毛细血管疾病抑制剂、毛细血管疾病改善剂、以及毛细血管新生促进剂

摘要

本发明的一个以上的实施方式提供以微生物作为有效成分的毛细血管疾病抑制剂、毛细血管疾病改善剂、毛细血管新生促进剂或糖尿病并发症的预防或抑制剂。本发明的一个以上的实施方式涉及含有屎肠球菌R30株(保藏编号NITE BP‑01362)的毛细血管疾病抑制剂、毛细血管疾病改善剂或毛细血管新生促进剂。本发明的另外的一个以上的实施方式涉及含有屎肠球菌R30株糖尿病并发症的预防或抑制剂。

说明书

技术领域

本发明的一个以上的实施方式涉及毛细血管疾病抑制剂、毛细血管疾病改善剂、毛细血管新生促进剂中的任意药剂。本发明的一个以上的实施方式还涉及糖尿病并发症的预防或抑制剂。

背景技术

在糖尿病患者中，已知会因伴随血糖值上升的晚期糖基化终末产物的产生、过量的活性氧的增加而导致组织的微小血管网络发生退化，发生糖尿病并发症(毛细血管疾病)。目前认为，为了抑制、改善糖尿病性的毛细血管疾病，血糖值的降低是必须的。

例如，在专利文献1中公开了含有粪肠球菌(Enterococcus faecalis)等微生物作为有效成分的血糖值降低剂及糖尿病治疗预防剂。在专利文献2中公开了含有粪肠球菌等乳酸菌菌体作为有效成分的降血压剂及降血糖剂。

另一方面，在专利文献3中，本申请人报告了屎肠球菌(Enterococcus faecium)R30株作为具有改善疲劳、改善血流作用的乳酸菌。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2005/077390号小册子

专利文献2：日本特开平10-7577号公报

专利文献3：国际公开第2014/021205号小册子

发明内容

发明要解决的课题

如果能够抑制毛细血管疾病，则可以期待能够预防或抑制糖尿病并发症。但是，在专利文献1及专利文献2中仅记载了血糖值降低或下降，对于能够直接抑制或改善毛细血管疾病的效果没有记载。另外，在专利文献3中仅记载了作为低温条件下减少的血流在回到常温条件时恢复的作用的血流改善效果，对于抑制、改善毛细血管疾病的效果并没有记载。

因此，本发明的一个以上的实施方式的课题在于提供以微生物作为有效成分的毛细血管疾病抑制剂、毛细血管疾病改善剂、毛细血管新生促进剂及糖尿病并发症的预防或抑制剂。

解决课题的方法

本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果完了了以下的发明。

(1)一种毛细血管疾病抑制剂，其含有屎肠球菌R30株(保藏编号NITE BP-01362)。

(2)根据(1)中记载的毛细血管疾病抑制剂，其用于抑制糖尿病性的毛细血管疾病。

(3)根据(1)或(2)中记载的毛细血管疾病抑制剂，其含有上述株的死菌。

(4)根据(1)～(3)中任一项所述的毛细血管疾病抑制剂，其中，屎肠球菌R30株(保藏编号NITE BP-01362)的给药量为0.001mg/kg体重以上、且1000mg/kg体重以下。

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的毛细血管疾病抑制剂，其中，屎肠球菌R30株(保藏编号NITE BP-01362)的含量为0.001重量％以上、且100重量％以下。

(6)一种毛细血管疾病改善剂，其含有屎肠球菌R30株(保藏编号NITE BP-01362)。

(7)根据(6)中记载的毛细血管疾病改善剂，其用于改善糖尿病性的毛细血管疾病。

(8)根据(6)或(7)中记载的毛细血管疾病改善剂，其含有上述株的死菌。

(9)根据(6)～(8)中任一项所述的毛细血管疾病改善剂，其中，屎肠球菌R30株(保藏编号NITE BP-01362)的给药量为0.001mg/kg体重以上、且1000mg/kg体重以下。

(10)根据(6)～(9)中任一项所述的毛细血管疾病改善剂，其中，屎肠球菌R30株(保藏编号NITE BP-01362)的含量为0.001重量％以上、且100重量％以下。

(11)一种毛细血管新生促进剂，其含有屎肠球菌R30株(保藏编号NITE BP-01362)。

(12)根据(11)中记载的毛细血管新生促进剂，其用于改善或抑制糖尿病性的毛细血管疾病。

(13)根据(11)或(12)中记载的毛细血管新生促进剂，其含有上述株的死菌。

(14)根据(11)～(13)中任一项所述的毛细血管新生促进剂，其中，屎肠球菌R30株(保藏编号NITE BP-01362)的给药量为0.001mg/kg体重以上、且1000mg/kg体重以下。

(15)根据(11)～(14)中任一项所述的毛细血管新生促进剂，其中，屎肠球菌R30株(保藏编号NITE BP-01362)的含量为0.001重量％以上、且100重量％以下。

(16)一种糖尿病并发症的预防或抑制剂，其含有屎肠球菌R30株(保藏编号NITEBP-01362)。

(17)根据(16)所述的糖尿病并发症的预防或抑制剂，其含有上述株的死菌。

(18)屎肠球菌R30株在毛细血管疾病抑制剂的制造中的用途。

(19)屎肠球菌R30株在毛细血管疾病改善剂的制造中的用途。

(20)屎肠球菌R30株在毛细血管新生促进剂的制造中的用途。

(21)屎肠球菌R30株在糖尿病并发症的预防或抑制剂的制造中的用途。

(22)一种毛细血管疾病的抑制方法，该方法包括：对患者给药有效量的屎肠球菌R30株。

(23)根据(22)所述的抑制方法，其中，上述患者是需要抑制糖尿病性的毛细血管疾病的患者。

(24)一种毛细血管疾病的改善方法，该方法包括：对患者给药有效量的屎肠球菌R30株。

(25)根据(24)所述的改善方法，其中，上述患者是需要改善糖尿病性的毛细血管疾病的患者。

(26)一种毛细血管新生的促进方法，该方法包括：对患者给药有效量的屎肠球菌R30株。

(27)根据(26)所述的促进方法，其中，上述患者是需要促进毛细血管新生的患者。

(28)一种糖尿病并发症的预防或抑制方法，该方法包括：对需要预防或抑制糖尿病并发症的患者给药有效量的屎肠球菌R30株。

(29)屎肠球菌R30株的用于抑制毛细血管疾病的用途。

(30)根据(29)所述的用途，其包括对需要抑制毛细血管疾病的患者给药有效量的屎肠球菌R30株。

(31)屎肠球菌R30株的用于改善毛细血管疾病的用途。

(32)根据(31)所述的用途，其包括对需要改善毛细血管疾病的患者给药有效量的屎肠球菌R30株。

(33)屎肠球菌R30株的用于促进毛细血管新生的用途。

(34)根据(33)所述的用途，其包括对需要促进毛细血管新生的患者给药有效量的屎肠球菌R30株。

(35)屎肠球菌R30株的用于预防或抑制糖尿病并发症的用途。

(36)根据(35)所述的用途，其包括对需要预防或抑制糖尿病并发症的患者给药有效量的屎肠球菌R30株。

(37)根据(29)～(36)中任一项所述的用途，其为非医疗用途。

(38)根据(29)～(36)中任一项所述的用途，其为医疗用途。

(39)一种屎肠球菌R30株，其用于抑制毛细血管疾病的方法。

(40)根据(39)所述的屎肠球菌R30株，其中，上述方法包括：对需要抑制毛细血管疾病的患者给药有效量的屎肠球菌R30株。

(41)一种屎肠球菌R30株，其用于改善毛细血管疾病的方法。

(42)根据(41)所述的屎肠球菌R30株，其中，上述方法包括：对需要改善毛细血管疾病的患者给药有效量的屎肠球菌R30株。

(43)一种屎肠球菌R30株，其用于促进毛细血管新生的方法。

(44)根据(43)所述的屎肠球菌R30株，其中，上述方法包括：对需要促进毛细血管新生的患者给药有效量的屎肠球菌R30株。

(45)一种屎肠球菌R30株，其用于预防或抑制糖尿病并发症的方法。

(46)根据(45)所述的屎肠球菌R30株，其中，上述方法包括：对需要预防或抑制糖尿病并发症的患者给药有效量的屎肠球菌R30株。

本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本专利申请号2019-239057号及日本国专利申请号2020-091420号的公开内容。

发明的效果

本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病抑制剂具有优异的毛细血管疾病抑制效果。本发明的毛细血管疾病改善剂或毛细血管新生促进剂具有优异的毛细血管疾病的改善或血管新生促进效果。本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病抑制剂或改善剂、或者毛细血管新生促进剂例如对糖尿病性的肌肉组织毛细血管疾病的抑制或改善是有效的。

本发明的一个以上的实施方式的糖尿病并发症的预防或抑制剂通过抑制或改善成为糖尿病并发症的原因的毛细血管疾病、或者促进毛细血管新生的作用，可以预防或抑制糖尿病并发症。本发明的一个以上的实施方式的糖尿病并发症的预防或抑制剂可以通过与具有降血糖值作用的糖尿病的治疗药异质性的作用而预防或抑制糖尿病并发症。

附图说明

图1示出了实施例2中的Wistar大鼠/生理盐水给药组(CON/Saline：n＝6)、Wistar大鼠/屎肠球菌R30给药组(CON/R30：n＝7)、GK大鼠/生理盐水给药组(GK/Saline：n＝6)、以及GK大鼠/屎肠球菌R30给药组(GK/R30：n＝6)在刚刚糖负荷(0分钟)、从糖负荷起15分钟后、30分钟后、60分钟后及120分钟后的血糖值的测定结果。

图2示出了实施例3中的Wistar大鼠/生理盐水给药组(CON/Saline)、Wistar大鼠/屎肠球菌R30给药组(CON/R30)、GK大鼠/生理盐水给药组(GK/Saline)、以及GK大鼠/屎肠球菌R30给药组(GK/R30)在饲养8周后的比目鱼肌的毛细血管直径的测定结果。*p＜0.05vs.CON/Saline、#p＜0.05 vs.GK/Saline

图3是制成实施例4中的GK大鼠/生理盐水给药组(GK/Saline)、以及GK大鼠/屎肠球菌R30给药组(GK/R30)在饲养8周后的比目鱼肌的纵向切片、并用共聚焦激光显微镜及荧光成像软件构建的毛细血管的三维图像。

图4示出了实施例5中的Wistar大鼠/生理盐水给药组(CON/Saline)、Wistar大鼠/屎肠球菌R30给药组(CON/R30)、GK大鼠/生理盐水给药组(GK/Saline)、以及GK大鼠/屎肠球菌R30给药组(GK/R30)在饲养8周后比目鱼肌中的血管新生抑制因子TSP-1的生物合成量的测定结果。*p＜0.05 vs.CON/Saline

图5示出了实施例5中的Wistar大鼠/生理盐水给药组(CON/Saline)、Wistar大鼠/屎肠球菌R30给药组(CON/R30)、GK大鼠/生理盐水给药组(GK/Saline)、以及GK大鼠/屎肠球菌R30给药组(GK/R30)在饲养8周后比目鱼肌中的与毛细血管新生相关的VEGF的生物合成量的测定结果。*p＜0.05 vs.CON/Saline、#p＜0.05 vs.GK/Saline

具体实施方式

＜屎肠球菌R30株＞

本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病抑制剂、改善剂及毛细血管新生促进剂、以及糖尿病并发症的预防或抑制剂的特征在于，含有屎肠球菌R30株(Enterococcusfaecium R30)作为有效成分。以下，有时将屎肠球菌R30株简记为“R30株”。

屎肠球菌R30株如下所述保藏于保藏单位。

(i)保藏机构的名称及地址

名称：独立行政法人制品评价技术基础机构专利生物保藏中心

地址：日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8 120号室(日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)

(ii)国内保藏日：2012年5月16日

(iii)向国际保藏移交请求的接受日：2013年4月24日

(iv)保藏编号：NITE BP-01362

屎肠球菌R30株具有以下的细菌学性质。

表1

本发明的一个以上的实施方式中使用的R30株的培养方法只要能够有效地培养R30株即可，没有特别限制。例如，可以通过试管培养、烧瓶培养、基于发酵槽的培养等进行培养。对于培养基，没有特别限制，只要能够有效地培养R30株，可以使用任意培养基，例如，可以使用乳酸菌培养所通常使用的MRS培养基等。

本发明的一个以上的实施方式中使用的R30株可以是活菌，也可以是死菌(灭活菌)。

活菌是指活着的R30株，除了可增殖的菌以外，还可以是不增殖而处于休眠状态的菌，还包括通过水的存在等而能够再次增殖的菌。

死菌(灭活菌)是指通过加热、加压、药物处理等而实施了杀菌处理的菌体。杀菌处理方式没有特别限制，可以列举例如：干热杀菌、蒸气杀菌、高压蒸气杀菌、化学杀菌、超声波杀菌、电磁波杀菌、紫外线杀菌等。另外，杀菌处理可以在将收集到的菌体干燥后进行。另外，死菌可以是死菌体本身，也可以是处理物。作为“处理物”，可以举出实施了选自菌的磨碎、破碎、浓缩、糊化、干燥、稀释中的至少1种处理而得到的处理物。菌的干燥方式没有特别限制，可以列举：喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥、转鼓干燥等。

＜毛细血管疾病抑制剂＞

本发明的一个以上的实施方式涉及含有R30株的毛细血管疾病抑制剂。

本发明的另外的一个以上的实施方式涉及R30株在毛细血管疾病抑制剂的制造中的用途。

毛细血管疾病抑制剂可以是以非医疗目的而摄取的饮料食品组合物，也可以是以医疗目的而摄取的医药组合物，还可以是饲料组合物。饮料食品组合物、医药组合物或饲料组合物的具体例如后所述。医药组合物可以是人用医药组合物，也可以是非人动物用医药组合物，优选为人用医药组合物。

本发明的另外的一个以上的实施方式为一种毛细血管疾病的抑制方法，该方法包括：对患者给药有效量的屎肠球菌R30株。

本发明的另外的一个以上的实施方式为屎肠球菌R30株的用于抑制毛细血管疾病的用途。

本发明的另外的一个以上的实施方式为一种屎肠球菌R30株，其用于抑制毛细血管疾病的方法。

上述的各实施方式中使用的R30株可以为上述的各种形态。

本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病抑制剂具有优异的毛细血管疾病抑制效果。本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病抑制剂例如对糖尿病性的肌肉组织毛细血管疾病的抑制是有效的。

在本公开中，毛细血管疾病是指组织中的毛细血管发生退化的病变。因此，“毛细血管疾病”这样的用语与“毛细血管退化”或“组织毛细血管退化”含义相同。毛细血管疾病代表性地为糖尿病性的毛细血管疾病，也可以为因其它原因而产生的毛细血管疾病。糖尿病性的毛细血管疾病特别是因伴随血糖值上升的晚期糖基化终末产物的产生、过量的活性氧种的增加而导致的组织中的微小毛细血管网的病变，成为糖尿病并发症的原因。

目前认为，为了抑制糖尿病性的组织毛细血管疾病，需要控制血糖值。对此，本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病抑制剂的特征在于不抑制血糖值的上升而抑制组织毛细血管疾病。因此，将本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病抑制剂与具有抑制血糖值的作用的药物组合使用对患有糖尿病及糖尿病并发症的患者给药的情况下，能够减少具有抑制血糖值的作用的药物的给药量，因此是优选的。只要能够减少上述具有抑制血糖值的作用的药物的给药量，则能够减轻药物引起的不希望的副作用，并且减少医药品费用，是有用的。另外，在患者因副作用而停止了具有抑制血糖值的作用的药物的给药的情况下，随时间的经过，毛细血管疾病发展，血液无法输送至四肢末端，在最差的情况下会导致四肢坏死。但是，本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病抑制剂能够在不给药具有抑制血糖值的作用的药物的情况下抑制毛细血管疾病。即，本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病抑制剂可以向对具有抑制血糖值的作用的药物产生副作用的患者给药，由于不需要限制给药对象的患者，因此是有用的。

另外，本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病抑制剂对患者的给药可以与该患者的运动疗法组合进行。

“对患者的给药”中的患者只要是后述那样需要抑制毛细血管疾病的患者即可，除了毛细血管疾病的患者以外，还包括虽然毛细血管疾病的症状未显现但存在今后发病或显现的可能的人、需要预防毛细血管疾病的人、想要这样做的人。

毛细血管疾病的抑制作用例如可以通过对自然发病的2型糖尿病模型Goto-Kakizaki(GK)大鼠的比目鱼肌的毛细血管直径进行测定来评价。与未给药受试物质的实验动物相比，给药了受试物质的GK大鼠的比目鱼肌毛细血管直径越大，则可以评价该受试物质越具有毛细血管疾病抑制作用。另外，上述抑制作用也可以通过对荧光染色后的上述大鼠的比目鱼肌中的毛细血管的图像进行肉眼观察来评价。与未给药受试物质的实验动物相比，如果能够观察到给药了受试物质的GK大鼠的毛细血管大的图像，则可以评价受试物质具有毛细血管疾病抑制作用。

本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病抑制剂对患者的给药频率、给药量可以根据给药对象患者的年龄、性别、状态等而适当调整。平均每一天的R30株的给药量可以适当调整，例如，可以设为0.001mg/kg体重以上、且1000mg/kg体重以下。作为该给药量，优选为0.01mg/kg体重以上，更优选为0.1mg/kg体重以上，进一步优选为10mg/kg体重以上，优选为800mg/kg体重以下，更优选为550mg/kg体重以下。平均每一天的给药次数也可以适当调整，例如，可以设为1次以上、且5次以下。给药途径可以是口服给药，也可以是非口服给药，优选为口服给药。作为给药对象患者，只要是需要抑制毛细血管疾病的患者即可，例如为人或非人动物，优选为人。作为非人动物，可以列举例如：养殖动物、宠物、竞技动物等。作为养殖动物，没有特别限定，可以列举：马、牛、猪、绵羊、山羊、骆驼、美洲驼等家畜；小鼠、大鼠、豚鼠、兔等实验动物；鸡、鸭、火鸡、鸵鸟等家禽。作为宠物，没有特别限定，可以举出犬、猫等。作为竞技动物，没有特别限定，可以举出赛马等。非人动物特别优选为哺乳动物。

本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病抑制剂可以包含赋形剂等各种添加剂。对于上述各种添加剂的具体例，在后面说明。另外，在上述毛细血管疾病抑制剂包含上述各种添加剂的情况下，毛细血管疾病抑制剂中的R30菌株的含量没有特别限定，作为下限，优选为0.001重量％以上，例如，更优选为0.01重量％以上、且0.1重量％以上。另外，作为上限，优选为100重量％以下，例如，更优选为50重量％以下、且30重量％以下。

另外，在本发明的一个以上的实施方式的毛细血管抑制剂为胶囊剂、片剂等制剂的形态的情况下，平均一个制剂中包含的R30株的含量没有特别限定，可以适当调整，例如，可以设为0.1mg/剂以上、且1000mg/剂以下。作为上述平均一个制剂中包含的R30株的含量，优选为5mg/剂、10mg/剂、30mg/剂、50mg/剂、或100mg/剂。

在本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病抑制剂为饮料食品组合物、医药组合物或饲料组合物的情况下、或者在将本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病抑制剂用于饮料食品组合物、医药组合物或饲料组合物的制造的情况下，制造的饮料食品组合物、医药组合物或饲料组合物中的R30株的含量没有特别限定，可以适当调整，例如，对于饮料食品组合物、医药组合物或饲料组合物中的含量而言，作为下限，可以设为0.00001重量％以上。作为上述下限，例如，优选为0.001重量％以上、0.01重量％以上。另外，作为上限，可以设为90重量％以下。作为上述上限，优选为80重量％以下、70重量％以下、60重量％以下、50重量％以下，进一步优选为30重量％以下。

＜毛细血管疾病改善剂＞

本发明的一个以上的实施方式涉及含有R30株的毛细血管疾病改善剂。

本发明的另外的一个以上的实施方式涉及R30株在毛细血管疾病改善剂的制造中的用途。

毛细血管疾病改善剂与上述的毛细血管疾病抑制剂同样，可以是以非医疗目的而摄取的饮料食品用组合物，可以是以医疗目的而摄取的医药组合物，也可以是饲料组合物。饮料食品组合物、医药组合物或饲料组合物的具体例如后所述。医药组合物可以是人用医药组合物，也可以是非人动物用医药组合物，优选为人用医药组合物。

本发明的另外的一个以上的实施方式为一种毛细血管疾病的改善方法，该方法包括：对患者给药有效量的屎肠球菌R30株。

本发明的另外的一个以上的实施方式为屎肠球菌R30株的用于改善毛细血管疾病的用途。

本发明的另外的一个以上的实施方式为一种屎肠球菌R30株，其用于改善毛细血管疾病的方法。

上述的各实施方式所使用的R30株可以为上述的各种形态。

本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病改善剂例如对糖尿病性的肌肉组织毛细血管疾病的改善是有效的。

本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病改善剂即使不摄取具有抑制血糖值的作用的糖尿病治疗药也能够改善伴随血糖值上升所产生的毛细血管疾病。因此，在与具有抑制血糖值的作用的糖尿病治疗药组合使用的情况下，本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病改善剂能够减少摄取量，因此优选。另外，上述毛细血管疾病改善剂能够对因副作用而停止了糖尿病治疗药的给药的患者进行给药，因此是有用的。

另外，本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病改善剂对患者的给药可以与该患者的运动疗法组合进行。

“对患者的给药”中的患者只要是需要改善毛细血管疾病的患者即可，除了毛细血管疾病的患者以外，还包括虽然毛细血管疾病的症状未显现但存在今后发病或显现的可能的人、需要预防毛细血管疾病的人、想要这样做的人。

毛细血管疾病的改善作用例如可以通过对自然发病的2型糖尿病模型Goto-Kakizaki(GK)大鼠的比目鱼肌的毛细血管直径进行测定来评价。与未给药受试物质的实验动物相比，给药了受试物质的GK大鼠的比目鱼肌毛细血管直径越大，则可以评价该受试物质越具有毛细血管疾病改善作用。另外，上述改善作用也可以通过对荧光染色后的上述大鼠的比目鱼肌中的毛细血管的图像进行肉眼观察来评价。与未给药受试物质的实验动物相比，如果能够观察到给药了受试物质的GK大鼠的毛细血管大的图像，则可以评价受试物质具有毛细血管疾病改善作用。

本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病改善剂对患者的给药频率、给药量可以从对毛细血管疾病抑制剂所述的例子中选择。

对于在本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病改善剂为饮料食品组合物、医药组合物或饲料组合物的情况下、或者在将本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病改善剂用于饮料食品组合物、医药组合物或饲料组合物的制造的情况下的饮料食品组合物、医药组合物或饲料组合物中的R30株的含量、以及本发明的一个以上的实施方式的毛细血管改善剂为胶囊剂、片剂等制剂的形态的情况下的平均每一个制剂所含的R30株的含量而言，可以从对毛细血管疾病抑制剂所述的例子中选择。

＜毛细血管新生促进剂＞

本发明的一个以上的实施方式涉及含有R30株的毛细血管新生促进剂。

本发明的另外的一个以上的实施方式涉及R30株在毛细血管新生促进剂的制造中的用途。

毛细血管新生促进剂与上述的毛细血管疾病抑制剂、毛细血管疾病改善剂同样，可以是以非医疗目的而摄取的饮料食品组合物，也可以是以医疗目的而摄取的医药组合物，还可以是饲料组合物。饮料食品组合物、医药组合物或饲料组合物的具体例子如后所述。医药组合物可以是人用医药组合物，也可以是非人动物用医药组合物，优选为人用医药组合物。

本发明的另外的一个以上的实施方式为一种毛细血管新生的促进方法，该方法包括：对患者给药有效量的屎肠球菌R30株。

本发明的另外的一个以上的实施方式为屎肠球菌R30株的用于促进毛细血管新生的用途。

本发明的另外的一个以上的实施方式为一种屎肠球菌R30株，其用于促进毛细血管新生的方法。

上述的各实施方式中使用的R30株可以为上述的各种形态。

本发明的毛细血管新生促进剂例如对糖尿病性的肌肉组织毛细血管疾病的改善或抑制是有效的。

本发明的一个以上的实施方式的毛细血管新生促进剂可以促进血管新生，改善毛细血管退化等毛细血管疾病。另外，本发明的一个以上的实施方式的毛细血管新生促进剂对患者的给药可以与该患者的运动疗法组合进行。

“对患者的给药”中的患者只要是需要毛细血管新生的患者即可，除了毛细血管疾病的患者以外，还包括虽然毛细血管疾病的症状未显现但存在今后发病或显现的可能的人、需要预防毛细血管疾病的人、想要这样做的人。

毛细血管新生的促进作用例如可以通过对自然发病的2型糖尿病模型Goto-Kakizaki(GK)大鼠的比目鱼肌的毛细血管直径进行测定来评价。与未给药受试物质的实验动物相比，给药了受试物质的GK大鼠的比目鱼肌毛细血管直径越大，则可以评价该受试物质越具有毛细血管新生促进作用。另外，上述促进作用也可以通过对荧光染色后的上述大鼠的比目鱼肌中的毛细血管的图像进行肉眼观察来评价。与未给药受试物质的实验动物相比，如果能够观察到给药了受试物质的GK大鼠的毛细血管大的图像，则可以评价受试物质具有毛细血管新生促进作用。

本发明的一个以上的实施方式的毛细血管新生促进剂对患者的给药频率、给药量可以从对毛细血管疾病抑制剂、毛细血管改善剂所述的例子中选择。

对于在本发明的一个以上的实施方式的毛细血管新生促进剂为饮料食品组合物、医药组合物或饲料组合物的情况下、或者在将本发明的一个以上的实施方式的毛细血管新生促进剂用于饮料食品组合物、医药组合物或饲料组合物的制造的情况下的饮料食品组合物、医药组合物或饲料组合物中的R30株的含量、以及本发明的一个以上的实施方式的毛细血管新生促进剂为胶囊剂、片剂等制剂的形态的情况下的平均每一个制剂所含的R30株的含量而言，可以从对毛细血管疾病抑制剂所述的例子中选择。

＜糖尿病并发症的预防或抑制剂＞

本发明的一个以上的实施方式涉及含有R30株的糖尿病并发症的预防或抑制剂。

本发明的另外的一个以上的实施方式涉及R30株在糖尿病并发症的预防剂或抑制剂的制造中的用途。

用于预防或抑制糖尿病并发症的饮料食品组合物是以非医疗目的而摄取的饮料食品组合物，也可以是以医疗目的而摄取的医药组合物，还可以是饲料组合物。饮料食品组合物、医药组合物或饲料组合物的具体例如后所述。医药组合物可以是人用医药组合物，也可以是非人动物用医药组合物，优选为人用医药组合物。

本发明的另外的一个以上的实施方式为一种糖尿病并发症的预防或抑制方法，该方法包括：对需要预防或抑制糖尿病并发症的患者给药有效量的R30株。

本发明的另外的一个以上的实施方式为屎肠球菌R30株的用于糖尿病并发症的预防或抑制的用途。

本发明的另外的一个以上的实施方式为一种屎肠球菌R30株，其用于预防或抑制糖尿病并发症的方法。

上述的各实施方式中使用的R30株可以为上述的各种形态。

在上述的各实施方式中，糖尿病并发症的预防是指预先防止糖尿病并发症的发病或患病，糖尿病并发症的抑制是指抑制糖尿病并发症的发展。

本发明的一个以上的实施方式的糖尿病并发症的预防或抑制剂通过抑制成为糖尿病并发症的原因的毛细血管疾病的作用，可以预防或抑制糖尿病并发症。目标的糖尿病并发症可以是1型糖尿病的并发症，也可以是2型糖尿病的并发症。

在将本发明的一个以上的实施方式的糖尿病并发症的预防或抑制剂与具有抑制血糖值的作用的糖尿病治疗药组合使用而对患有糖尿病及糖尿病并发症的患者给药的情况下，能够减少糖尿病治疗药的给药量，因此优选。另外，对于因副作用而停止了具有抑制血糖值的作用的糖尿病治疗药的给药的患者，本发明的一个以上的实施方式的糖尿病并发症的预防或抑制剂也是有效的。

本发明的一个以上的实施方式的糖尿病并发症的预防或抑制剂对患者的给药可以与该患者的运动疗法组合进行。

本发明的一个以上的实施方式的糖尿病并发症的预防或抑制剂对需要糖尿病并发症的预防或抑制的患者的给药频率、给药量可以根据给药对象患者的年龄、性别、状态等而适当调整。平均每一天的R30株的给药量可以适当调整，例如，可以设为0.001mg/kg体重以上、且1000mg/kg体重以下。作为该给药量，优选为0.01mg/kg体重以上，更优选为0.1mg/kg体重以上，更优选为10mg/kg体重以上，优选为800mg/kg体重以下，更优选为550mg/kg体重以下。平均每一天的给药次数也可以适当调整，例如，可以设为1次以上、且5次以下。给药途径可以是口服给药，也可以是非口服给药，优选为口服给药。作为给药对象患者，只要是需要抑制毛细血管疾病的患者即可，例如为人或非人动物，优选为人。非人动物的例子如上所述。

在本发明的一个以上的实施方式的糖尿病并发症的预防或抑制剂为食品组合物、医药组合物或饲料组合物的情况下、或者在将本发明的一个以上的实施方式的糖尿病并发症的预防或抑制剂用于饮料食品组合物、医药组合物或饲料组合物的制造的情况下，饮料食品组合物、医药组合物或饲料组合物中的R30株的含量没有特别限定，可以适当调整，例如，作为饮料食品组合物、医药组合物或饲料组合物中的含量，可以设为0.00001重量％以上、且50重量％以下。作为该比例，优选为0.001重量％以上，更优选为0.01重量％以上，另外，优选为30重量％以下。

＜组合物＞

本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病抑制剂、毛细血管疾病改善剂、毛细血管新生促进剂或糖尿病并发症的预防或抑制剂的形状没有特别限定。例如，可以是上述各种形态的R30株本身，也可以是含有R30株和其它成分的组合物。含有R30株和其它成分的组合物可以是与医药组合物、饮料食品组合物、饲料组合物等的目的相应的组合物。

本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病抑制剂、毛细血管疾病改善剂、毛细血管新生促进剂或糖尿病并发症的预防或抑制剂如后述的实施例那样在口服给药中显示出很好的效果，而且从易于摄取、服用的观点考虑，优选为口服摄取或给药的医药组合物、饮料食品组合物、饲料组合物。以下，有时将本发明的一个以上的实施方式的“毛细血管疾病抑制剂、毛细血管疾病改善剂、毛细血管新生促进剂或糖尿病并发症的预防或抑制剂”简称为“本发明的一个以上的实施方式的药剂”。

例如，含有R30株的活菌的组合物可以通过以下方式制造：收集通过通常方法培养的培养液中的R30株的菌体，添加将保护剂溶解于收集到的菌体而得到的溶液，进行干燥，然后，与适当的赋形剂进行混合。上述保护剂是指，保护菌体免受外部环境影响而保持活菌数或抑制活菌数减少的成分。作为保护剂，例如可以是海藻糖、牛血清白蛋白、脱脂奶粉、谷氨酸钠、L-抗坏血酸、组氨酸、苹果酸、乳清、葡萄糖、天冬氨酸、甲硫氨酸、淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、氯化钠、磷酸盐等能够减轻对菌体造成的损伤的物质。这些保护剂可以单独使用或组合使用。各保护剂的配合比例没有限定，保护剂总量的下限相对于干燥菌体重量优选为1重量％以上。上述比例为1重量％以上时，能够更可靠地减轻菌体受到的损伤。另一方面，上述比例的上限没有特别限制，例如，可以设为50000重量％以下。作为上述比例，更优选为10重量％以上，更进一步优选为50重量％以上，更进一步优选为100重量％以上，另外，更优选为20000重量％以下，更进一步优选为10000重量％以下。

含有R30株的死菌的组合物例如可以通过如下方式制造：收集通过通常方法培养的培养液中的菌体，对收集到的菌体进行杀菌处理，在干燥后，与适当的赋形剂混合。

另外，本发明的一个以上的实施方式的毛细血管疾病抑制剂、毛细血管疾病改善剂、毛细血管新生促进剂、或者糖尿病并发症的预防或抑制剂可以包含适当量的通常制剂的制造所使用的各种添加剂。作为这样的添加剂，可以列举：赋形剂、粘合剂、崩解剂、酸味料、发泡剂、人工甜味剂、香料、润滑剂、着色剂、稳定剂、pH调整剂、表面活性剂等。

作为赋形剂，可以列举例如：玉米淀粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、部分预糊化淀粉、预糊化淀粉、多孔淀粉等淀粉类、乳糖、蔗糖、葡萄糖等糖、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇等糖醇、硅酸铝镁、水滑石、无水磷酸钙、沉淀碳酸钙、硅酸钙、轻质无水硅酸等无机化合物等。

作为赋形剂，可以进一步列举例如：阿拉伯胶、乳糖、微晶纤维素、淀粉、羟基乙酸淀粉钠、磷酸氢钙、硬脂酸镁、滑石、胶体二氧化硅等。

作为粘合剂，可以列举例如：羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯胶粉末、明胶、普鲁兰多糖等。

作为崩解剂，可以列举例如：淀粉、琼脂、羧甲基纤维素钙、羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、结晶纤维素、F-MELT(商标，富士化学工业株式会社制)等。

作为酸味剂，可以列举例如：柠檬酸、酒石酸、苹果酸、抗坏血酸等。作为发泡剂，可以列举例如：碳酸氢钠、碳酸钠等。

作为甜味剂，可以列举例如：糖精钠、甘草酸二钾、阿斯巴甜、甜叶菊、索马甜等。

作为香料，可以列举例如：柠檬油、橙油、薄荷醇等。

作为润滑剂，可以列举例如：硬脂酸镁、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇、滑石、硬脂酸、硬脂富马酸钠等。作为着色剂，可以列举例如：食用黄色5号、食用红色2号、食用蓝色2号等食用色素、食用色淀色素、三氧化二铁等。

作为稳定化剂，可以列举：依地酸钠、生育酚、环糊精等。

作为pH调整剂，可以列举：柠檬酸盐、磷酸盐、碳酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、乙酸盐、氨基酸盐等。

作为表面活性剂，可以列举：聚山梨酯80、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、阿拉伯胶、粉末黄蓍胶等。

以下，本发明的一个以上的实施方式的药剂为医药组合物、饮料食品组合物或饲料组合物的情况的具体的实施方式进行说明。

本发明的一个以上的实施方式的含有R30株的药剂可以为医药组合物。上述医药组合物可以为片剂、散剂、胶囊剂、糖衣片、颗粒剂、提取物剂、酏剂、糖浆剂、酊剂、柠檬水剂等剂型。医药组合物可以根据希望的剂型而含有作为医药品所允许的添加剂(也称为药学上允许的载体)。作为这样的添加剂，可以列举例如：赋形剂、崩解剂、润滑剂、抗氧化剂、香料、调味料、甜味料、着色料、增粘稳定剂、显色剂、漂白剂、防霉剂、胶基、苦味料、酶、光泽剂、酸味料、乳化剂、增强剂、制造用剂、粘合剂、等张剂、缓冲剂、溶解助剂、防腐剂、稳定剂、抗凝剂、吸收促进剂、凝固剂等。医药组合物可以根据剂型等通过通常方法来制造。

上述医药组合物可以是对人给药的医药组合物，也可以是对非人动物给药的医药组合物。非人动物的具体例如上所述。对非人动物给药的医药组合物可以是除了作为有效成分的R30株以外还进一步包含能够配合在后述的饲料组合物中的作为饲料所允许的成分的组合物。

本发明的一个以上的实施方式的含有R30株的药剂可以作为饮料食品组合物使用。上述饮料食品用组合物可以是一般的食品、饮料等通常的饮料食品组合物，可以是所谓的健康食品、补品、功能性食品、功能性标识食品、营养辅助食品、特定保健用食品、营养功能食品、保健功能食品、特定用途食品、护理食品、微笑护理食品、咀嚼/吞咽辅助食品、浓稠流质食品、患者用食品、膳食补充剂等用途的饮料食品组合物。作为本发明的一个以上的实施方式的药剂的饮料食品组合物除R30株以外，还含有作为饮料食品所允许的成分。

上述饮料食品组合物的形态没有特别限定，可以列举例如：乳饮料、清凉饮料、运动饮料、营养饮料、美容饮料、液体营养剂等饮料；口香糖、巧克力、糖果、果冻、蛋糕、派、曲奇、日式点心、轻食点心、油馃子、米馃、饼干、薄脆饼干等点心类；冰激凌、冰点心等冰点心类；乌冬面、中式面条、意大利面、方便面等面类；鱼糕、竹轮、半片(鱼饼)等熬炼产品；调味汁、蛋黄酱、酱汁、酱料等调味料；面包、火腿、菜粥、米饭、汤、蒸煮食品、冷冻食品、以及食用油脂组合物、烹饪油类、喷雾油类、黄油类、人造黄油类、起酥油类、搅打稀奶油类、浓缩乳类、增白剂类、调味汁类、腌菜液类、烘焙混合类、油炸食品类、加工肉制品类、豆腐/魔芋等其它加工品；果酱类、发酵乳类、罐头类等通常的饮料食品组合物的形态。需要说明的是，上述饮料食品组合物可以是使用R30株将一般的饮料食品组合物发酵而成的发酵物。

在上述饮料食品组合物为特定保健用食品、功能性表示食品、膳食补充剂的情况下，可以将上述饮料食品组合物包子包装中，并在该包装标识出与毛细血管疾病的抑制、毛细血管疾病的改善、毛细血管新生的促进、糖尿病并发症的预防或抑制相关的功能。作为包装，没有特别限制，可以列举例如：箱、容器、包装膜、包装纸等。另外，作为在包装上标识的功能，除了毛细血管疾病的抑制、毛细血管疾病的改善、毛细血管新生的促进、糖尿病并发症的预防或抑制以外，还可以举出作为与它们相关的功能、毛细血管疾病的抑制作用、毛细血管疾病的改善作用、毛细血管新生的促进作用、糖尿病并发症的预防或抑制作用的目的、效果而在本说明书中记载的功能。当然，只要是属于上述的功能即可，标识可以不同。

需要说明的是，功能性食品是指国家、公共团体批准/指定的具有血管疾病抑制剂的功效的食品，例如，营养功能食品、特定保健用食品等保健功能食品、特别用途食品等。需要说明的是，名称、规章随情况、时代而变化，但本质上相同的食品包含于本发明。

作为本发明的一个以上的实施方式的药剂的饮料食品组合物可以是胶囊剂、糖浆剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、饮料剂、注射剂、输液、滴鼻剂、滴眼剂、栓剂、贴剂、喷雾剂等形状。在制剂过程中，除了R30株以外，还可以适宜添加作为饮料食品所允许的其它成分、例如赋形剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、抗氧化剂、着色剂、抗凝剂、吸收促进剂、溶解助剂、稳定剂等来制备。

本发明的一个以上的实施方式的药剂可以为饲料组合物(包括宠物食品)。上述饲料组合物包含根据动物的种类、生长阶段、地域等饲养环境而选择的作为饲料所允许的成分和R30株。作为饲料所允许的成分，可以列举：一般的饲料原料、配合饲料中通常使用的饲料用添加剂(例如，赋形剂、增量剂、粘合剂、增稠剂、乳化剂、着色料、香料、食品添加物、调味料等)、饲料用添加物以外的成分(例如，抗生素、杀菌剂、驱虫剂、防腐剂等)。作为一般的饲料原料，可以列举例如：谷物类或加工谷物类、糟糠类、植物性油粕类、动物性原料、矿物质类、维生素类、氨基酸、啤酒酵母等酵母类、无机物质的微粉末等。作为谷物类或加工谷物类，可以列举：玉米、高粱、大麦、小麦、黑麦、燕麦、小米、小麦粉、小麦胚芽粉等。作为糟糠类，可以列举：麦麸、米糠、玉米蛋白饲料等。作为植物性油粕类，可以列举：大豆油粕、芝麻油粕、棉籽油粕、花生粕、葵花粕、红花粕等。作为动物性原料，可以列举：脱脂奶粉、鱼粉、肉骨粉等。作为矿物质类，可以列举：碳酸钙、磷酸钙、食盐、无水硅酸等。作为维生素类，可以列举：维生素A、维生素D、维生素E、维生素K、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、泛酸钙、烟酰胺、叶酸等。作为氨基酸，可以列举：甘氨酸、甲硫氨酸等。作为无机物质的微粉末，可以列举：结晶性纤维素、滑石、二氧化硅、白云母、沸石等。

上述饲料组合物的形态没有特别限定，可以列举例如：粉末状、颗粒状、糊状、粒子状、胶囊剂、片剂等。胶囊可以是硬胶囊，也可以是软胶囊。作为上述饲料组合物的施用对象的非人动物没有特别限定。非人动物的具体例如上所述。

实施例

实施例1：屎肠球菌R30株的冷冻干燥菌体的制备

将MRS肉汤(关东化学株式会社制)(0.52g)溶解于水(10mL)中后，在高压釜中、于121℃下进行15分钟加热灭菌，由此制备了MRS液体培养基。在该液体培养基(10mL)中接种屎肠球菌R30株(保藏编号NITE BP-01362)的甘油储备悬浮液(100μL)，在37℃下进行24小时培养，由此得到了前培养液。将该前培养液(1mL)加入上述MRS液体培养基(100mL)，进一步在37℃下进行了24小时培养。培养结束后，以8000rpm离心分离10分钟，使培养液与菌体分离。用灭菌水(100mL)清洗菌体后，再次进行离心分离，由此将灭菌水与菌体分离。向菌体中加入灭菌水(2mL)，在90℃下加热杀菌30分钟后，进行冷冻干燥，得到了屎肠球菌R30株的冷冻干燥菌体。

实施例2：屎肠球菌R30株对血糖值的影响的确认试验

将5周龄的Wistar(CON)大鼠13只、以及5周龄的雄性Goto-Kakizaki(GK)大鼠(2型糖尿病模型动物)12只分为Wistar大鼠/生理盐水给药组(CON/Saline：n＝6)、Wistar大鼠/屎肠球菌R30给药组(CON/R30：n＝7)、GK大鼠/生理盐水给药组(GK/Saline：n＝6)、GK大鼠/屎肠球菌R30给药组(GK/R30：n＝6)。各组中加入通常饲料(“CE-2”、CLEA Japan公司制)，使其自由摄取水，进行1周的预备饲养。然后，使上述实施例1中制作的屎肠球菌R30株的冷冻干燥菌体分散于生理盐水，在CON/R30组、GK/R30组中，以该菌体的给药量达到平均每1kg体重500mg的方式使用探针(口服用管)1天2次口服给药，饲养了8周。

在饲养8周后，进行了基于糖负荷试验的糖尿病评价。在糖尿病的评价中，在禁食18小时后，进行采血(0分钟)，将调整为0.2g/mL的葡萄糖水溶液口服给药单位大鼠体重(kg)10mL，在15、30、60及120分钟后进行采血，使用血糖值测定器(“Precision Xceed”、Abbott Japan公司制)测定了各血液样品中的血糖值。将测定结果示于图1。

如图1所示的结果所述，通过对作为自然发病的2型糖尿病模型的GK大鼠给药了生理盐水的GK/Saline组在葡萄糖给药后的血糖值的上升，可知GK大鼠处于糖尿病状态。另外，对GK大鼠给药了屎肠球菌R30株的GK/R30组也同样，根据葡萄糖给药后的血糖值上升，可知GK/R30组也处于糖尿病状态。

另一方面，对作为非糖尿病对照大鼠的Wistar大鼠给药了生理盐水的CON/Saline组在葡萄糖给药后血糖值没有上升，由此可知CON/Saline组不是糖尿病状态，对Wistar大鼠给药了屎肠球菌R30株的CON/R30组也不是糖尿病状态。

实施例3：屎肠球菌R30株对比目鱼肌毛细血管直径的影响

在饲养8周后的上述糖负荷试验后，用戊巴比妥钠(50mg/kg)将上述实施例2的各组麻醉后，将套管插入腹主动脉，用生理盐水在骨骼肌毛细血管内进行灌注，灌注了在42℃下为液态的8％明胶溶液(Sigma Aldrich公司制)中加入1％荧光物质(荧光标记补充墨水Tombow公司制)而成的荧光造影剂，然后摘取比目鱼肌。将摘取的比目鱼肌在-80℃下冷冻，在低温恒温器中制成厚度100μm的纵向切片后，用4％多聚甲醛进行固定，通过使用了氩激光(488nm)的共聚焦激光显微镜(C2+NIKON公司制)及荧光成像软件(NIS-Elements NIKON公司制)对每1μm肌肉切片中存在的毛细血管进行扫描，测定了毛细血管直径。将测定结果示于图2。Wistar大鼠/生理盐水给药组(CON/Saline)的毛细血管直径的测定次数(n数)为29，Wistar大鼠/屎肠球菌R30给药组(CON/R30)的n数为29，GK大鼠/生理盐水给药组(GK/Saline)的n数为27，GK大鼠/屎肠球菌R30给药组(GK/R30)的n数为23。

如图2所示的结果所述，与CON/Saline组的毛细血管直径(平均7.0μm)相比，可知CON/R30组的毛细血管直径(平均7.2μm)是同等的。另一方面，在糖尿病状态的GK/Saline组中，毛细血管直径为平均6.0μm，与CON/Saline组相比，毛细血管直径显著缩小，可知发生了因糖尿病状态导致的毛细血管疾病。与此相对，在GK/R30组中，毛细血管直径为平均7.0μm，与GK/Saline组相比，可知毛细血管直径显著扩大，为与非糖尿病状态的CON/Saline组同等的毛细血管直径。本结果表明，屎肠球菌R30乳酸菌具有毛细血管疾病抑制效果。

实施例4：屎肠球菌R30株对比目鱼肌毛细血管新生的影响

将6只5周龄的雄性Goto-Kakizaki(GK)大鼠(2型糖尿病模型动物)分为GK大鼠/生理盐水给药组(GK/Saline：n＝3)、GK大鼠/屎肠球菌R30给药组(GK/R30：n＝3)。在各组中加入通常饲料(“CE-2”、CLEA Japan公司制)，使其自由摄取水，进行1周的预备饲养。然后，使上述实施例1中制作的屎肠球菌R30株的冷冻干燥菌体分散于生理盐水，在GK/R30组中，以该菌体的给药量达到平均每1kg体重500mg的方式使用探针(口服用管)1天2次口服给药，饲养了8周。在饲养8周后，用戊巴比妥钠(50mg/kg)进行麻醉后，将套管插入腹主动脉，用生理盐水在骨骼肌毛细血管内进行灌注，灌注了在42℃下为液态的8％明胶溶液(SigmaAldrich公司制)中加入1％荧光物质(荧光标记补充墨水Tombow公司制)而成的荧光造影剂，然后摘取比目鱼肌。将摘取的比目鱼肌在-80℃下冷冻，在低温恒温器中制成厚度100μm的纵向切片后，用4％多聚甲醛进行固定，通过使用了氩激光(488nm)的共聚焦激光显微镜(C2+NIKON公司制)及荧光成像软件(NIS-Elements NIKON公司制)对每1μm肌肉切片进行扫描，构建了三维毛细血管图像。图3为用共聚焦激光显微镜及荧光成像软件构建的毛细血管的三维图像。

如图3所示，在糖尿病状态的GK/Saline组中，毛细血管直径缩小，可知发生了因糖尿病状态导致的毛细血管疾病。另一方面，在GK/R30组中，与GK/Saline组相比，毛细血管密集，可知新生成了新的毛细血管。由此表明，屎肠球菌R30乳酸菌具有毛细血管疾病的改善效果和/或毛细血管新生促进效果。

实施例5：毛细血管新生确认试验

将实施例3中摘取并在-80℃下冷冻的比目鱼肌在追加了蛋白酶抑制剂的HEPES缓冲液中进行均质化，然后，通过离心分离回收了上清。测定上清中的总蛋白质质量，以使样品间的总蛋白质质量相同的方式调整浓度，然后供于SDS-PAGE。将通过电泳展开的蛋白质转印至PVDF膜，进行封闭后，加入抗血小板反应蛋白-1(TSP-1)抗体(“sc-59887”SantaCruz Biotechnology公司制)的100倍稀释液、抗VEGF抗体(“sc-7269”Santa CruzBiotechnology公司制)的200倍稀释液或抗β肌动蛋白抗体(“sc-47778”Santa CruzBiotechnology公司制)的200倍稀释液，在孵育后，进一步添加HRP标记的二次抗体，使用HRP用检测试剂(“EzWestLumi One”ATTO公司制)使其显色。使用发光图像分析仪(“LAS-1000”FUJIFILM公司制)获取图像，使用图像分析软件“(Science Lab”FUJIFILM公司制)测定光学密度，由此测定TSP-1、VEGF、β肌动蛋白的生物合成量，将各试样中的TSP-1及VEGF的生物合成量用该试样中的β肌动蛋白的生物合成量进行标准化，以相对于CON/Saline的相对值进行了标准化。关于测定值，进行了单因素方差分析和Turkey-Kramer的多重比较检验。将结果示于图4及图5。在图4及图5中，“＊”表示与CON/Saline组之间在p＜0.05下具有显著差异，“#”表示与GK/Saline组之间在p＜0.05下具有显著差异。在图4及图5中，分别以将CON/Saline组中的TSP-1及VEGF的生物合成量设为100时的相对值示出了各组的TSP-1及VEGF的生物合成量。

如图4所示，与非糖尿病对照大鼠的CON/Saline组相比，可知GK/Saline组、GK/R30组中，作为血管新生抑制因子的TSP-1的表达量均显著高。另外，如图5所示可知，与CON/Saline组、GK/Saline组相比，GK/R30组的参与毛细血管新生的VEGF的生物合成量显著高。由此表明，屎肠球菌R30乳酸菌在发生了因糖尿病状态导致的毛细血管疾病的状态下，具有毛细血管新生促进效果。

本说明书中引用的全部出版物、专利及专利申请通过引用直接引入本说明书。

PCT/RO/134表