一种宜鲜食耐贮存Ⅱ型红肉苹果的育种方法

摘要

本发明涉及红肉苹果培育技术领域，提出了一种宜鲜食耐贮存Ⅱ型红肉苹果的育种方法，包括以下步骤：步骤S1、亲本选择；步骤S2、杂交授粉；步骤S3、采果取种；步骤S4、播种育苗；步骤S5、SSR分子标记筛选合格幼苗；步骤S6、高接；步骤S7、筛选优系；步骤S8、扩繁。通过上述技术方案，解决了相关技术中红肉苹果口感差和Ⅱ型红肉苹果表型在童期不易鉴定的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及红肉苹果培育技术领域，具体的，涉及一种宜鲜食耐贮存Ⅱ型红肉苹果的育种方法。

背景技术

红肉苹果以鲜艳的颜色，富含花青素、多酚物质、三萜类及Ca等功能成分而越来越受到人们的关注，分为I型红肉苹果和II型红肉苹果两类。I型红肉苹果，嫩枝、嫩叶、花朵、果皮和果肉均为红色、花青素含量高，但果个较小、酸含量较高、肉质风味较差，经冷藏处理后，内部果肉容易发生褐变，伴有涩味出现，不宜鲜食。II型红肉苹果果个较大、酸含量低、肉质风味较好、果肉不易褐变、亦无涩味产生。

研究发现，所有的苹果均含有调控植物自交不亲和的S基因，位于17号染色体上，二倍体苹果S基因型由两个性状表达不同的S

II型红肉苹果含有独有的MdMYB110a基因，MdMYB110a基因也位于17号染色体上，在II型红肉苹果‘pink pearl’中与S3基因连锁。一些常见的II型红肉苹果通常是‘pinkpearl’的后代，因此，对于一些常见的II型红肉苹果，它通常含有S3基因。Ⅱ型红肉苹果及其后代在童期跟普通的苹果没有颜色上的区别，导致果农无法及时判断，从而会错过Ⅱ型红肉苹果的一些关键的培育时间节点。

此外，苹果中还含有MdACS1基因，MdACS1基因调控果实采收后、贮藏过程中乙烯的合成，MdACS1有两个等位基因，分别为MdACS1-1和MdACS1-2，纯合型MdACS1-2最耐贮，杂合型MdACS1-2较耐贮，纯合型MdACS1-1不耐贮。因此，在苹果新品种的培育过程中，通常会筛选出含有纯合型MdACS1-2或者杂合型MdACS1-2基因的后代，后代进行大量的扩繁。

尽管，红肉苹果有诸多优点，但是由于其口感不佳，因此与普通的苹果相比，人们更倾向于选择普通苹果，因此，需要对II型红肉苹果进行改良，以得到酸甜适口的红肉苹果。

发明内容

本发明提出一种宜鲜食耐贮存Ⅱ型红肉苹果的育种方法，解决了相关技术中红肉苹果口感差和Ⅱ型红肉苹果表型在童期不易鉴定的问题。

本发明的技术方案如下：一种宜鲜食耐贮存Ⅱ型红肉苹果的育种方法，包括以下步骤：

步骤S1、亲本选择：选Ⅱ型红肉苹果为亲本一，选普通苹果为亲本二；亲本一的耐贮存基因为纯合型MdACS1-2，亲本二的可滴定酸含量在0.2％-0.5％之间，可溶性固形物含量在14％-18％之间，亲本一的S基因型和亲本二的S基因型不能完全相同；

步骤S2、杂交授粉：采集铃铛花或初开花，剥出花药均匀摊在纸上，置于20-30℃的灯光下烤12h，待花粉完全散出后选择无损的大蕾期花进行授粉，点授中心花，除去其余花朵，对完成授粉的花朵套袋并挂牌；

步骤S3、采果取种：待杂交果成熟后，采摘果实并取出种子、晾干保存；冬季对种子进行沙藏处理；

步骤S4、播种育苗：对沙藏处理后的种子进行催芽，白色芽体刚刚露出后，芽体朝下播种，敷土并浇水；

步骤S5、SSR分子标记筛选合格幼苗：以已知为Ⅱ型红肉和非Ⅱ型红肉品种的基因组DNA为模板，采用PCR技术筛选出与MdMYB110a位于同一条染色体的第一上游引物和第一下游引物，参考已知MdACS1引物作为第二上游引物和第二下游引物，并分别计算第一上游引物和第一下游引物的第一目标长度以及第二上游引物和第二下游引物的第二目标长度；待杂交苗长出7-8片叶子后，提取新鲜嫩叶的DNA，利用锚定引物进行PCR扩增，跑琼脂糖凝胶电泳，并根据最终得到的目标条带的长度确定是否为合格幼苗；

步骤S6、高接：对步骤S5中筛选出的合格幼苗进行促长，选择120个节位以上的高位饱满芽高接于6年以上的大树上，高接成活后，刻芽、拉枝、促花促果；

步骤S7、筛选优系：果实成熟后，观察果肉颜色和果实耐贮性，测定可溶性固形物、可滴定酸和果肉花青素含量；其中，果肉为红色，果肉花青素含量≥2mg/100gFW，可滴定酸含量应在0.5％-0.6％之间，可溶性固形物含量应≥15％，果实耐贮基因应为纯合型MdACS1-2或杂合型MdACS1-2；

步骤S8、扩繁：待步骤S7中各参数满足要求时，重复步骤S6至S7进行扩繁，获得大量宜鲜食耐贮存的红肉苹果苗木。

作为进一步的技术方案，所述步骤1中，所述亲本一的S基因型与所述亲本二的S基因型完全不同时，所述亲本一作父本、母本均可。

作为进一步的技术方案，所述步骤1中，所述亲本一的S基因型中非S3基因与所述亲本二的S基因型之一相同时，所述亲本一作父本。

作为进一步的技术方案，所述步骤1中，所述亲本一的S基因型中非S3基因与所述亲本二的S基因型之一相同时，所述亲本一作母本。

作为进一步的技术方案，所述步骤1中，所述亲本一和所述亲本二的S基因型均含有S3基因时，所述亲本一作母本。

作为进一步的技术方案，所述第一上游引物的基因序列为ACCCGGAGTCATCCCTGTCTTA，所述第一下游引物的基因序列为CAAACTGGGCTTTCCGTTAGGT，所述第一目标长度为393bp。

作为进一步的技术方案，所述第二上游引物的基因序列为AGAGAGATGCCATTTTTGTTCGTAC，所述第二下游引物的基因序列为CCTACAAACTTGCGTGGGGATTATAAGTGT，所述第二目标长度为655bp。

作为进一步的技术方案，所述步骤S4中，催芽需要的温度为20-25℃，需要的时间为12-24h。

作为进一步的技术方案，所述步骤S4中，敷土厚度为1-2cm。

本发明的有益效果为：

1、通过亲本的选择、授粉、取种和育苗，可以获得大量的杂交幼苗，再借助SSR分子标记技术，在童期确定这些幼苗含有MdMYB110a基因和MdACS1-2基因，再将这些幼苗扩繁，降低人工和试验用地成本投入，加速宜鲜食且耐贮存的Ⅱ型红肉苹果育种进程；

2、对普通苹果和红肉苹果作为父母本进行了不同的选配，并且还根据基因型排除了完全不能进行杂交授粉的父母本的组合，分析了不同的父母本的组合形式得到的目标幼苗的概率，有助于提高Ⅱ型红肉苹果的产量；

3、针对MdMYB110a基因设计出合适的第一上游引物和第一下游引物，利用SSR分子标记技术对杂交幼苗进行筛选，第一上游引物和第一下游引物形成的第一目标条带与MdMYB110a基因的遗传距离较小，更容易保持连锁稳定性，提高了检测的准确率，进而提高了合格幼苗的数量。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为本发明提供的方法的工艺流程图；

图2为本发明提供的第一上游引物和第一下游引物PCR扩增结果电泳图；

图3为本发明提供的第二上游引物和第二下游引物PCR扩增结果电泳图；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。

如图1所示，本实施例提出了一种宜鲜食耐贮存Ⅱ型红肉苹果的育种方法，包括以下步骤：

步骤S1、亲本选择：选Ⅱ型红肉苹果为亲本一，选普通苹果为亲本二；亲本一的耐贮存基因为纯合型MdACS1-2，亲本二的可滴定酸含量在0.2％-0.5％之间，可溶性固形物含量在14％-18％之间，亲本一的S基因型和亲本二的S基因型不能完全相同；

步骤S2、杂交授粉：采集铃铛花或初开花，剥出花药均匀摊在纸上，置于20-30℃的灯光下烤12h，待花粉完全散出后选择无损的大蕾期花进行授粉，点授中心花，除去其余花朵，对完成授粉的花朵套袋并挂牌；

步骤S3、采果取种：待杂交果成熟后，采摘果实并取出种子、晾干保存；冬季对种子进行沙藏处理；

步骤S4、播种育苗：对沙藏处理后的种子进行催芽，白色芽体刚刚露出后，芽体朝下播种，敷土并浇水；

步骤S5、SSR分子标记筛选合格幼苗：以已知为Ⅱ型红肉和非Ⅱ型红肉品种的基因组DNA为模板，采用PCR技术筛选出与MdMYB110a位于同一条染色体的第一上游引物和第一下游引物，参考已知MdACS1引物作为第二上游引物和第二下游引物，并分别计算第一上游引物和第一下游引物的第一目标长度以及第二上游引物和第二下游引物的第二目标长度；待杂交苗长出7-8片叶子后，提取新鲜嫩叶的DNA，利用锚定引物进行PCR扩增，跑琼脂糖凝胶电泳，并根据最终得到的目标条带的长度确定是否为合格幼苗；

步骤S6、高接：对步骤S5中筛选出的合格幼苗进行促长，选择120个节位以上的高位饱满芽高接于6年以上的大树上，高接成活后，刻芽、拉枝、促花促果；

步骤S7、筛选优系：果实成熟后，观察果肉颜色和果实耐贮性，测定可溶性固形物、可滴定酸和果肉花青素含量；其中，果肉为红色，果肉花青素含量≥2mg/100gFW，可滴定酸含量应在0.5％-0.6％之间，可溶性固形物含量应≥15％，果实耐贮基因应为纯合型MdACS1-2或杂合型MdACS1-2；

步骤S8、扩繁：待步骤S7中各参数满足要求时，重复步骤S6至S7进行扩繁，获得大量宜鲜食耐贮存的红肉苹果苗木。

本发明的有益效果为：

1、通过亲本的选择、授粉、取种和育苗，可以获得大量的杂交幼苗，再借助SSR分子标记技术，在童期确定这些幼苗含有MdMYB110a基因和MdACS1-2基因，再将这些幼苗扩繁，降低人工和试验用地成本投入，加速宜鲜食且耐贮存的Ⅱ型红肉苹果育种进程；

2、对普通苹果和红肉苹果作为父母本进行了不同的选配，并且还根据基因型排除了完全不能进行杂交授粉的父母本的组合，分析了不同的父母本的组合形式得到的目标幼苗的概率，有助于提高Ⅱ型红肉苹果的产量；

3、针对MdMYB110a基因设计出合适的第一上游引物和第一下游引物，利用SSR分子标记技术对杂交幼苗进行筛选，第一上游引物和第一下游引物形成的第一目标条带与MdMYB110a基因的遗传距离较小，更容易保持连锁稳定性，提高了检测的准确率，进而提高了合格幼苗的数量。

本发明中亲本一选择的Ⅱ型红肉苹果的品种为：Irodori、Nakanonokirameki、Moon Rouge、Enbu、Nakanoshinku。以上五个品种的Ⅱ型红肉苹果都来自于日本。

在图2中，最左列为DNA分子量标准Marker，最右列为已知为Ⅱ型红肉的阳性对照，中间为待检测幼苗。参考Marker 400bp标准条带和阳性对照393bp目标条带，辨别待检测幼苗是否含有目标条带，是否为Ⅱ型红肉苹果。

在图3中，最左列为DNA分子量标准Marker，后边为待检测幼苗。MdACS1-2的目标条带为655bp，MdACS1-1的目的条带为489bp，参考Marker 500bp和750bp标准条带，辨别待检测幼苗是纯合型MdACS1-2还是杂合型MdACS1-2。

进一步，所述步骤1中，所述亲本一的S基因型与所述亲本二的S基因型完全不同时，所述亲本一作父本、母本均可。

本实施例中，由于亲本一和亲本二的S基因型完全不同，因此，可以将亲本一的S基因型选择为S1S3，亲本二的S基因型选择为S2S4，此时不管亲本一作为父本还是母本，都会有50％的后代为目标幼苗。

进一步，所述步骤1中，所述亲本一的S基因型中非S3基因与所述亲本二的S基因型之一相同时，所述亲本一作父本。

本实施例中，由于亲本一的S基因型中非S3基因与亲本二的S基因型之一相同，因此，可以将亲本一的S基因型选择为S1S3，亲本二的S基因型选择为S1S2，此时当亲本一作为父本时，会有50％的后代为目标幼苗。

进一步，所述步骤1中，所述亲本一的S基因型中非S3基因与所述亲本二的S基因型之一相同时，所述亲本一作母本。

本实施例中，由于亲本一的S基因型中非S3基因与亲本二的S基因型之一相同，因此，可以将亲本一的S基因型选择为S1S3，亲本二的S基因型选择为S1S2，此时当亲本一作为母本时，会有25％的后代为目标幼苗。

进一步，所述步骤1中，所述亲本一和所述亲本二的S基因型均含有S3基因时，所述亲本一作母本。

本实施例中，由于亲本一和亲本二的S基因型均含有S3基因，并且亲本一和亲本二的基因型不完全相同，因此，可以将亲本一的S基因型选择为S1S3，亲本二的S基因型选择为S2S3，此时当亲本一作为母本时，会有25％的后代为目标幼苗。

根据孟德尔遗传定律和S基因自交不亲和规律可知，当亲本一和亲本二的S基因型完全相同时，后代中不会出现目标幼苗。并且在亲本一和亲本二的S基因型均含有S3基因的前提下，当将亲本一选择为父本时，后代中也不会出现目标幼苗。虽然MdMYB110a基因与S3基因连锁，但是由于MdMYB110a基因是红肉苹果特有的基因，因此即使普通苹果含有S3基因，但是它不含有MdMYB110a基因，因此在前述的情况下，亲本一作为父本时，后代中不会产生红肉苹果。

进一步，所述第一上游引物的基因序列为ACCCGGAGTCATCCCTGTCTTA，所述第一下游引物的基因序列为CAAACTGGGCTTTCCGTTAGGT，所述第一目标长度为393bp。

本实施例中，针对红肉苹果的MdMYB110a基因，将第一上游引物的基因序列定为ACCCGGAGTCATCCCTGTCTTA，第一下游引物的基因序列定为CAAACTGGGCTTTCCGTTAGGT，可以得到第一目标长度为393bp，第一目标条带与MdMYB110a基因的遗传距离较小，稳定连锁、染色体分离时，重组率低，SSR分子标记时，可以提高对MdMYB110a基因的识别率。

进一步，所述第二上游引物的基因序列为AGAGAGATGCCATTTTTGTTCGTAC，所述第二下游引物的基因序列为CCTACAAACTTGCGTGGGGATTATAAGTGT，所述第二目标长度为655bp。

本实施例中，针对MdACS1基因，将第二上游引物的基因序列定为AGAGAGATGCCATTTTTGTTCGTAC，第二下游引物的基因序列定为CCTACAAACTTGCGTGGGGATTATAAGTGT，第二目标长度为655bp，这对引物的序列都是现有的，可以在保证PCR技术准确识别的前提下，降低Ⅱ型红肉苹果的培育成本。

进一步，所述步骤S4中，催芽需要的温度为20-25℃，需要的时间为12-24h。

进一步，所述步骤S4中，敷土厚度为1-2cm。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。