一种细粒棘球绦虫重组蛋白EgG1Y162-2（4）及其应用

摘要

本发明公开了一种细粒棘球绦虫重组蛋白，其通过将4条EgG1Y162‑2蛋白片段通过linker序列“GSGGSG”串联，组成重组蛋白；实验表明，该重组蛋白疫苗可以促进树突状细胞的成熟。本发明首次公开了重组疫苗EgG1Y162‑2(4)的作用原理及效果，为制备防治人或畜的包虫病疫苗或诊断试剂盒的奠定基础。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体来说涉及一种细粒棘球绦虫重组蛋白EgG1Y162-2(4)及其应用。

背景技术

棘球蚴病是棘球绦虫处于中绦期的幼虫寄生于人体及某些动物的脏器而引起的一种严重的人畜共患寄生虫病。一般患者于感染初期不容易察觉因而错过最佳手术时间，因而大多数患者主要是通过药物治疗。抗寄生虫药物如阿苯达唑、苯丙咪唑等药物被广泛应用于治疗包虫病。这些药物虽能够起到一定的作用，但其需要长期服用且所需剂量较高造成的副作用较多。因而探寻新的治疗方法是防治包虫病较为理想的措施，大量研究表明包虫病疫苗的制备可作为免疫预防的有效方式。

本发明小组曹春宝等从细粒棘球蚴中克隆了EgG1Y162抗原基因，EgG1Y162与EmY162在氨基酸序列上高度相近。通过预测结果分析，EgG1Y162与EmY162编码的蛋白具有共同的结构特征，很可能是终末宿主的保护性抗原，有望成为细粒棘球绦虫的保护性候选疫苗(见专利CN101475938A)。Zhang等对EgG1Y162蛋白的抗原表位进行分析，EgG1Y162-2和EgG1Y162-1均是EgG1Y162蛋白中抗原表位较多的片段。将软件预测的结果进行多重比较，EgG1Y162-2的免疫原性相关指标要优于EgG1Y162-1。故研究者认为EgG1Y162-2是更理想的疫苗研究目标，但存在的问题是：EgG1Y162-2蛋白分子量只有15kDa，作为单一的小分子蛋白为不完全抗原或半抗原，不具有免疫原性。在本发明小组之前的研究中，EgG1Y162-2免疫原性的表达依赖其融合表达GST(26kDa)此类分子量较大的标签载体，但GST在体内会刺激机体产生免疫应答，产生抗GST抗体。后期将融合表达的GST标签换成His标签时，发现分子量较小的单体EgG1Y162-2失去了免疫原性。因此如何通过选择合适的linker序列将EgG1Y162-2进行适当的串联，在保证表位不偏移的情况下，通过提高重组多表位疫苗的分子量，进而增强免疫原性及其免疫效果是亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细粒棘球绦虫重组蛋白EgG1Y162-2(4)及其编码基因。

本发明的另一个目的在于提供上述重组蛋白及其编码基因在制备防治人或畜包虫病的疫苗或诊断试剂中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种细粒棘球绦虫重组蛋白，其通过将至少4条EgG1Y162-2蛋白片段通过linker序列“GSGGSG”串联，组成重组蛋白；

作为上述蛋白的一种优选，当串联蛋白的数量为4时，形成一种细粒棘球绦虫重组蛋白EgG1Y162-2(4)；

所述重组蛋白EgG1Y162-2(4)的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

所述重组蛋白EgG1Y162-2(4)的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

采用上述重组蛋白EgG1Y162-2(4)进行促进树突状细胞(DC)成熟的实验，实验表明：

在抗原刺激了24h后，利用流式细胞术分别检测CD45阳性的免疫细胞中DCs的表面标志物CD11c及mDCs的表面标志物MHC-II类分子与CD86的表达情况。结果显示经HIS-EgG1Y162抗原刺激24h后，在CD45+的免疫细胞中，CD11c+CD86+,CD11c+MHCII+表型的免疫细胞的百分比分别为(54.8±0.73)％与(33.3±0.25)％；而经HIS-EgG1Y162-2(4)抗原刺激24h后，在CD45+的免疫细胞中，CD11c+CD86+,CD11c+MHCII+表型的免疫细胞的百分比分别为(67.6±0.90)％与(35.6±0.42)％，成熟DC的百分率明显增高。

基于此，本发明提供了所述重组蛋白或其编码序列在制备预防细粒棘球绦虫的疫苗中的应用。

同时，根据应用和本发明具体试验结果，还提供了一种预防细粒棘球绦虫的疫苗，包括本发明所述重组蛋白和免疫佐剂。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、本发明选用Linker序列“GSGGSG”串联EgG1Y162-2设计重组蛋白EgG1Y162-2(4)，通过基因工程技术构建原核表达质粒Pet30a-EgG1Y162-2(4)，利用IPTG诱导HIS-EgG1Y162-2(4)蛋白表达，对该蛋白进行诱导表达条件及纯化条件的探索。

2、实验表明，重组蛋白疫苗可以促进树突状细胞的成熟。

3、本发明首次公开了重组疫苗EgG1Y162-2(4)的作用原理及效果，为制备防治人或畜的包虫病疫苗或诊断试剂盒的奠定基础。

4、“GSGGSG”是理想的LINKER序列，其将EgG1Y162-2以最小4串联形式融合表达的蛋白具有较好的免疫原性与特异性。一般来说，分子量过大的蛋白会因为异种蛋白给机体带来一定副作用；分子量过小的蛋白可能不具有免疫原性。

附图说明

图1质粒pET30a-EgG1Y162-2(4)的构建及鉴定，1：重组质粒pET30a-EgG1Y162-2(4)，2：ECOR I与Sal I双酶切。

图2重组质粒pET30a-EgG1Y162-2(4)经不同条件诱导蛋白的表达(上清中可溶性重组蛋白)，M:蛋白分子量标志物1，2，3，4：0.2mmol/L IPTG 37℃诱导0h；37℃诱导4h；28℃诱导4h；28℃诱导2h 37℃诱导2h；5，6，7，8：0.5mmol/L IPTG 37℃诱导0h；37℃诱导4h；28℃诱导4h；28℃诱导2h 37℃诱导2h；9，10，11,12：0.8mmol/L IPTG37℃诱导0h；37℃诱导4h；28℃诱导4h；28℃诱导2h 37℃诱导2h。

图3重组质粒pET30a-EgG1Y162-2(4)经不同条件诱导蛋白的表达(沉淀中可溶性重组蛋白)，M:蛋白分子量标志物1，2，3，4：0.2mmol/L IPTG 37℃诱导0h；37℃诱导4h；28℃诱导4h；28℃诱导2h 37℃诱导2h；5，6，7，8：0.5mmol/L IPTG 37℃诱导0h；37℃诱导4h；28℃诱导4h；28℃诱导2h 37℃诱导2h；9，10，11,12：0.8mmol/L IPTG37℃诱导0h；37℃诱导4h；28℃诱导4h；28℃诱导2h 37℃诱导2h。

图4镍柱纯化重组蛋白EgG1Y162-2(4)，M：蛋白分子质量标准，1：未过柱蛋白，2：第1次过柱，3：第2次过柱，4：20mmol/L咪唑洗脱液，5：40mmol/L咪唑洗脱液，6：60mmol/L咪唑洗脱液，7：80mmol/L咪唑洗脱液，8：100mmol/L咪唑洗脱液，9：200mmol/L咪唑洗脱液，10：300mmol/L咪唑洗脱液，11：400mmol/L咪唑洗脱液，12：500mmol/L咪唑洗。

图5Western-Blot鉴定重组蛋白EgG1Y162-2(4)的表达，M：蛋白分子质量标准，1：重组蛋白EgG1Y162-2(4)。

图6正常小鼠血清的Western-Blot鉴定，M：蛋白分子质量标准，1-10：正常小鼠血清。

图7囊型包虫小鼠血清的Western-Blot鉴定，M：蛋白分子质量标准，1-10：囊型包虫小鼠血清。

图8正常人血清的Western-Blot鉴定，M：蛋白分子质量标准，1-10：正常人血清。

图9囊型包虫病人血清的Western-Blot鉴定，M：蛋白分子质量标准，1-10：囊型包虫病人血清。

图10流式细胞术检测EgG1Y162与EgG1Y162-2(4)蛋白处理24h后成熟DC的百分率。

对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1质粒pET30a-EgG1Y162-2(4)的构建及鉴定

具体实施方法：对上海生工合成的质粒pET30a-EgG1Y162-2(4)进行双酶切鉴定，运用1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪上验证结果，结果见图1。

实施例2重组蛋白EgG1Y162-2(4)的诱导表达

具体实施方法：原核表达质粒pET30a-EgG1Y162-2(4)转化入宿主菌Ecoli.BL21(DE3)，挑取单克隆接种于20mL的含30μg/mL的卡那霉素的LB液态培养基中，37℃、220r/min摇床振荡培养过夜，次日将此过夜的培养菌液按1∶50接种于含30μg/mL的卡那霉素的LB液态培养基中扩大培养，37℃、220r/min摇床振荡培养至菌液OD为0.6-0.8时，将菌液分别装到12个50ml的灭菌离心管中，平均每个离心管中20ml的菌液。将装有菌液的离心管进行编号为1到12号，然后按编号顺序分成三组。第一组1、2、3、4号加入诱导剂IPTG 0.2mmol/L。第二组5、6、7、8号加入诱导剂IPTG 0.5mmol/L。第三组9、10、11、12号加入诱导剂IPTG0.8mmol/L。然后将1、5、9号作为未诱导的对照试验组，将2、6、10号置于37℃条件下培养4h，将3、7、11号置于28℃条件下培养4h，将4、8、12号置于28℃，37℃条件下分别诱导2h。经上述不同条件诱导表达后以4℃、4000r/min离心10分钟收集菌液中的菌体，加入PBS稀释菌体并加入终浓度为1mM/L的PMSF超声破碎裂解菌体，工作时程5秒，工作间歇5秒，全程时间2min，超声两次，以4℃、12000r/min离心10min分离获得上清和沉淀。分别取适量的上清和沉淀加入4×蛋白上样缓冲液，100℃水浴锅煮10min，作为SDS-PAGE备用。对不同诱导条件下上清中重组蛋白HIS-EgG1Y162-2(4)的表达量进行统计，结果见图2，可以看出重组蛋白-EgG1Y162-2(4)在IPTG浓度为0.2mmol/L、37℃诱导4h条件下上清中表达量最高，差异有统计学意义(P＜0.001)。图3为不同诱导条件下沉淀中重组蛋白HIS-EgG1Y162-2(4)的表达量。

实施例3镍柱纯化重组蛋白EgG1Y162-2(4)

具体实施方法：根据探索出的重组蛋白EgG1Y162-2(4)诱导最佳条件，IPTG终浓度为0.5mmol/L，37℃4小时条件下大量诱导蛋白，收集菌体沉淀，并且每克菌体沉淀加入7mL的PBS稀释混匀，加入终浓度为1mM的PMSF，然后进行细胞超声破碎，设置工作时间5s，工作间隙5s，全程时间3min，操作三次超声破碎，于4℃，12000rpm/min离心10min获取上清中可溶性蛋白，并对上清中蛋白EgG1Y162-2(4)经镍柱纯化。首先用5倍柱体积的平衡缓冲液平衡His柱后备用，将收集的蛋白上清经0.22μm的滤器过滤去除多余的杂质后通过蠕动泵缓慢的经过His柱，将收集过滤后的蛋白上清液再次过柱。待蛋白重复过柱后，将His柱置于4℃过夜，次日，依次用浓度为20mM、40mM、80mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM的咪唑进行洗脱，收集过柱后的液体。对过柱后的液体分别进行SDS-PAGE检测，分析不同浓度的咪唑所洗脱的蛋白质的含量和纯度以探索出最佳纯化条件。纯化重组蛋白EgG1Y162-2(4)的SDS-PAGE分析结果见图4。

实施例4Western-Blot鉴定重组蛋白EgG1Y162-2(4)的表达

具体实施方法：将纯化的HIS-EgG1Y162-2(4)蛋白经SDS-PAGE后电转移至PVDF膜上。然后，用5％的脱脂奶粉在室温条件下封闭1h，1×TBST重复洗涤三次，每次间隔15min。加入鼠抗His-Tag单克隆抗体(1:2000稀释)，4℃摇床孵育过夜，用1×TBST重复洗涤3次，每次间隔15min。加入HRP兔抗鼠抗体(1：3000稀释)，室温孵育2小时，同样用1×TBST重复洗涤3次，每次间隔15min。加入ECL显色，观察结果，重组蛋白EgG1Y162-2(4)的鉴定结果见图5。

实施例5重组蛋白EgG1Y162-2(4)的血清学鉴定

一、具体实施方法：将重组蛋白EgG1Y162-2(4)进行小鼠血清学的鉴定，正常小鼠血清作为一抗，按1∶150稀释，HRP兔抗鼠抗体作为二抗，按1∶3000稀释，通过Western-Blot鉴定10例正常小鼠血清，0例正常小鼠血清在目标条带位置约39kDa处均未出现明显反应条带，10例感染细粒棘球蚴小鼠血清均在目标条带位置约39kDa处出现明显反应条带。灵敏度＝真阳性/(真阳性+假阳性)×100％，其灵敏度为100％；特异性＝真阴性/(真阴性+假阴性)×100％，其特异性为100％，结果见图6和图7。

二、具体实施方法：将重组蛋白EgG1Y162-2(4)进行人血清学的鉴定，正常人血清作为一抗，按1∶150稀释，HRP山羊抗人作为二抗，按1∶4000稀释，通过Western-Blot鉴定10例正常人血清，9例正常人血清在目标条带位置约39kDa处均未出现明显反应条带，10例患者血清均在目标条带位置约39kDa处出现明显反应条带。灵敏度＝真阳性/(真阳性+假阳性)×100％，其灵敏度为100％；特异性＝真阴性/(真阴性+假阴性)×100％，其特异性为90％，结果见图8和图9。

实施例6重组蛋白EgG1Y162-2(4)能促进树突状细胞(DC)的成熟

具体实施方法：小鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下取出胫骨和股骨并剥离肌肉组织，用注射器吸取适量PBS插入骨骺冲洗骨腔获取骨髓细胞，滤网过滤细胞，离心弃上清，加入适量红细胞裂解液，混匀后放置4℃冰箱10min，室温离心5min，弃上清。用完全培养基悬浮骨髓细胞，接种到六孔板中的同时加入rmGM-CSF和rmIL-4，放于CO2的培养箱中隔日半量换液，并加入相应的细胞因子培养至第7天，即获得未成熟树突状细胞(imDCs)。将第7天未成熟的树突状细胞随机分为两组，分别用EgG1Y162(终浓度500ng/ml)与EgG1Y162-2(4)(终浓度500ng/ml)蛋白刺激，继续培养24h，收集细胞悬液。通过细胞计数，按照每个流式管中有1×106个细胞进行流式细胞鉴定。2ml PBS轻轻吹打混匀后1000rbp，离心5min，弃上清，加入50ul含有PE-CyTM7偶联仓鼠抗小鼠CD11c+抗体，APC偶联抗小鼠的抗原CD86+抗体，FITC偶联CD45+配体抗体，PE标记的抗小鼠MHCⅡI-Ab，避光，4℃冰箱孵育30min。70um滤器过滤细胞，加入300μl PBS重悬细胞，4h内检测成熟DC的百分率，同时设定空白管。

结果：如图10所示，在抗原刺激了24h后，利用流式细胞术分别检测CD45阳性的免疫细胞中DCs的表面标志物CD11c及mDCs的表面标志物MHC-II类分子与CD86的表达情况。图10结果显示经HIS-EgG1Y162抗原刺激24h后，在CD45+的免疫细胞中，CD11c+CD86+,CD11c+MHCII+表型的免疫细胞的百分比分别为(54.8±0.73)％与(33.3±0.25)％；而经HIS-EgG1Y162-2(4)抗原刺激24h后，在CD45+的免疫细胞中，CD11c+CD86+,CD11c+MHCII+表型的免疫细胞的百分比分别为(67.6±0.90)％与(35.6±0.42)％，成熟DC的百分率明显增高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。