一种救心丸指纹图谱的建立方法及应用

摘要

本发明公开了一种救心丸指纹图谱的建立方法及应用。本发明采用HPLC‑DAD‑ELSD联用，首次建立了救心丸标准指纹图谱，解决了救心丸评价指标单一的问题，能够高效、全面的对救心丸中多种中药成分进行质量控制。该方法重现性好，简便易操作，通过对比待检样品所得指纹图谱与标准指纹图谱的相似程度，可以反映救心丸的质量，有利于各企业更好地控制投料及跟踪产品质量，也有利于质检部门监控救心丸的质量。

说明书

技术领域

本发明属于中药质量检测领域，具体涉及一种救心丸指纹图谱的建立方法及应用。

背景技术

救心丸（批准文号：国药准字Z34021069）属于国家二级中药保护品种，是一种具有化痰活血，祛瘀止痛功效的中药复方，它由人参茎叶总皂苷、牛胆膏粉、人工麝香、冰片、蟾酥、珍珠、牛黄和三七膏粉8味中药材粉碎成细粉，加淀粉适量，过筛，混匀，以水泛丸，制粒，低温干燥，制备而成。在现代临床上广泛用于治疗痰浊瘀血闭阻心脉而致的胸痹心痛，胸闷、短气、心悸、怔肿等症，为当今临床治疗心绞痛、冠心病的重要中成药。

现行救心丸的质量控制标准主要体现在单味药的成分研究，以上评价指标单一，救心丸中多种中药成分缺乏有效的控制指标，尚不能对救心丸质量做出全面充分的评价。

目前以指纹图谱控制救心丸的质量，国内外尚未见专利公开文献报道，因此急需一种简单快捷，全面准确的方法来对救心丸的质量控制具有十分重要的意义。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种救心丸指纹图谱的建立方法，该方法重现性好，简便易操作，能够高效、全面的对救心丸中多种中药成分进行质量控制。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种救心丸指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：

（a）供试品溶液的制备：

取救心丸适量，研细，精密称取研细粉末，加入甲醇溶液，称定，常温下超声提取，冷却至室温，甲醇补充损失质量，摇匀后过滤膜，即得；

（b）对照品溶液的制备：

精密称取适量人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、日蟾毒它灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、牛磺胆酸钠、胆酸、猪去氧胆酸对照品，加入甲醇超声溶解，稀释至浓度为0.1 mg/mL，即得；

（c）色谱条件的确定：

使用C18 色谱柱，以流动相A相为水，B相为乙腈，双波长检测，检测波长分别为296nm与203 nm；梯度洗脱程序为：0～5 min，35%～53% B; 5～13 min，53%～100% B; 13～15min，100%～35% B; 15～18min，35% B；ELSD参数：漂移管温度为60℃，气体压力为35 psi，增益100；

（d）标准指纹图谱的建立：

将多批救心丸的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，采用HPLC-DAD-ELSD联用进行测定，记录色谱图；将色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，以S1为参照图谱，多点校正法匹配色谱峰，时间宽度设定为0.1 min，平均数法建立救心丸标准指纹图谱，通过对照品指认标定13个共有峰。

优选的，步骤(a)中，超声的功率为200-400 W，30-70 kHz，超声时间为15-45min。

优选的，步骤(c)中，柱温为30-40℃，流速为0.5-1 mL/min。

优选的，步骤(d)中，所述13个共有峰分别为1号日蟾毒他灵，2号沙蟾毒精，3号远华蟾毒精，4号蟾毒它灵，5号华蟾毒它灵，6号蟾毒灵，7号华蟾酥毒基，8号酯蟾毒配基，9号人参皂苷Rb1，10号人参皂苷Rd，11号牛磺胆酸钠，12号胆酸，13号猪去氧胆酸。

本发明还提供了所述的一种救心丸指纹图谱的建立方法在救心丸质量检测中的应用。将测试样品的色谱图与标准指纹图谱的相似度进行计算，根据相似度计算结果对测试样品的质量进行评价。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

本发明采用HPLC-DAD-ELSD联用，首次建立了救心丸标准指纹图谱，解决了救心丸评价指标单一的问题，能够高效、全面的对救心丸中多种中药成分进行质量控制。该方法重现性好，简便易操作，通过对比待检样品所得指纹图谱与标准指纹图谱的相似程度，可以反映救心丸的质量，有利于各企业更好地控制投料及跟踪产品质量，也有利于质检部门监控救心丸的质量。

附图说明

图1-3 为13批救心丸样品在不同检测波长及检测器下的指纹图谱图；

图4为救心丸HPLC-DAD-ELSD色谱图；其中A为 296 nm处救心丸样品色谱图； B为296 nm处蟾酥类混合对照品色谱图；C为203nm处救心丸样品色谱图； D为203 nm处皂苷类对照品色谱图； E为ELSD救心丸样品色谱图；F为ELSD胆酸类对照品色谱图；

图5-7为不同梯度洗脱条件下的色谱图；

图8-10为不同漂移管温度下的色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。

实施例1：

1仪器与试药

1.1 仪器

Waters高效液相色谱、ELS Detecter ( 美国 Waters 公司); 高速离心机 ( BT-25S型，常州市万丰仪器制造有限公司);电子分析天平 (AB135-S型，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司); 超声波清洗器 ( 深圳市语路清洗设备有限公司)。

1.2试药

某公司救心丸样品(S1:20190902-2、S2:20180501、S3:20191103-2、S4:20191102、S5:20191002-1、S6:20180503、S7:20170402、S8:20191103-1、S9:20190601-1、S10:20191202-2、S11:20190901、S12:20190701-1、S13:20191202-1)；人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、日蟾毒它灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、牛磺胆酸钠、胆酸、猪去氧胆酸对照品(纯度≥ 98%，成都克洛玛生物科技有限公司)；甲醇、乙腈 ( 美国 Fisher公司)；超纯水。

2方法与结果

2.1色谱条件：使用Caprisil C18 色谱柱 ( 4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温35 ℃。以流动相A相为水，B相为乙腈，梯度洗脱程序： 0～5 min，35%～53% B; 5～13 min，53%～100% B; 13～15 min，100%～35% B; 15～18min，35% B，流速：0.6 mL/min。紫外检测波长分别为296 nm与203 nm。ELSD参数：漂移管温度60 ℃，气体压力35 psi，增益100。样品进样量为10 μL。

2.2供试品溶液的制备：取救心丸适量，研细，精密称取0.3g粉末，加入到25mL锥形瓶中，加入20 mL的甲醇溶液，称定。常温下超声 ( 360 W，40 kHz)提取20min，取出后冷却至室温，甲醇补充损失质量，摇匀后过0.22 μm滤膜，即得供试品溶液。

2.3对照品溶液的制备：精密称定人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、日蟾毒它灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、牛磺胆酸钠、胆酸、猪去氧胆酸对照品，加入甲醇后超声溶解，得到浓度为1 mg/mL的对照品储备液。取1 mL浓度为1 mg/mL的储备液甲醇稀释至浓度为0.1 mg/mL，即得对照品溶液。

2.4 HPLC标准指纹图谱的建立：采用“2.2”项下方法制备 13 批救心丸的供试品溶液(S1~S13)，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。将色谱数据以AIA格式导入“中药

色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版)”，得到13批样品的HPLC-DAD-ELSD指纹

图谱，以S1为参照图谱，多点校正法匹配色谱峰，时间宽度设定为0.1 min，平均数法建立

对照指纹图谱(R)，通过对照品指认标定了其中13个共有峰（参见附图1-3）。

3 方法学验证

3.1 仪器精密度试验

取救心丸样品 (S1，批号：20190902-2)，按实施例1项中“2.2”项下方法制备供试品溶液，按色谱条件连续进样6次，记录色谱图。以蟾毒灵为参比峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。结果共有峰的相对保留时间的RSD值均< 0.51%，相对峰面积的RSD值均< 1.76%，表明该方法的仪器精密度良好，符合指纹图谱要求。

3.2 稳定性试验

取救心丸样品 (S1，批号：20190902-2)，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于配制后0，3，6，9，12，24 h，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以蟾毒灵为参比峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。结果各共有峰相对保留时间的RSD值均< 1.82%，相对峰面积的RSD值均< 2.04%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3.3 重复性实验

取同一批号救心丸样品 (S1，批号：20190902-2)6 份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以蟾毒灵峰为参比峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。结果各共有色谱峰相对保留时间的RSD值均< 0.35%，相对峰面积的RSD值均< 2.63%，表明该方法重复性良好，符合指纹图谱的要求。

4 共有峰的确定

4.1样品测定

采用“2.2”项下方法制备 13 批救心丸的供试品溶液(S1~S13)，按 “2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。将色谱数据以AIA格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版)”，得到13批样品的HPLC-DAD-ELSD指纹图谱，以S1为参照图谱，多点校正法匹配色谱峰，时间宽度设定为0.1 min，平均数法建立对照指纹图谱(R)，通过对照品指认标定了其中13个共有峰，分别为1号日蟾毒他灵，2号沙蟾毒精，3号远华蟾毒精，4号蟾毒它灵，5号华蟾毒它灵，6号蟾毒灵，7号华蟾酥毒基，8号酯蟾毒配基，9号人参皂苷Rb1，10号人参皂苷Rd，11号牛磺胆酸钠，12号胆酸，13号猪去氧胆酸（见附图4）。相似性评价结果如表1、2、3所示。在相似性评价中，当相关系数接近1.0时，说明样本具有完全相似度。相关系数低，说明样品之间的关系数学质量较差。因此，相似性的异质性说明

了对样品的质量及一致性的影响。救心丸相似性范围在0.516-0.995，除了S7:20170402；

S8:20191103-1； S10:20191202-2；其它批次样品相似度都较高，样品间一致性较好。

表1 13批华佗救心丸相似度评价结果（296nm）

表2 13批华佗救心丸相似度评价结果（203nm）

表3 13批华佗救心丸相似度评价结果（ELSD）

5 色谱条件优化

要实现高效、全面的对救心丸中多种成分的有效控制，洗脱程序的选择是关键技术。

本发明对洗脱条件的选择采用如下方法进行比较：

方法一： 流动相采用水(A相)-乙腈(B相)，并用2 min, 80-65 % A; 7 min, 47 %A; 14 min, 10% A; 16 min 65% A; 18 min 80 % A; 20 min 80% A的梯度洗脱程序进行试验，其中HPLC色谱图如图5所示，在不同波长下，整个梯度洗脱过程中，出现的色谱峰少，救心丸中的化学物质没有响应。

方法二： 为了改善上述色谱峰少的问题，通过改变流动相梯度洗脱程序，并用0min, 80 % A; 2 min, 65 % A; 7 min, 47 %A; 14 min, 20 % A; 15 min，80 % A; 18min 80% A的洗脱程序试验，其HPLC色谱图如图6所示，可检测的色谱峰明显增多，但是华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵峰分离度不达标，同时在203 nm条件下，人参皂苷Rb1，人参皂苷Rb2响应低。

方法三：为了改善上述现象，通过改变流动相梯度，0～5 min，35%～53% B; 5～13min，53%～100% B; 13～15 min，100%～35% B; 15～18min，35% B的洗脱程序试验，其HPLC色谱图7所示，由此可见，在此条件下，出峰多，且色谱峰分离良好。因此，本发明选用方法三的洗脱程序。

6 漂移管温度的选择

鉴于本发明是基于DAD-ELSD检测联用，在漂移管温度选择时发现，在40℃时，296nm 与203nm下的8.8min 与7.8min条件下的色谱峰不能很好的分离（如图8）；当漂移管温度达到50℃时，发现上述存在的问题依然存在（如图9），当漂移管温度达到60℃时，不同波长下的色谱分分离良好，并且有利于ELSD的色谱峰的出锋（如图10），因此，本发明选择漂移管温度为60℃。