAd5-gE-IE63重组腺病毒、rMVA-gE-IE63重组腺病毒以及rMVA-gE-IE63重组腺病毒，rAdC68XY3-gE-IE63重组腺病毒具有显著的免疫效果优势。

以上对本发明所提供的一种基于水痘-带状疱疹病毒的重组表达载体、重组病毒及用途，进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的技术方案及其核心思想；本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请实施例的技术方案的范围。

序列表

<110> 武汉博沃生物科技有限公司

<120> 基于水痘-带状疱疹病毒的重组表达载体、重组病毒及用途

<130> WHP210922CN

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1521

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agcgtgctca ggtacgacga cttccacatc gatgaggata agctggacac caacagcgtg 60

tacgagccct actaccacag cgaccacgcc gagagctcct gggtgaacag gggggagagc 120

agccggaagg cttacgacca caacagcccc tacatttggc caaggaacga ctacgacggc 180

ttcttggaga acgcccacga gcaccacggc gtctacaacc agggacgggg catcgatagc 240

ggggagaggc tgatgcagcc cacccagatg tccgctcagg aggacctggg cgatgatacc 300

ggaattcacg tcattcctac cctgaacggc gatgacaggc acaagatcgt gaacgtggat 360

cagcggcagt acggcgatgt gttcaagggg gatctcaacc ccaagcccca gggccagaga 420

ctgattgagg tgtccgtgga ggagaaccac cccttcacat tgagggcccc catccagcgg 480

atctacggcg tgaggtacac cgagacatgg tcctttctcc ctagcctgac atgcacaggg 540

gacgccgccc ccgccatcca gcacatttgc ctgaagcaca caacctgctt ccaggatgtg 600

gtggtggacg tcgattgcgc cgagaacact aaggaggacc agctggccga gatcagctac 660

aggttccagg ggaagaagga ggccgaccag ccctggatcg tcgtgaacac tagcacactg 720

ttcgatgagc tcgagctgga tccacctgag attgagccag gggtcttgaa ggtgctgaga 780

accgagaagc agtacctggg cgtgtacatt tggaacatga ggggctccga tgggactagc 840

acctacgcca cctttctggt cacatggaag ggggatgaga agacccggaa ccccactccc 900

gccgtgaccc cacagccacg gggcgccgag ttccacatgt ggaactacca cagccacgtg 960

tttagcgtcg gcgacacatt cagcctggcc atgcacttgc agtacaagat ccacgaggcc 1020

cccttcgatc tgctccttga gtggctgtac gtgcccattg acccaacctg ccagcctatg 1080

agactgtaca gcacatgcct gtaccaccct aacgcccccc agtgcctgag ccacatgaac 1140

tccggctgca cattcacatc cccccacctg gcccagaggg tggctagcac cgtgtaccag 1200

aactgcgagc acgctgataa ctacactgcc tactgcctgg ggattagcca catggagcct 1260

agcttcgggc tgatcctgca cgacgggggg acaaccctca agttcgtgga cacccctgag 1320

tccttgagcg ggttgtacgt gttcgtggtc tactttaacg ggcatgtgga ggccgtcgcc 1380

tacacagtcg tgagcaccgt ggatcacttc gtgaacgcca tcgaggagag agggttcccc 1440

cctaccgccg gccagccacc cgccaccaca aagcctaagg agatcacccc cgtgaacccc 1500

ggaacctccc ctctgatccg g 1521

<210> 2

<211> 837

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgttctgca ccagccccgc cactaggggg gactcctccg agagcaagcc aggggccagc 60

gtggacgtga acggcaagat ggagtacgga tccgctcctg ggccactgaa cggcagggac 120

actagccggg gcccaggcgc cttctgcact cctgggtggg agattcaccc cgcccggctg 180

gtggaggata ttaaccgggt gttcctgtgc atcgcccagt cctccgggag ggtcacaaga 240

gattcccggc ggctccggcg gatttgcctc gacttctacc tgatgggccg gactaggcag 300

agacctaccc tggcctgctg ggaggagctg ctccagctcc agccaacaca gacccagtgc 360

ctgagggcca cactgatgga ggtctcacac aggcccccca ggggggagga cgggttcatt 420

gaggccccca acgtcccact ccatagatcc gccctggagt gcgacgtgag cgatgacggg 480

ggggaggacg atagcgacga tgacgggtct acccccagcg atgtgatcga gttcagggat 540

tccgatgccg agtccagcga cggcgaggat ttcatcgtgg aggaggagtc cgaggagtcc 600

accgatagct gcgagcctga tggggtgcca ggcgactgct accgggacgg agacgggtgt 660

aacacaccct ccccaaagcg gccccagcgg gccattgagc ggtacgccgg cgccgagacc 720

gctgagtaca cagccgccaa ggccctgaca gctctggggg agggcggcgt cgattggaag 780

cggcggcggc acgaggcccc caggaggcac gatatccccc caccccacgg ggtgtag 837

<210> 3

<211> 2525

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcgccgccgc catgggcaag cggagcgccg gaagcatcat gtggctggcc agcctggccg 60

tcgtcattgc ctgcgccggg gccagcgtgc tcaggtacga cgacttccac atcgatgagg 120

ataagctgga caccaacagc gtgtacgagc cctactacca cagcgaccac gccgagagct 180

cctgggtgaa caggggggag agcagccgga aggcttacga ccacaacagc ccctacattt 240

ggccaaggaa cgactacgac ggcttcttgg agaacgccca cgagcaccac ggcgtctaca 300

accagggacg gggcatcgat agcggggaga ggctgatgca gcccacccag atgtccgctc 360

aggaggacct gggcgatgat accggaattc acgtcattcc taccctgaac ggcgatgaca 420

ggcacaagat cgtgaacgtg gatcagcggc agtacggcga tgtgttcaag ggggatctca 480

accccaagcc ccagggccag agactgattg aggtgtccgt ggaggagaac caccccttca 540

cattgagggc ccccatccag cggatctacg gcgtgaggta caccgagaca tggtcctttc 600

tccctagcct gacatgcaca ggggacgccg cccccgccat ccagcacatt tgcctgaagc 660

acacaacctg cttccaggat gtggtggtgg acgtcgattg cgccgagaac actaaggagg 720

accagctggc cgagatcagc tacaggttcc aggggaagaa ggaggccgac cagccctgga 780

tcgtcgtgaa cactagcaca ctgttcgatg agctcgagct ggatccacct gagattgagc 840

caggggtctt gaaggtgctg agaaccgaga agcagtacct gggcgtgtac atttggaaca 900

tgaggggctc cgatgggact agcacctacg ccacctttct ggtcacatgg aagggggatg 960

agaagacccg gaaccccact cccgccgtga ccccacagcc acggggcgcc gagttccaca 1020

tgtggaacta ccacagccac gtgtttagcg tcggcgacac attcagcctg gccatgcact 1080

tgcagtacaa gatccacgag gcccccttcg atctgctcct tgagtggctg tacgtgccca 1140

ttgacccaac ctgccagcct atgagactgt acagcacatg cctgtaccac cctaacgccc 1200

cccagtgcct gagccacatg aactccggct gcacattcac atccccccac ctggcccaga 1260

gggtggctag caccgtgtac cagaactgcg agcacgctga taactacact gcctactgcc 1320

tggggattag ccacatggag cctagcttcg ggctgatcct gcacgacggg gggacaaccc 1380

tcaagttcgt ggacacccct gagtccttga gcgggttgta cgtgttcgtg gtctacttta 1440

acgggcatgt ggaggccgtc gcctacacag tcgtgagcac cgtggatcac ttcgtgaacg 1500

ccatcgagga gagagggttc ccccctaccg ccggccagcc acccgccacc acaaagccta 1560

aggagatcac ccccgtgaac cccggaacct cccctctgat ccggagggcc aggagggggt 1620

ccggcgccac caactttagc ctcctgaagc aggccgggga tgtcgaggag aaccccggcc 1680

ccatgttctg caccagcccc gccactaggg gggactcctc cgagagcaag ccaggggcca 1740

gcgtggacgt gaacggcaag atggagtacg gatccgctcc tgggccactg aacggcaggg 1800

acactagccg gggcccaggc gccttctgca ctcctgggtg ggagattcac cccgcccggc 1860

tggtggagga tattaaccgg gtgttcctgt gcatcgccca gtcctccggg agggtcacaa 1920

gagattcccg gcggctccgg cggatttgcc tcgacttcta cctgatgggc cggactaggc 1980

agagacctac cctggcctgc tgggaggagc tgctccagct ccagccaaca cagacccagt 2040

gcctgagggc cacactgatg gaggtctcac acaggccccc caggggggag gacgggttca 2100

ttgaggcccc caacgtccca ctccatagat ccgccctgga gtgcgacgtg agcgatgacg 2160

ggggggagga cgatagcgac gatgacgggt ctacccccag cgatgtgatc gagttcaggg 2220

attccgatgc cgagtccagc gacggcgagg atttcatcgt ggaggaggag tccgaggagt 2280

ccaccgatag ctgcgagcct gatggggtgc caggcgactg ctaccgggac ggagacgggt 2340

gtaacacacc ctccccaaag cggccccagc gggccattga gcggtacgcc ggcgccgaga 2400

ccgctgagta cacagccgcc aaggccctga cagctctggg ggagggcggc gtcgattgga 2460

agcggcggcg gcacgaggcc cccaggaggc acgatatccc cccaccccac ggggtgtagt 2520

aatga 2525

<210> 4

<211> 507

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ser Val Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp

1 5 10 15

Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser

20 25 30

Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn

35 40 45

Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn

50 55 60

Ala His Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser

65 70 75 80

Gly Glu Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu

85 90 95

Gly Asp Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp

100 105 110

Arg His Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe

115 120 125

Lys Gly Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val

130 135 140

Ser Val Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg

145 150 155 160

Ile Tyr Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu

165 170 175

Thr Cys Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys

180 185 190

His Thr Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu

195 200 205

Asn Thr Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly

210 215 220

Lys Lys Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu

225 230 235 240

Phe Asp Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu

245 250 255

Lys Val Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn

260 265 270

Met Arg Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr

275 280 285

Trp Lys Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro

290 295 300

Gln Pro Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val

305 310 315 320

Phe Ser Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys

325 330 335

Ile His Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro

340 345 350

Ile Asp Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr

355 360 365

His Pro Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr

370 375 380

Phe Thr Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln

385 390 395 400

Asn Cys Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser

405 410 415

His Met Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr

420 425 430

Leu Lys Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe

435 440 445

Val Val Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val

450 455 460

Ser Thr Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro

465 470 475 480

Pro Thr Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr

485 490 495

Pro Val Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Ile Arg

500 505

<210> 5

<211> 278

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Phe Cys Thr Ser Pro Ala Thr Arg Gly Asp Ser Ser Glu Ser Lys

1 5 10 15

Pro Gly Ala Ser Val Asp Val Asn Gly Lys Met Glu Tyr Gly Ser Ala

20 25 30

Pro Gly Pro Leu Asn Gly Arg Asp Thr Ser Arg Gly Pro Gly Ala Phe

35 40 45

Cys Thr Pro Gly Trp Glu Ile His Pro Ala Arg Leu Val Glu Asp Ile

50 55 60

Asn Arg Val Phe Leu Cys Ile Ala Gln Ser Ser Gly Arg Val Thr Arg

65 70 75 80

Asp Ser Arg Arg Leu Arg Arg Ile Cys Leu Asp Phe Tyr Leu Met Gly

85 90 95

Arg Thr Arg Gln Arg Pro Thr Leu Ala Cys Trp Glu Glu Leu Leu Gln

100 105 110

Leu Gln Pro Thr Gln Thr Gln Cys Leu Arg Ala Thr Leu Met Glu Val

115 120 125

Ser His Arg Pro Pro Arg Gly Glu Asp Gly Phe Ile Glu Ala Pro Asn

130 135 140

Val Pro Leu His Arg Ser Ala Leu Glu Cys Asp Val Ser Asp Asp Gly

145 150 155 160

Gly Glu Asp Asp Ser Asp Asp Asp Gly Ser Thr Pro Ser Asp Val Ile

165 170 175

Glu Phe Arg Asp Ser Asp Ala Glu Ser Ser Asp Gly Glu Asp Phe Ile

180 185 190

Val Glu Glu Glu Ser Glu Glu Ser Thr Asp Ser Cys Glu Pro Asp Gly

195 200 205

Val Pro Gly Asp Cys Tyr Arg Asp Gly Asp Gly Cys Asn Thr Pro Ser

210 215 220

Pro Lys Arg Pro Gln Arg Ala Ile Glu Arg Tyr Ala Gly Ala Glu Thr

225 230 235 240

Ala Glu Tyr Thr Ala Ala Lys Ala Leu Thr Ala Leu Gly Glu Gly Gly

245 250 255

Val Asp Trp Lys Arg Arg Arg His Glu Ala Pro Arg Arg His Asp Ile

260 265 270

Pro Pro Pro His Gly Val

275

<210> 6

<211> 835

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala

1 5 10 15

Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Ser Val Leu Arg Tyr Asp Asp Phe

20 25 30

His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr

35 40 45

Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser

50 55 60

Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg Asn

65 70 75 80

Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His Glu His His Gly Val Tyr

85 90 95

Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu Arg Leu Met Gln Pro Thr

100 105 110

Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp Asp Thr Gly Ile His Val

115 120 125

Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His Lys Ile Val Asn Val Asp

130 135 140

Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly Asp Leu Asn Pro Lys Pro

145 150 155 160

Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val Glu Glu Asn His Pro Phe

165 170 175

Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg Ile Tyr Gly Val Arg Tyr Thr Glu

180 185 190

Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu Thr Cys Thr Gly Asp Ala Ala Pro

195 200 205

Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys His Thr Thr Cys Phe Gln Asp Val

210 215 220

Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu Asn Thr Lys Glu Asp Gln Leu Ala

225 230 235 240

Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Lys Glu Ala Asp Gln Pro Trp

245 250 255

Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu Phe Asp Glu Leu Glu Leu Asp Pro

260 265 270

Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu Lys Val Leu Arg Thr Glu Lys Gln

275 280 285

Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn Met Arg Gly Ser Asp Gly Thr Ser

290 295 300

Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr Trp Lys Gly Asp Glu Lys Thr Arg

305 310 315 320

Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro Gln Pro Arg Gly Ala Glu Phe His

325 330 335

Met Trp Asn Tyr His Ser His Val Phe Ser Val Gly Asp Thr Phe Ser

340 345 350

Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys Ile His Glu Ala Pro Phe Asp Leu

355 360 365

Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro Ile Asp Pro Thr Cys Gln Pro Met

370 375 380

Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr His Pro Asn Ala Pro Gln Cys Leu

385 390 395 400

Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr Phe Thr Ser Pro His Leu Ala Gln

405 410 415

Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln Asn Cys Glu His Ala Asp Asn Tyr

420 425 430

Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser His Met Glu Pro Ser Phe Gly Leu

435 440 445

Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr Leu Lys Phe Val Asp Thr Pro Glu

450 455 460

Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Val Tyr Phe Asn Gly His Val

465 470 475 480

Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val Ser Thr Val Asp His Phe Val Asn

485 490 495

Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro Pro Thr Ala Gly Gln Pro Pro Ala

500 505 510

Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr Pro Val Asn Pro Gly Thr Ser Pro

515 520 525

Leu Ile Arg Arg Ala Arg Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu

530 535 540

Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Phe Cys

545 550 555 560

Thr Ser Pro Ala Thr Arg Gly Asp Ser Ser Glu Ser Lys Pro Gly Ala

565 570 575

Ser Val Asp Val Asn Gly Lys Met Glu Tyr Gly Ser Ala Pro Gly Pro

580 585 590

Leu Asn Gly Arg Asp Thr Ser Arg Gly Pro Gly Ala Phe Cys Thr Pro

595 600 605

Gly Trp Glu Ile His Pro Ala Arg Leu Val Glu Asp Ile Asn Arg Val

610 615 620

Phe Leu Cys Ile Ala Gln Ser Ser Gly Arg Val Thr Arg Asp Ser Arg

625 630 635 640

Arg Leu Arg Arg Ile Cys Leu Asp Phe Tyr Leu Met Gly Arg Thr Arg

645 650 655

Gln Arg Pro Thr Leu Ala Cys Trp Glu Glu Leu Leu Gln Leu Gln Pro

660 665 670

Thr Gln Thr Gln Cys Leu Arg Ala Thr Leu Met Glu Val Ser His Arg

675 680 685

Pro Pro Arg Gly Glu Asp Gly Phe Ile Glu Ala Pro Asn Val Pro Leu

690 695 700

His Arg Ser Ala Leu Glu Cys Asp Val Ser Asp Asp Gly Gly Glu Asp

705 710 715 720

Asp Ser Asp Asp Asp Gly Ser Thr Pro Ser Asp Val Ile Glu Phe Arg

725 730 735

Asp Ser Asp Ala Glu Ser Ser Asp Gly Glu Asp Phe Ile Val Glu Glu

740 745 750

Glu Ser Glu Glu Ser Thr Asp Ser Cys Glu Pro Asp Gly Val Pro Gly

755 760 765

Asp Cys Tyr Arg Asp Gly Asp Gly Cys Asn Thr Pro Ser Pro Lys Arg

770 775 780

Pro Gln Arg Ala Ile Glu Arg Tyr Ala Gly Ala Glu Thr Ala Glu Tyr

785 790 795 800

Thr Ala Ala Lys Ala Leu Thr Ala Leu Gly Glu Gly Gly Val Asp Trp

805 810 815

Lys Arg Arg Arg His Glu Ala Pro Arg Arg His Asp Ile Pro Pro Pro

820 825 830

His Gly Val

835

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcgcggccgc gccgccgcca tgggcaagcg gagcgcc 37

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcggtacctc attactacac cccgtggggt gg 32

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gccgcgccgc cgccatgggc aagcggagcg ccggaagcat catgtggctg gccagcctgg 60

ccgtcgtcat tgcctgcgcc ggggccagcg tgctcaggta cgacgacttc cacatcgatg 120

aggataagct ggacaccaac agcgtgtacg agccctacta ccacagcgac cacgccgaga 180

gctcctgggt gaacaggggg gagagcagcc ggaaggctta cgaccacaac agcccctaca 240

tttggccaag gaacgactac gacggcttct tggagaacgc ccacgagcac cacggcgtct 300

acaaccaggg acggggcatc gatagcgggg agaggctgat gcagcccacc cagatgtccg 360

ctcaggagga cctgggcgat gataccggaa ttcacgtcat tcctaccctg aacggcgatg 420

acaggcacaa gatcgtgaac gtggatcagc ggcagtacgg cgatgtgttc aagggggatc 480

tcaaccccaa gccccagggc cagagactga ttgaggtgtc cgtggaggag aaccacccct 540

tcacattgag ggcccccatc cagcggatct acggcgtgag gtacaccgag acatggtcct 600

ttctccctag cctgacatgc acaggggacg ccgcccccgc catccagcac atttgcctga 660

agcacacaac ctgcttccag gatgtggtgg tggacgtcga ttgcgccgag aacactaagg 720

aggaccagct ggccgagatc agctacaggt tccaggggaa gaaggaggcc gaccagccct 780

ggatcgtcgt gaacactagc acactgttcg atgagctcga gctggatcca cctgagattg 840

agccaggggt cttgaaggtg ctgagaaccg agaagcagta cctgggcgtg tacatttgga 900

acatgagggg ctccgatggg actagcacct acgccacctt tctggtcaca tggaaggggg 960

atgagaagac ccggaacccc actcccgccg tgaccccaca gccacggggc gccgagttcc 1020

acatgtggaa ctaccacagc cacgtgttta gcgtcggcga cacattcagc ctggccatgc 1080

acttgcagta caagatccac gaggccccct tcgatctgct ccttgagtgg ctgtacgtgc 1140

ccattgaccc aacctgccag cctatgagac tgtacagcac atgcctgtac caccctaacg 1200

ccccccagtg cctgagccac atgaactccg gctgcacatt cacatccccc cacctggccc 1260

agagggtggc tagcaccgtg taccagaact gcgagcacgc tgataactac actgcctact 1320

gcctggggat tagccacatg gagcctagct tcgggctgat cctgcacgac ggggggacaa 1380

ccctcaagtt cgtggacacc cctgagtcct tgagcgggtt gtacgtgttc gtggtctact 1440

ttaacgggca tgtggaggcc gtcgcctaca cagtcgtgag caccgtggat cacttcgtga 1500

acgccatcga ggagagaggg ttccccccta ccgccggcca gccacccgcc accacaaagc 1560

ctaaggagat cacccccgtg aaccccggaa cctcccctct gatccggtag taatga 1616

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12