一种高效诱导柑橘单胚性品种产生四倍体的方法

摘要

本发明公开了一种高效诱导柑橘单胚性品种产生四倍体的方法，属于柑橘生物育种技术领域。本发明的方法包括如下步骤：单胚性品种种子实生播种幼苗生长至高度5‑7cm时，用刀片在幼苗第一片真叶以下将其切断保留上胚轴长度2‑3cm；黑暗条件下诱导切口形成愈伤组织；愈伤组织形成后，用浓度为0.0125‑0.1％的秋水仙素溶液处理愈伤组织，光照条件下诱导愈伤组织再生成芽；当芽萌发长出2‑4片真叶时，流式细胞仪倍性鉴定结合柑橘单多胚特异分子标记筛选单胚性四倍体。本发明适用性广，利用愈伤组织单细胞再生的特性，获得的四倍体纯合、嵌合率低，且诱导效率高，方法简便易操作，无需组培，大大提高了柑橘单胚品种四倍体的获得效率。

说明书

技术领域

本发明属于柑橘生物育种技术领域，具体涉及一种高效诱导柑橘单胚性品种产生四倍体的方法。

背景技术

柑橘是我国南方最重要的果树，我国柑橘产业近年来迅猛发展，已成为我国南方主产区农村经济的一大支柱产业。无核柑橘因其食用方便、品质优良而备受人们青睐，因此，无核是柑橘重要的育种目标。三倍体由于减数分裂异常，雌、雄配子均不育，是天然的无核类型，培育三倍体是获得柑橘无核种质的重要途径，具有重要育种应用价值。三倍体在柑橘中的自然发生频率低，获得三倍体最有效的育种途径是四倍体与二倍体倍性杂交。其中，以二倍体为母本与四倍体为父本倍性杂交最为常用，但该方法由于杂交时胚乳败育不易获得三倍体种子，需要采用胚挽救技术才能获得杂种苗，费时费力。以单胚四倍体为母本与二倍体倍性杂交，种子发育正常，可省去胚抢救过程，大大提高育种效率。但目前柑橘现有的四倍体资源大多为多胚性，单胚性资源严重缺乏。以多胚四倍体为母本与二倍体倍性杂交，由于母本珠心胚会与有性胚竞争营养空间，会导致三倍体有性胚后期发育不良，同样需要胚挽救来提高三倍体获得率，育种效率低。因此，单胚性四倍体种质创制是突破限制柑橘三倍体育种效率提升这一瓶颈的必要条件，势在必行。

柑橘中，目前获得单胚性四倍体应用最多的方法就是利用秋水仙素诱导。传统方法一般选用种子、成年态的嫩梢或嫰芽为材料进行诱导，普遍存在诱导效率低、成芽困难和嵌合体比率高等问题，难以大规模推广利用。

发明内容

针对现有技术诱导柑橘品种产生四倍体存在诱导效率低、成芽困难和嵌合体比例高等缺陷，本发明的目的在于提供一种高效诱导柑橘单胚性品种产生四倍体的方法：即单胚性品种种子实生播种幼苗生长至高度5-7cm，用刀片在幼苗第一片真叶以下将其切断，保留上胚轴长度2-3cm；黑暗条件下诱导切口形成愈伤组织；愈伤组织形成后，用质量分数比为0.0125％-0.1％的秋水仙素溶液处理愈伤组织，光照条件下诱导愈伤组织再生成芽；当芽萌发长出2-4片真叶时，流式细胞仪倍性鉴定结合柑橘单多胚特异分子标记筛选单胚性四倍体。该方法利用愈伤组织单细胞再生的特性，获得的四倍体纯合、嵌合率低，且诱导效率高，方法简便易操作，无需组培，大大提高了柑橘单胚品种四倍体的获得效率。

为达到上述目的，本发明具体的技术方案如下：

一种高效诱导柑橘单胚性品种产生四倍体的方法，包括以下步骤：

(1)将种子从柑橘单胚性品种成熟果实取出，去除果胶后，剥去外种皮；培养箱中催芽，种子胚根萌发后移栽至营养钵培养。

(2)柑橘实生幼苗生长到高度5-7cm，用刀片在幼苗第一片真叶以下将其切断，同时去除侧芽，保留上胚轴长度2-3cm，切口保持湿润，避光条件下促进愈伤组织形成。其中，切口保持湿润优选通过将吸头倒扣于切口上实现。

(3)切口愈伤组织形成后，用秋水仙素溶液浸泡处理，用保鲜膜包裹营养钵顶部保持切口湿润，置于光照条件下促进愈伤组织生芽。

(4)愈伤组织再生出芽后待其萌发长出2-4片真叶时，筛选单胚性四倍体。

进一步地，所述的高效诱导柑橘单胚性品种产生四倍体的方法，包括以下步骤：

(1)柑橘单胚性品种果实成熟后采果剥取种子，用NaOH溶液浸泡去除果胶；清水洗净后，剥去外种皮并将其置于铺有湿滤纸的培养皿，置于培养箱催芽；待种子胚根萌发后，将其播种于营养钵并置于生长室培养，用保鲜膜包裹营养钵顶部保湿。

其中，去除果胶的条件优选为：用1mol/L NaOH溶液浸泡10min。培养箱催芽的温度优选为28℃。所述的营养钵优选为20cm×20cm的营养钵。生长室培养的条件优选为：温度25±1℃；光照16h，黑暗8h。

(2)播种后10-15d，当实生幼苗长至高度5-7cm。用刀片在幼苗地上部2-3cm处(不保留叶片)将其切断，并用吸头倒扣于切口进行保湿；用黑布包裹营养钵顶部避光，促进愈伤组织形成。

(3)6-12d后，切口处便会形成愈伤组织，用秋水仙素水溶液浸泡愈伤组织，用保鲜膜包裹营养钵顶部保湿，并置于光照条件下促进愈伤组织生芽。其中，用秋水仙素水溶液浸泡愈伤组织优选通过将装满秋水仙素水溶液的吸头倒扣于切口的愈伤组织实现。

(4)10-20d，切口处便能再生出大量芽，待芽萌发长出2-4片真叶时，筛选单胚性四倍体。

上述方法中，所述的秋水仙素水溶液优选含秋水仙素0.0125％-0.1％(质量分数比)、二甲亚砜1-2％(体积分数比)。秋水仙素水溶液浸泡愈伤组织的时间优选为1-2h。

上述方法中，筛选单胚性四倍体的方法优选为：根据多倍体叶片形态特征初筛，并用流式细胞仪对疑似多倍体再生芽进行倍性鉴定，再用柑橘特异单多胚分子标记对明确倍性的四倍体进行单多胚标记鉴定。

本发明四倍体诱导率高、嵌合率低，为柑橘多倍体育种提供了高效的新方法及新种质。与现有技术相比，本发明具有如下有益的效果：

(1)本发明以柑橘上胚轴再生的愈伤组织为材料进行秋水仙素处理，相较于直接利用秋水仙素处理成年态芽，愈伤组织分化能力更强，再生效率更高；利用愈伤组织单细胞的特性，诱导形成的四倍体更纯合，嵌合体发生率低；由于愈伤组织相较于成年态芽更幼嫩，需要低浓度的秋水仙素处理即可，秋水仙素对材料的毒害作用小，诱导效率更高。

(2)本发明利用柑橘实生苗上胚轴再生的愈伤组织诱导柑橘多倍体，可以先进行人工授粉选配合适的亲本，再对后代实生苗上胚轴再生的愈伤组织进行秋水仙素诱导加倍，结合单多胚分子标记鉴定筛选单胚性四倍体，创制具有优良性状的柑橘单胚性品种四倍体新种质。

(3)本发明全程不需要进行组织培养的无菌操作，方法简便、易于操作，从利用秋水仙素溶液处理到获得多倍体仅需35-45天，育种效率高。

(4)本发明适用性广，目前利用本发明共获得了13个柑橘单胚品种四倍体。其中包括枸橼、柚、宽皮橘、甜橙、柠檬等栽培柑橘类型。

附图说明

图1为本发明的流程；a：成熟单胚品种果实；b：种子催芽；c：幼苗横切前状态；d：幼苗横切后状态；e：黑布避光诱导愈伤组织；f：白吸头盛装秋水仙素溶液诱导切口愈伤组织；g：保鲜膜包裹保湿；h：愈伤组织再生芽；i：流式细胞仪倍性鉴定；j：诱导产生四倍体与二倍体形态比较。

图2为实施例1柑橘单胚性品种秋辉橘通过本发明诱导过程中，黑暗诱导上胚轴再生愈伤组织(a：第0d切口愈伤组织状态；b：第9d切口愈伤组织状态)，与秋水仙素处理后愈伤组织再生芽(c)；

图3为实施例1柑橘单胚性品种秋辉橘通过本发明诱导产生的四倍体植株与二倍体植株的形态差异(左)以及秋辉橘不同倍性叶片形态差异(右)；

图4为实施例1柑橘单胚性品种秋辉橘通过本发明诱导产生的四倍体，经过流式细胞仪倍性鉴定(a：二倍体；b：四倍体)和根尖染色体压片(c：二倍体；d：四倍体)；

图5为实施例1柑橘单胚性品种秋辉橘通过本发明诱导产生的四倍体，单多胚分子标记鉴定；

图6为实施例2柑橘单胚性品种HB柚通过本发明诱导产生的四倍体植株与二倍体植株的形态差异；

图7为实施例3柑橘单胚性品种枸橼通过秋水仙素诱导产生的四倍体植株与二倍体植株的形态差异；

图8为实施例4单胚性品种琥珀甜橙通过秋水仙素诱导产生的四倍体植株与二倍体植株的形态差异；

图9为实施例14单胚性品种HB柚三种不同发育时期春梢(a：非木质化春梢；b：半木质化春梢；c：木质化春梢)，距离枝条顶端5-10cm处横切诱导愈伤组织，秋水仙素诱导后状态(d：非木质化春梢黑暗条件下形成愈伤组织状态；e：半木质化春梢黑暗条件下形成愈伤组织状态；f：木质化春梢黑暗条件下形成愈伤组织状态；g：非木质化春梢秋水仙素诱导后，光照条件下愈伤组织状态；h：半木质化春梢秋水仙素诱导后，光照条件下愈伤组织状态；i：木质化春梢秋水仙素诱导后，光照条件下愈伤组织状态)。

具体实施方式

为了将本发明的目的、技术方案及优点清楚、完整地描述，以下结合附图及实施例，对本发明细节进行进一步详细说明。所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例涉及柑橘单胚性品种秋辉橘四倍体新种质创制，柑橘单胚性品种秋辉橘成熟种子采自华中农业大学柑橘种质资源圃。具体包括如下步骤：

(1)秋辉橘果实成熟后采果剥取种子，用1mol/L NaOH溶液浸泡10min去除果胶，清水洗净后，剥去外种皮，并将其置于铺有湿滤纸的培养皿，置于28℃培养箱催芽，待种子胚根萌发后，将其播种于20cm×20cm营养钵并置于生长室培养(生长室条件：温度25±1℃；光照16h，黑暗8h)，一盆播种40-50粒种子。用保鲜膜包裹营养钵顶部，保持营养钵中的土壤湿润。

(2)当实生幼苗长至高度5cm左右(播种后15d)。用刀片在幼苗地上部2-3cm处(不保留叶片)将其切断，并用吸头(实验室移液器常使用的白吸头，容积20μL)倒扣在切口进行保湿；用黑布包裹营养钵顶部避光，促进愈伤组织形成。愈伤组织形成过程中保持生长室温度为：温度25±1℃，全程黑暗避光。

(3)9d后，切口处便会形成愈伤组织；用注射器吸取提前配好的秋水仙素水溶液(秋水仙素质量分数比为0.05％，按照体积比加入1％二甲亚砜)加入白吸头中；将装满秋水仙素溶液的白吸头倒扣在切口的愈伤组织(为防止液体下漏，吸头尖端用火焰炙烤封闭)，使秋水仙素溶液浸泡愈伤组织2h；之后取下吸头，用保鲜膜包裹营养钵顶部保湿，并置于温度25±1℃、光照16h、黑暗8h条件下促进愈伤组织生芽。

(4)10-20d左右，切口处便能再生出大量芽；待芽萌发长出2-4片真叶时，根据多倍体叶片形态特征(叶片变厚、宽，颜色变深，油胞大、密度底等特点)筛选疑似多倍体，并用流式细胞仪对疑似多倍体进行倍性鉴定；用柑橘特异单多胚分子标记引物(P/M-F，P/M-R)对明确倍性的四倍体进行单多胚的标记鉴定，筛选单胚性四倍体。同时取诱导产生的四倍体枝条，扦插生根，取根尖进行染色体压片进行染色体计数统计。诱导产生秋辉橘四倍体植株与二倍体植株形态差异图以及秋辉橘不同倍性叶片形态差异如图3所示。流式细胞仪倍性鉴定和根尖染色体压片如图4所示。

(5)诱导产生的四倍体利用引物P/M-F：TCTCTGGTTCATTGAGAATCC和P/M-R：CTGAGCACCAGGCAACAACTAC进行单多胚分子标记鉴定。

对其中70株诱导产生的秋辉橘四倍体进行单多胚分子鉴定，发现仅有31株系，存在两条带为多胚，其余均为单胚。单多胚分子标记鉴定结果如图5所示。

实施例2

方法同实施例1，柑橘单胚性品种HB柚种子采自华中农业大学柑橘种质资源圃，诱导产生的四倍体植株与二倍体植株的形态差异见图6。

实施例3

方法同实施例1，柑橘单胚性品种枸橼种子采自云南德宏，诱导产生的四倍体植株与二倍体植株的形态差异见图7。

实施例4

方法同实施例1，柑橘单胚性品种琥珀甜橙种子采自华中农业大学柑橘种质资源圃，诱导产生的四倍体植株与二倍体植株的形态差异见图8。

实施例5-13

方法同实施例1，品种为华农红柚、雷公柚、菊花芯柚、高斑柚、黄陵庙橘、沙田柚、清见x椪柑、克里曼丁橘x椪柑、香水柠檬。

实施例1-13诱导不同柑橘单胚性品种产生四倍体诱导率与嵌合体发生率见下表1。

表1不同单胚性品种四倍体诱导率与嵌合体发生率比较

实施例14

方法同实施例1，区别在于选取柑橘单胚性品种HB柚，非木质化春梢、半木质化春梢、木质化春梢，距离枝条顶端5-10cm处横切为秋水仙素诱导部位。结果显示三种不同发育时期枝条在黑暗下均能形成愈伤组织，但秋水仙素诱导后，光照条件下愈伤组织都不能再生成芽。实施例2中HB柚上胚轴形成的愈伤组织在秋水仙素诱导后能够正常再生成芽并获得了四倍体植株，表明柑橘上胚轴因其再生能力强为秋水仙素诱导多倍体的最佳部位。三种不同发育时期春梢诱导结果见图9。

以上实施例旨在方便本领域技术人员理解，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，凡在本发明的精神实质和原理之内所作的任何修改、等同替换、组合、改进等，都包含在本发明的保护范围之内。