桂枝芍药知母汤全方9药味中8个药味的薄层鉴别方法

摘要

本发明属于中药质量控制技术领域，具体涉及桂枝芍药知母汤全方9药味中8个药味的薄层鉴别方法，包括以下步骤：取桂枝芍药知母汤的煎液、冻干粉或颗粒，制成醚层供试品溶液和水层供试品溶液；混合对照品溶液1的制备；水层对照药材溶液的制备；取水层供试品溶液、水层对照药材溶液、混合对照品溶液1，按照薄层色谱条件展开，指认各成分的斑点；混合对照品溶液2的制备；醚层对照药材溶液的制备；取醚层供试品溶液、醚层对照药材溶液、混合对照品溶液2，按照薄层色谱条件展开，指认各成分的斑点。本发明的薄层鉴别方法能够对桂枝芍药知母汤全方9药味中的8个药味进行鉴别，薄层鉴别的专属性强，操作简便、快捷，检测效率高，降低了检测成本。

说明书

技术领域

本发明属于中药质量控制技术领域，具体涉及桂枝芍药知母汤全方9药味中8个药味的薄层鉴别方法。

背景技术

桂枝芍药知母汤属于2018年国家中医药管理局会同国家药品监督管理局制订《古代经典名方目录(第一批)》中的100首经典名方之一。出自东汉名家张仲景《金匮要略》一书，“诸肢节痛疼，身体行魁羸，脚肿如脱，头眩短气，温温欲吐，桂枝芍药知母汤主之。”，可祛风除湿，通阳宣痹，养阴清热，是治疗类风湿关节炎的优良方剂。该方由桂枝、附子(炮)、芍药、麻黄、生姜、白术、知母、防风和甘草九味药组成，按传统水煎而成。方药：桂枝四两，芍药三两，甘草二两，麻黄二两，生姜五两，白术五两，知母四两，防风四两，附子二两(炮)，上九味，以水七升，煮取二升，温服七合，日三服。此方为桂枝汤化裁而来，加桂枝及生姜用量以祛水气、降逆，去大枣之壅满，加麻黄、防风之发散表风邪水气，加知母以利水消肢肿，用白术、附子之除湿解痹，附子有强壮温经、散寒止痛之用。全方治疗风湿关节痛、肢体肿而气冲呕逆者。桂枝芍药知母汤是为湿气而设定，桂枝芍药知母汤，主要是由桂枝、白芍、甘草、麻黄、白术、知母、防风、附子、生姜组成。首先，桂枝，白芍，甘草，生姜，这几味药就是桂枝汤的组成，这就是解除肌肉内的湿气，而麻黄，桂枝的组成相当于麻黄汤的组成，这是祛除体表的湿气，特别是麻黄具有开肺气的作用，出汗就是排湿的一个重要途径，所以这些药就是将出汗运用到极致。其次，组成中有白术，知母，防风，这些药物都有利水，即利尿的作用，水湿之邪要祛除发汗是可靠的途径，同时利尿也是有效途径。为了祛除湿气必须要有动力，桂枝，附子，生姜之类的药物，就是积极鼓动体内的力量从而将湿气排除体外。

纵观2020年版中国药典一部成方制剂中收载的薄层鉴别方法分析可知，薄层鉴别基本都是一个品种，建立N项鉴别，就要制备N种供试品溶液，N块薄层板，展开N次，鉴别N味药材的传统鉴别模式。如中国专利申请CN103901154A公开了一种治疗糖尿病的中药制剂的薄层鉴别方法，它包括麦冬的薄层鉴别、五味子的薄层鉴别和甘草的薄层鉴别，其在薄层鉴别麦冬、五味子、甘草时，采用的是传统的制备3种供试品溶液，3块薄层板，展开3次的鉴别模式。为排除干扰，样品的前处理程序多、复杂、烦琐，需用大量的有机试剂反复纯化处理，费力、费时、费试剂、污染环境，危害健康，检测周期长。检测速度严重制约着中药现代化生产速度。

综上所述，所以寻找中药复方制剂的简便、快捷检测方法、提高检测效率、降低检测成本，是中药质量控制必须突破的难关。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种桂枝芍药知母汤全方9药味中8个药味的薄层鉴别方法。本发明提供的薄层鉴别方法能够对桂枝芍药知母汤全方9药味中的8个药味进行鉴别，薄层鉴别的专属性强，操作简便、快捷，检测效率高，降低了检测成本，为桂枝芍药知母汤的质量控制提供参考依据，意义重大。

本发明的技术方案是：

桂枝芍药知母汤全方9药味中8个药味的薄层鉴别方法，包括以下步骤：

S1供试品溶液的制备：取桂枝芍药知母汤的煎液、冻干粉或颗粒，分别制成醚层供试品溶液和水层供试品溶液；

S2混合对照品溶液1的制备：取对照品，制成混合对照品溶液1；

S3水层对照药材溶液的制备：取甘草对照药材、白芍对照药材、麻黄对照药材、防风对照药材、知母对照药材，分别加水，提取，过滤，滤液通过大孔吸附树脂柱，用氨溶液洗脱，弃去氨液，再用水洗脱，弃去水液，继续用乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，即得水层对照药材溶液，即甘草对照药材溶液、白芍对照药材溶液、麻黄对照药材溶液、防风对照药材溶液、知母对照药材溶液；

S4薄层色谱分析1：取步骤S1所得水层供试品溶液、步骤S3所得甘草对照药材溶液、白芍对照药材溶液、知母对照药材溶液、麻黄对照药材溶液和防风对照药材溶液、步骤S2所得混合对照品溶液1，按照薄层色谱条件展开，指认各成分的斑点；

S5混合对照品溶液2的制备：取对照品，制成混合对照品溶液2；

S6醚层对照药材溶液的制备：取白术对照药材、桂枝对照药材，分别加水，提取，过滤，滤液转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取2次，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇溶解，即得醚层对照药材溶液，即白术对照药材溶液、桂枝对照药材溶液；

S7薄层色谱分析2：取步骤S1所得醚层供试品溶液、步骤S6所得白术对照药材溶液、桂枝对照药材溶液、步骤S5所得混合对照品溶液2，按照薄层色谱条件展开，指认各成分的斑点。

进一步地，所述步骤S1中，取桂枝芍药知母汤的煎液、冻干粉或颗粒，相当于总饮片量5-10g，加水20-60mL，加热使溶解，放冷，转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取2-3次，每次30-80mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1-3mL使溶解，得醚层供试品溶液；取桂枝芍药知母汤的煎液、冻干粉或颗粒，相当于总饮片量5-10g，加水20-60mL，加热使溶解，放冷，通过大孔吸附树脂柱，用氨溶液25-35mL洗脱，弃去氨液，再用水15-25mL洗脱，弃去水液，继续用体积分数为10-60％的乙醇水溶液30-80mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1-3mL使溶解，即得水层供试品溶液。

进一步地，所述步骤S2中，取甘草苷对照品、芹糖甘草苷对照品、芍药苷对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品，用甲醇制成含量为0.3-0.8mg/mL的混合对照品溶液1。

进一步地，所述步骤S3中，取甘草对照药材0.3-0.7g、白芍对照药材0.3-0.7g、麻黄对照药材0.3-0.7g、防风对照药材0.8-1.2g、知母对照药材0.8-1.2g，分别加水20-60mL，加热回流提取0.5-1.5小时，趁热过滤，滤液通过大孔吸附树脂柱，用氨溶液25-35mL洗脱，弃去氨液，再用水15-25mL洗脱，弃去水液，继续用体积分数为10-60％的乙醇水溶液30-80mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1-3mL使溶解，即得水层对照药材溶液，即甘草对照药材溶液、白芍对照药材溶液、麻黄对照药材溶液、防风对照药材溶液、知母对照药材溶液。

进一步地，所述步骤S4中，薄层色谱条件为：采用硅胶G板为薄层板，点样量为10-40μL，展开剂为乙酸乙酯-甲醇-水，展开，晾干，显色前，置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与麻黄对照药材色谱相应的位置显相同颜色的荧光斑点；喷磷钼酸硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；置日光灯下检视，供试品色谱中，在与芹糖甘草苷对照品、芍药苷对照品、甘草苷对照品和甘草对照药材、白芍对照药材、知母对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与5-O-甲基维斯阿米醇苷和防风对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

进一步地，所述展开剂乙酸乙酯-甲醇-水的体积比为15-20：2-7：1。

进一步地，所述展开剂乙酸乙酯-甲醇-水的体积比为20：2：1。

进一步地，所述步骤S5中，取6-姜辣素对照品、白术内酯III对照品、白术内酯II对照品，用甲醇制成含量为0.3-0.8mg/mL的混合对照品溶液2。

进一步地，所述步骤S6中，取白术对照药材0.5-1.0g、桂枝对照药材0.5-1.0g，分别加水20-60mL，加热回流提取0.5-1.5小时，趁热过滤，滤液转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取2-3次，每次30-80mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1-3mL使溶解，即得醚层对照药材溶液。

进一步地，所述步骤S7中，薄层色谱条件为：采用硅胶GF254板为薄层板，醚层供试品溶液、白术对照药材溶液、桂枝对照药材溶液的点样量为20-40μL，混合对照品溶液2的点样量为10-20μL，展开剂为环已烷-二氯甲烷-乙酯乙酯-甲酸，展开，晾干，置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与桂枝对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；再喷以5％香草醛硫酸试液，置105℃烘至斑点显色，日光灯下检视，供试品色谱中，在与6-姜辣素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与白术内酯II对照品、白术内酯III对照品和白术对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

进一步地，所述展开剂环已烷-二氯甲烷-乙酯乙酯-甲酸的体积比为3-4：1-2：1-2：0.1-0.2。

进一步地，所述展开剂环已烷-二氯甲烷-乙酯乙酯-甲酸的体积比为4：1：1：0.1。

本发明供试品溶液的提取方法是基于相似相溶的原理，将中草药中的小极性成分用乙醚萃取得到醚层供试品溶液和采用大孔树脂吸附后，大极性成分因没有保留而被去除和小极性成分因吸附强而留置，再用合适的溶剂将中极性成分洗脱而得到水层供试品溶液的方法。最后通过显色前后、紫外及日光等多维度检视条件即可鉴别不同的化学成分。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

(1)本发明首创仅需制备1个供试品溶液，即可同时鉴别生姜、桂枝和白术。

(2)本发明首创仅需制备1个供试品溶液，采用水溶液过柱的方法制备供试品溶液，即可同时鉴别防风、麻黄、知母、白芍和甘草。

(3)本发明在鉴别甘草时，首创采用甘草苷、芹糖甘草苷对照品和对照药材同时鉴别甘草。

(4)本发明在鉴别白术时，首创采用白术内酯II、白术内酯III对照品和对照药材同时鉴别白术。

(5)本发明提供的薄层鉴别方法能够对桂枝芍药知母汤全方9药味中的8个药味进行鉴别，薄层鉴别的专属性强，操作简便、快捷，检测效率高，降低了检测成本，为桂枝芍药知母汤的质量控制提供参考依据，意义重大。

附图说明

图1为桂枝芍药知母汤水层供试品溶液显色前365nm紫外灯下检视的薄层色谱图(鉴别麻黄)，其中a、麻黄对照药材的主斑点；1、混合对照品溶液1(5-O-甲基维斯阿米醇苷、芹糖苷草苷、芍药苷、甘草苷)；2、防风对照药材；3、麻黄对照药材；4、知母对照药材；5、白芍对照药材；6、甘草对照药材；7、桂枝芍药知母汤水层供试品溶液样品1；8、桂枝芍药知母汤水层供试品溶液样品2；9、桂枝芍药知母汤水层供试品溶液样品3；10、防风阴性；11、麻黄阴性；12、知母阴性；13、白芍阴性；14、甘草阴性。

图2为桂枝芍药知母汤水层供试品溶液显色后日光灯下检视的薄层色谱图(鉴别知母、白芍、甘草)，其中，b、甘草苷；c、芍药苷；d、芹糖甘草苷；e、知母对照药材的主斑点；1、混合对照品溶液1(5-O-甲基维斯阿米醇苷、芹糖苷草苷、芍药苷、甘草苷)；2、防风对照药材；3、麻黄对照药材；4、知母对照药材；5、白芍对照药材；6、甘草对照药材；7、桂枝芍药知母汤水层供试品溶液样品1；8、桂枝芍药知母汤水层供试品溶液样品2；9、桂枝芍药知母汤水层供试品溶液样品3；10、防风阴性；11、麻黄阴性；12、知母阴性；13、白芍阴性；14、甘草阴性。

图3为桂枝芍药知母汤水层供试品溶液显色后365nm紫外灯下检视的薄层色谱图(鉴别防风)，其中，f、5-O-甲基维斯阿米醇苷；1、混合对照品溶液1(5-O-甲基维斯阿米醇苷、芹糖苷草苷、芍药苷、甘草苷)；2、防风对照药材；3、麻黄对照药材；4、知母对照药材；5、白芍对照药材；6、甘草对照药材；7、桂枝芍药知母汤水层供试品溶液样品1；8、桂枝芍药知母汤水层供试品溶液样品2；9、桂枝芍药知母汤水层供试品溶液样品3；10、防风阴性；11、麻黄阴性；12、知母阴性；13、白芍阴性；14、甘草阴性。

图4为桂枝芍药知母汤醚层供试品溶液显色前365nm下检视的薄层色谱图(鉴别桂枝)，其中，g、桂枝对照药材的主斑点；1、混合对照品溶液2(6-姜辣素、白术内酯III和白术内酯II)；2、桂枝对照药材；3、白术对照药材；4、桂枝芍药知母汤醚层供试品溶液样品1；5、桂枝芍药知母汤醚层供试品溶液样品2；6、桂枝芍药知母汤醚层供试品溶液样品3；7、桂枝阴性；8、白术阴性；9、生姜阴性。

图5为桂枝芍药知母汤醚层供试品溶液显色后日光灯下检视的薄层色谱图(鉴别生姜)，其中，h、6-姜辣素；1、混合对照品溶液2(6-姜辣素、白术内酯III和白术内酯II)；2、桂枝对照药材；3、白术对照药材；4、桂枝芍药知母汤醚层供试品溶液样品1；5、桂枝芍药知母汤醚层供试品溶液样品2；6、桂枝芍药知母汤醚层供试品溶液样品3；7、桂枝阴性；8、白术阴性；9、生姜阴性。

图6为桂枝芍药知母汤醚层供试品溶液显色后365nm紫外灯下检视的薄层色谱图(鉴别白术)，其中，i、白术内酯II；j、白术内酯III；1、混合对照品溶液2(6-姜辣素、白术内酯III和白术内酯II)；2、桂枝对照药材；3、白术对照药材；4、桂枝芍药知母汤醚层供试品溶液样品1；5、桂枝芍药知母汤醚层供试品溶液样品2；6、桂枝芍药知母汤醚层供试品溶液样品3；7、桂枝阴性；8、白术阴性；9、生姜阴性。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例中所用到的仪器信息：

电子天平，梅特勒-托利多，型号：XPR105DR，AL104-2；电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司，DHG-9245A；电热板：上海力辰邦西仪器科技有限公司，DB-XAB；自动点样仪：瑞士卡玛公司；自动成像仪：瑞士卡玛公司。

表1为本发明实施例中的对照品和对照药材信息。

表1：本发明实施例中的对照品和对照药材信息

实施例1、桂枝芍药知母汤煎液的制备

桂枝四两，芍药(本发明采用白芍)三两，甘草二两，麻黄二两，生姜五两，白术五两，知母四两，防风四两，附子二两(炮)。上九味，以水七升，煮取二升，即得。

实施例2、桂枝芍药知母汤颗粒的制备

桂枝四两，芍药(本发明采用白芍)三两，甘草二两，麻黄二两，生姜五两，白术五两，知母四两，防风四两，附子二两(炮)。上九味，以水七升，煮取二升，滤液浓缩，干燥制成颗粒，即得。

实施例3、桂枝芍药知母汤冻干粉的制备

桂枝四两，芍药(本发明采用白芍)三两，甘草二两，麻黄二两，生姜五两，白术五两，知母四两，防风四两，附子二两(炮)。上九味，以水七升，煮取二升，分装置西林瓶中，冻干，即得。

实施例4、桂枝芍药知母汤全方9药味中8个药味的薄层鉴别方法所述桂枝芍药知母汤全方9药味中8个药味的薄层鉴别方法，包括以下步骤：

S1供试品溶液的制备：取实施例1制备的桂枝芍药知母汤的煎液，相当于总饮片量5g，加水50mL，加热使溶解，放冷，转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取2次，每次50mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇2mL使溶解，得醚层供试品溶液；取桂枝芍药知母汤的煎液，相当于总饮片量5g，加水50mL，加热使溶解，放冷，通过大孔吸附树脂柱(大孔吸附树脂柱的内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用氨溶液(4→100，即取浓氨溶液4mL，加水至100mL)30mL洗脱，弃去氨液，再用水20mL洗脱，弃去水液，继续用体积分数为20％的乙醇水溶液50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，即得水层供试品溶液；

S2混合对照品溶液1的制备：取甘草苷对照品、芹糖甘草苷对照品、芍药苷对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品，用甲醇制成甘草苷、芹糖甘草苷、芍药苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷含量均为0.5mg/mL的混合对照品溶液1；

S3水层对照药材溶液的制备：取甘草对照药材0.5g、白芍对照药材0.5g、麻黄对照药材0.5g、防风对照药材1g、知母对照药材1g，分别加水50mL，加热回流提取1小时，趁热过滤，滤液通过大孔吸附树脂柱(大孔吸附树脂柱的内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用氨溶液(4→100，即取浓氨溶液4mL，加水至100mL)30mL洗脱，弃去氨液，再用水20mL洗脱，弃去水液，继续用体积分数为20％的乙醇水溶液50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，即得水层对照药材溶液，即甘草对照药材溶液、白芍对照药材溶液、麻黄对照药材溶液、防风对照药材溶液、知母对照药材溶液；

S4薄层色谱分析1：照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部(通则0502)试验，吸取步骤S1所得水层供试品溶液、步骤S3所得甘草对照药材溶液、白芍对照药材溶液、知母对照药材溶液、麻黄对照药材溶液和防风对照药材溶液、步骤S2所得混合对照品溶液1各20μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水体积比为15：3：1的溶液为展开剂，展开，晾干，显色前，置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与麻黄对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷磷钼酸硫酸溶液(磷钼酸2g，加水20mL使溶解，再缓缓加入硫酸30mL，混匀，即得)，在105℃加热至斑点显色清晰；置日光灯下检视，供试品色谱中，在与芹糖甘草苷对照品、芍药苷对照品、甘草苷对照品和甘草对照药材、白芍对照药材、知母对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与5-O-甲基维斯阿米醇苷和防风对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

S5混合对照品溶液2的制备：取6-姜辣素对照品、白术内酯III对照品、白术内酯II对照品，用甲醇制成6-姜辣素、白术内酯III、白术内酯II含量均为0.5mg/mL的混合对照品溶液2；

S6醚层对照药材溶液的制备：取白术对照药材1g、桂枝对照药材1g，分别加水50mL，加热回流提取1小时，趁热过滤，滤液转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取2次，每次50mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇2mL使溶解，即得醚层对照药材溶液，即白术对照药材溶液、桂枝对照药材溶液；

S7薄层色谱分析2：照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取步骤S1所得醚层供试品溶液、步骤S6所得白术对照药材溶液、桂枝对照药材溶液各20μL，步骤S5所得混合对照品溶液2 20μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环已烷-二氯甲烷-乙酯乙酯-甲酸的体积比为3：2：2：0.2的溶液为展开剂，展开，晾干，置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与桂枝对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；再喷以5％香草醛硫酸试液，置105℃烘至斑点显色，日光灯下检视，供试品色谱中，在与6-姜辣素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与白术内酯II对照品、白术内酯III对照品和白术对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

实施例5、桂枝芍药知母汤全方9药味中8个药味的薄层鉴别方法

所述桂枝芍药知母汤全方9药味中8个药味的薄层鉴别方法，包括以下步骤：

S1供试品溶液的制备：取实施例2制备的桂枝芍药知母汤的颗粒，相当于总饮片量10g，加水60mL，加热使溶解，放冷，转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取3次，每次50mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇3mL使溶解，得醚层供试品溶液；取桂枝芍药知母汤的颗粒，相当于总饮片量10g，加水60mL，加热使溶解，放冷，通过大孔吸附树脂柱(大孔吸附树脂柱的内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用氨溶液(4→100，即取浓氨溶液4mL，加水至100mL)35mL洗脱，弃去氨液，再用水25mL洗脱，弃去水液，继续用体积分数为60％的乙醇水溶液50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇3mL使溶解，即得水层供试品溶液；

S2混合对照品溶液1的制备：取甘草苷对照品、芹糖甘草苷对照品、芍药苷对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品，用甲醇制成甘草苷、芹糖甘草苷、芍药苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷含量均为0.8mg/mL的混合对照品溶液1；

S3水层对照药材溶液的制备：取甘草对照药材0.7g、白芍对照药材0.7g、麻黄对照药材0.7g、防风对照药材1.2g、知母对照药材1.2g，分别加水45mL，加热回流提取1.5小时，趁热过滤，滤液通过大孔吸附树脂柱(大孔吸附树脂柱的内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用氨溶液(4→100，即取浓氨溶液4mL，加水至100mL)35mL洗脱，弃去氨液，再用水25mL洗脱，弃去水液，继续用体积分数为45％的乙醇水溶液50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇3mL使溶解，即得水层对照药材溶液，即甘草对照药材溶液、白芍对照药材溶液、麻黄对照药材溶液、防风对照药材溶液、知母对照药材溶液；

S4薄层色谱分析1：照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取步骤S1所得水层供试品溶液、步骤S3所得甘草对照药材溶液、白芍对照药材溶液、知母对照药材溶液、麻黄对照药材溶液和防风对照药材溶液、步骤S2所得混合对照品溶液1各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水体积比为20：2：1的溶液为展开剂，展开，晾干，置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与麻黄对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷磷钼酸硫酸溶液(磷钼酸2g，加水20mL使溶解，再缓缓加入硫酸30mL，混匀，即得)，在105℃加热至斑点显色清晰；置日光灯下检视，供试品色谱中，在与芹糖甘草苷对照品、芍药苷对照品、甘草苷对照品和甘草对照药材、白芍对照药材、知母对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与5-O-甲基维斯阿米醇苷和防风对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

S5混合对照品溶液2的制备：取6-姜辣素对照品、白术内酯III对照品、白术内酯II对照品，用甲醇制成6-姜辣素、白术内酯III、白术内酯II含量均为0.8mg/mL的混合对照品溶液2；

S6醚层对照药材溶液的制备：取白术对照药材0.8g、桂枝对照药材0.8g，分别加水45mL，加热回流提取1.5小时，趁热过滤，滤液转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取3次，每次50mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇3mL使溶解，即得醚层对照药材溶液，即白术对照药材溶液、桂枝对照药材溶液；

S7薄层色谱分析2：照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取步骤S1所得醚层供试品溶液、步骤S6所得白术对照药材溶液、桂枝对照药材溶液各40μL，步骤S5所得混合对照品溶液2 20μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环已烷-二氯甲烷-乙酯乙酯-甲酸的体积比为4：1：1：0.1的溶液为展开剂，展开，晾干，置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与桂枝对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；再喷以5％香草醛硫酸试液，置105℃烘至斑点显色，日光灯下检视，供试品色谱中，在与6-姜辣素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与白术内酯II对照品、白术内酯III对照品和白术对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

实施例6、桂枝芍药知母汤全方9药味中8个药味的薄层鉴别方法

所述桂枝芍药知母汤全方9药味中8个药味的薄层鉴别方法，包括以下步骤：

S1供试品溶液的制备：取实施例3制备的桂枝芍药知母汤的冻干粉，相当于总饮片量10g，加水50mL，加热使溶解，放冷，转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取2次，每次50mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇2mL使溶解，得醚层供试品溶液；取桂枝芍药知母汤的冻干粉，相当于总饮片量10g，加水50mL，加热使溶解，放冷，通过大孔吸附树脂柱(大孔吸附树脂柱的内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用氨溶液(4→100，即取浓氨溶液4mL，加水至100mL)30mL洗脱，弃去氨液，再用水20mL洗脱，弃去水液，继续用体积分数为40％的乙醇水溶液50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，即得水层供试品溶液；

S2混合对照品溶液1的制备：取甘草苷对照品、芹糖甘草苷对照品、芍药苷对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品，用甲醇制成甘草苷、芹糖甘草苷、芍药苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷含量均为0.5mg/mL的混合对照品溶液1；

S3水层对照药材溶液的制备：取甘草对照药材0.5g、白芍对照药材0.5g、麻黄对照药材0.5g、防风对照药材1.0g、知母对照药材1.0g，分别加水40mL，加热回流提取1小时，趁热过滤，滤液通过大孔吸附树脂柱(大孔吸附树脂柱的内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用氨溶液(4→100，即取浓氨溶液4mL，加水至100mL)30mL洗脱，弃去氨液，再用水20mL洗脱，弃去水液，继续用体积分数为40％的乙醇水溶液50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，即得水层对照药材溶液，即甘草对照药材溶液、白芍对照药材溶液、麻黄对照药材溶液、防风对照药材溶液、知母对照药材溶液；

S4薄层色谱分析1：照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部(通则0502)试验，吸取步骤S1所得水层供试品溶液、步骤S3所得甘草对照药材溶液、白芍对照药材溶液、知母对照药材溶液、麻黄对照药材溶液和防风对照药材溶液、步骤S2所得混合对照品溶液1各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水体积比为20：2：1的溶液为展开剂，展开，晾干，显色前，置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与麻黄对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷磷钼酸硫酸溶液(磷钼酸2g，加水20mL使溶解，再缓缓加入硫酸30mL，混匀，即得)，在105℃加热至斑点显色清晰；置日光灯下检视，供试品色谱中，在与芹糖甘草苷对照品、芍药苷对照品、甘草苷对照品和甘草对照药材、白芍对照药材、知母对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与5-O-甲基维斯阿米醇苷和防风对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

S5混合对照品溶液2的制备：取6-姜辣素对照品、白术内酯III对照品、白术内酯II对照品，用甲醇制成6-姜辣素、白术内酯III、白术内酯II含量均为0.5mg/mL的混合对照品溶液2；

S6醚层对照药材溶液的制备：取白术对照药材0.5g、桂枝对照药材0.5g，分别加水40mL，加热回流提取1小时，趁热过滤，滤液转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取2次，每次50mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇2mL使溶解，即得醚层对照药材溶液，即白术对照药材溶液、桂枝对照药材溶液；

S7薄层色谱分析2：照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验，吸取步骤S1所得醚层供试品溶液、白术对照药材溶液、桂枝对照药材溶液各40μL，步骤S5所得混合对照品溶液2 20μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环已烷-二氯甲烷-乙酯乙酯-甲酸的体积比为4：1：1：0.1的溶液为展开剂，展开，晾干，置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与桂枝对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；再喷以5％香草醛硫酸试液，置105℃烘至斑点显色，日光灯下检视，供试品色谱中，在与6-姜辣素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与白术内酯II对照品、白术内酯III对照品和白术对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

试验例一、薄层鉴别试验

按照实施例3的方法制备三批桂枝芍药知母汤冻干粉样品(编号为1、2、3)，按照实施例6的方法制备供试品溶液(醚层供试品溶液、水层供试品溶液)、混合对照品溶液1、水层对照药材溶液(甘草对照药材溶液、白芍对照药材溶液、麻黄对照药材溶液、防风对照药材溶液、知母对照药材溶液)、混合对照品溶液2、醚层对照药材溶液(白术对照药材溶液、桂枝对照药材溶液)。制备防风阴性样品溶液、麻黄阴性样品溶液、知母阴性样品溶液、白芍阴性样品溶液、甘草阴性样品溶液、桂枝阴性样品溶液、白术阴性样品溶液、生姜阴性样品溶液。

照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验，吸取水层供试品溶液样品1、水层供试品溶液样品2、水层供试品溶液样品3、甘草对照药材溶液、白芍对照药材溶液、知母对照药材溶液、麻黄对照药材溶液和防风对照药材溶液、混合对照品溶液1、防风阴性样品溶液、麻黄阴性样品溶液、知母阴性样品溶液、白芍阴性样品溶液、甘草阴性样品溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水体积比为20：2：1的溶液为展开剂，展开，晾干，显色前，置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与麻黄对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。喷磷钼酸硫酸溶液(磷钼酸2g，加水20mL使溶解，再缓缓加入硫酸30mL，混匀，即得)，在105℃加热至斑点显色清晰；置日光灯下检视，供试品色谱中，在与芹糖甘草苷对照品、芍药苷对照品、甘草苷对照品和甘草对照药材、白芍对照药材、知母对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与5-O-甲基维斯阿米醇苷和防风对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验，吸取醚层供试品溶液样品1、醚层供试品溶液样品2、醚层供试品溶液样品3、白术对照药材溶液、桂枝对照药材溶液、桂枝阴性样品溶液、白术阴性样品溶液、生姜阴性样品溶液各40μL，混合对照品溶液220μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环已烷-二氯甲烷-乙酯乙酯-甲酸的体积比为4：1：1：0.1的溶液为展开剂，展开，晾干，置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与桂枝对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；再喷以5％香草醛硫酸试液，置105℃烘至斑点显色，日光灯下检视，供试品色谱中，在与6-姜辣素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；置于365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与白术内酯II对照品、白术内酯III对照品和白术对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

鉴别结果如图1-6所示。由图1可以看出：(1)桂枝芍药知母汤(条带7、8、9)3批样品的水层供试品溶液样品中，在与条带3麻黄对照药材显相同颜色的主斑点(a麻黄对照药材的主斑点)，条带11为麻黄阴性样，不显相应的主斑点，说明具有专属性。可鉴别麻黄。

由图2可以看出：(1)桂枝芍药知母汤(条带7、8、9)3批样品的水层供试品溶液样品中，在与条带1混合对照品溶液1中b甘草苷、d芹糖甘草苷和条带6中甘草对照药材显相同颜色的斑点，条带14为甘草阴性样，不显相应的斑点，说明具有专属性。可鉴别甘草。(2)桂枝芍药知母汤(条带7、8、9)3批样品的水层供试品溶液样品中，在与条带1混合对照品溶液1中c芍药苷和条带5白芍对照药材显相同颜色的斑点，条带13为白芍阴性样，不显相应的斑点，说明具有专属性。可鉴别白芍；(3)桂枝芍药知母汤(条带7、8、9)3批样品的水层供试品溶液样品中，在与条带4知母对照药材显相同颜色的主斑点(e知母对照药材的主斑点)，条带12为知母阴性样，不显相应的主斑点，说明具有专属性。可鉴别知母。

由图3可以看出：(1)桂枝芍药知母汤(条带7、8、9)3批样品的水层供试品溶液样品中，在与条带1混合对照品溶液1中f(5-O-甲基维斯阿米醇苷)和条带2中防风对照药材显相同颜色的主斑点，条带10为防风阴性样，不显相应的斑点，说明具有专属性。可鉴别防风。

由图4可以看出：桂枝芍药知母汤(条带4、5、6)3批样品的醚层供试品溶液样品中，在与条带2桂枝对照药材显相同颜色的主斑点(g桂枝对照药材的主斑点)，条带7为桂枝阴性样，不显相应的主斑点，说明具有专属性。可鉴别桂枝。

由图5可以看出：桂枝芍药知母汤(条带4、5、6)3批样品的醚层供试品溶液样品中，在与条带1混合对照品溶液2中的h(6-姜辣素)显相同颜色的主斑点，条带9为生姜阴性样，不显相应的主斑点，说明具有专属性。可鉴别生姜。

由图6可以看出：桂枝芍药知母汤(条带4、5、6)3批样品的醚层供试品溶液样品中，在与条带1混合对照品溶液2中的i(白术内酯II)、j(白术内酯III)和条带3白术对照药材中显相同颜色的主斑点，条带8为白术阴性样，不显相应的主斑点，说明具有专属性。可鉴别白术。

由以上结果可以看出，采用本发明的薄层鉴别方法能够对桂枝芍药知母汤全方9药味中的8个药味进行鉴别，薄层鉴别的专属性强，操作简便、快捷，检测效率高，降低了检测成本，为桂枝芍药知母汤的质量控制提供参考依据，意义重大。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。