苏齐内酯在制备肿瘤免疫药物中的应用以及肿瘤免疫药物和组合物

摘要

本发明属于天然产物抗肿瘤技术领域，特别是涉及苏齐内酯在制备肿瘤免疫药物中的应用以及肿瘤免疫药物和组合物。本发明通过研究发现，苏齐内酯能够有效促进免疫细胞分泌γ‑干扰素，并产生提高免疫细胞活力、降低肿瘤细胞活力的作用，可用于制成肿瘤免疫药物。并且，苏齐内酯与山柰酚、槲皮素之间还具有协同作用，可合用于制成肿瘤免疫药物。

说明书

技术领域

本发明属于天然产物抗肿瘤技术领域，特别涉及苏齐内酯在制备肿瘤免疫药物中的应用以及肿瘤免疫药物和组合物。

背景技术

癌症起源于上皮组织的恶性病变，是一个多因子、多步骤的复杂过程，其产生原因与吸烟、感染、职业暴露、环境污染、不合理膳食、遗传因素等密切相关。病变过程中，癌细胞的扩散可损害病变部位以外的细胞，并最终导致患者死亡。

癌症癌症的治疗方法有手术治疗、化学治疗、放射治疗、免疫治疗等。手术治疗适用于早期或较早期的实体瘤，对于已经发生扩散转移的情况则无法根除全部癌细胞；化学治疗的药物大多没有专一性，对机体细胞产生无差别化的损害，在抑制、杀死癌细胞的同时，对于正常细胞也会产生严重伤害；放射治疗同样会对正常细胞产生损伤，导致明显的副作用。

免疫治疗是通过激发和增强机体的免疫功能，以达到控制和杀伤肿瘤细胞的目的。现阶段，免疫治疗在临床治疗癌症过程中逐渐显示出优势。然而，由于癌细胞能够抑制免疫细胞活性而导致免疫逃逸，因此并非所有具有激发和增强机体免疫功能的药物都能作为肿瘤免疫药物来达到杀灭癌细胞的效果。提高免疫细胞活力的药物还有可能刺激肿瘤细胞分泌修复因子而造成炎症反应。那么寻找能够有效激活免疫细胞、降低肿瘤细胞活性、避免刺激肿瘤细胞产生修复因子的药物，对于肿瘤免疫治疗则具有重要意义。

在肿瘤免疫治疗中，γ-干扰素是研究热点之一，促进γ-干扰素分泌对于肿瘤免疫治疗具有一定的积极作用。然而目前现有技术所公开的能够激活免疫细胞的药物并非均具有促进γ-干扰素分泌的作用，或作用较小，在肿瘤免疫治疗方面的应用具有一定的局限性。

发明内容

针对以上技术问题，本发明提供苏齐内酯在制备肿瘤免疫药物中的应用以及肿瘤免疫药物和组合物。本发明通过研究发现，苏齐内酯能够有效促进免疫细胞分泌γ-干扰素，并产生提高免疫细胞活力、降低肿瘤细胞活力的作用，可用于制成肿瘤免疫药物，且苏齐内酯与山柰酚、槲皮素之间在促进免疫细胞分泌γ-干扰素方面还具有协同作用。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

第一方面，本发明实施例提供苏齐内酯在制备肿瘤免疫药物中的应用，所述肿瘤免疫药物为促进γ-干扰素分泌的药物。

实验发现，苏齐内酯能够有效促进免疫细胞分泌γ-干扰素，并具有提高免疫细胞活力、降低肿瘤细胞活力的作用。

第二方面，本发明实施例还提供一种苏齐内酯在制备肿瘤免疫药物中的应用，所述肿瘤免疫药物中包括苏齐内酯和山柰酚。

第三方面，本发明实施例还提供一种苏齐内酯在制备肿瘤免疫药物中的应用，所述肿瘤免疫药物中包括摩尔比为(7～2):(3～8)的苏齐内酯和山柰酚。

苏齐内酯是当归、人参等中药中的化合物之一，山柰酚是山柰、黄芪、地榆、菝契等中药中的化合物之一。实验发现，二者在上述比例下联合应用，可显著促进γ-干扰素分泌，从而通过免疫产生抑制肿瘤的疗效，并且合用后对于促进γ-干扰素分泌的效果明显优于苏齐内酯或山柰酚单独使用，说明二者在提高脾细胞活力、抑制肿瘤细胞活力、促γ-干扰素分泌方面具有协同作用。

优选地，所述苏齐内酯和山柰酚的摩尔比为(2～3):(3～2)，更优选的摩尔比为1:1。

第四方面，本发明实施例还提供另一种苏齐内酯在制备肿瘤免疫药物中的应用，所述肿瘤免疫药物中包括苏齐内酯和槲皮素。

优选地，所述苏齐内酯与所述槲皮素的摩尔比为1:1。

实验发现，将苏齐内酯与槲皮素在上述比例下联合应用，也可促进γ-干扰素分泌，通过免疫产生抑制肿瘤的疗效，二者合用后对于促进γ-干扰素分泌的效果也优于苏齐内酯或山柰酚单独使用，具有协同作用。

第五方面，本发明实施例还提供了一种抗乳腺癌的肿瘤免疫药物，所述抗乳腺癌的肿瘤免疫药物中的活性成分包括苏齐内酯。

优选地，所述抗乳腺癌的肿瘤免疫药物为口服制剂和注射制剂，通过口服、注射的给药方式，即可发挥肿瘤免疫的作用。

第六方面，本发明实施例还提供了一种抗乳腺癌的肿瘤免疫组合物，所述抗乳腺癌的肿瘤免疫组合物包括苏齐内酯和山柰酚。在肿瘤细胞-脾细胞共培养体系中，苏齐内酯与山柰酚合用，能够显著增加脾细胞的细胞活力，降低肿瘤细胞的细胞活力，并显著增加共培养体系中γ-干扰素的含量。

优选地，所述苏齐内酯和山柰酚的摩尔比为(7～2):(3～8)。

优选地，所述苏齐内酯和山柰酚的摩尔比为(2～3):(3～2)，更优选的摩尔比为1:1。

第七方面，本发明实施例还提供了另一种抗乳腺癌的肿瘤免疫组合物，所述抗乳腺癌的肿瘤免疫组合物包括苏齐内酯和槲皮素。

优选地，所述苏齐内酯和槲皮素的摩尔比为1:1。在肿瘤细胞-脾细胞共培养体系中，苏齐内酯与槲皮素在该比例下合用也能够增加共培养体系中γ-干扰素的含量，且该效果明显优于单独使用槲皮素，说明苏齐内酯与槲皮素之间在促进γ-干扰素分泌方面具有协同作用。

附图说明

图1为对比例1中表8与实施例11中表1、2的脾细胞活性数据对比；

图2为对比例1中表9与实施例11中表3、4的4T1细胞活性数据对比；

图3为对比例1中表10与实施例11中表5、6的γ-干扰素表达量数据对比；

图4为对比例2中表11与实施例11中表5、7的γ-干扰素表达量数据对比；

图5为对比例3中表12、13与实施例11中表5的γ-干扰素表达量数据对比；

图6为对比例4中表14与实施例11中表1、2的脾细胞活性数据对比；

图7为对比例4中表15与实施例11中表3、4的4T1细胞活性数据对比；

图8为对比例4中表16与实施例11中表5、6的γ-干扰素表达量数据对比。

以上各图中，*表示与空白组相比P＜0.05，**表示与空白组相比P＜0.01，***表示与空白组相比P＜0.001。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步举例说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

肿瘤免疫是目前肿瘤治疗的研究热点，天然产物中的一些多糖、黄酮等成分具有不同程度的提高免疫细胞活性的作用，进而产生肿瘤免疫的功效。有研究发现，γ-干扰素作为细胞因子在肿瘤免疫反应中发挥着一定作用，γ-干扰素通过调节免疫应答、调节细胞周期、促进细胞凋亡、抑制血管生成等途径抑制肿瘤发生，促使肿瘤消亡；但是，内源性和外源性γ-干扰素可以上调肿瘤细胞中PD-L1的表达，PD-L1分子与肿瘤部位浸润T淋巴细胞表面的PD-1分子结合后，会抑制T细胞活性，促进肿瘤细胞的免疫逃逸。因此，促进免疫细胞产生γ-干扰素的天然产物在降低肿瘤细胞活力、提高免疫细胞活力方面的作用无法准确判断，即，能够促进免疫细胞产生γ-干扰素的天然产物并不一定能提高免疫细胞活力。

另一方面，提高免疫细胞活力却并不促进γ-干扰素产生的药物有可能刺激肿瘤细胞分泌修复因子而造成炎症反应，当炎症反应较重时，临床中需要使用糖皮质激素来进行抑制，由此则无法避免糖皮质激素带来的消化道出血、股骨头坏死等不良反应。

本发明通过对天然产物的大量研究和筛选，发现苏齐内酯在提高免疫细胞活力、促进γ-干扰素产生、降低肿瘤细胞活力方面具有积极作用，可用作肿瘤免疫药物。

并且，本发明通过研究还发现，苏齐内酯与山柰酚在摩尔比为(7～2):(3～8)的配比下合用，或苏齐内酯与槲皮素在摩尔比为1:1的配比下合用时还具有协同作用，能够提升γ-干扰素表达量，又能提高脾细胞活性，降低肿瘤细胞活力。

以下通过具体实施例来对本发明的方案进行说明。

以下实施例中所使用的苏齐内酯、华良姜素购自上海源叶生物科技有限公司，山柰酚、槲皮素、毛蕊异黄酮、异鼠李素购自大连美仑生物技术有限公司，小鼠乳腺癌细胞4T1购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

以下实施例中所采用的其他原料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径获得。

实施例1

本发明实施例提供了一种肿瘤免疫药物，其活性成分为苏齐内酯。

实施例2

本发明实施例提供了一种肿瘤免疫组合物，其活性成分为摩尔比为1:1的苏齐内酯和山柰酚。

实施例3

本发明实施例提供了一种肿瘤免疫组合物，其活性成分为摩尔比为2:3的苏齐内酯和山柰酚。

实施例4

本发明实施例提供了一种肿瘤免疫组合物，其活性成分为摩尔比为3:2的苏齐内酯和山柰酚。

实施例5

本发明实施例提供了一种肿瘤免疫组合物，其活性成分为摩尔比为3:7的苏齐内酯和山柰酚。

实施例6

本发明实施例提供了一种肿瘤免疫组合物，其活性成分为摩尔比为7:3的苏齐内酯和山柰酚。

实施例7

本发明实施例提供了一种肿瘤免疫组合物，其活性成分为摩尔比为1:4的苏齐内酯和山柰酚。

实施例8

本发明实施例提供了一种肿瘤免疫组合物，其活性成分为摩尔比为1:1的苏齐内酯和槲皮素。

实施例9

本发明实施例提供了一种肿瘤免疫片剂，其活性成分为苏齐内酯。

该片剂的活性成分也可选择摩尔比为(7～2):(3～8)的苏齐内酯和山柰酚或摩尔比为1:1的苏齐内酯和槲皮素。

实施例10

本发明实施例提供了一种肿瘤免疫的注射液，其活性成分为苏齐内酯。

该注射液的活性成分也可选择摩尔比为(7～2):(3～8)的苏齐内酯和山柰酚或摩尔比为1:1的苏齐内酯和槲皮素。

实施例11

本发明实施例提供了苏齐内酯以及苏齐内酯与山柰酚的混合物、苏齐内酯与槲皮素的混合物在肿瘤免疫中的应用效果。

1、实验方法

1.1提取脾细胞

(1)将没有经过任何处理的空白小鼠处死，浸入75％v/v的乙醇中浸泡3min，镊子将小鼠取出，置于无菌纱布上。

(2)小心取出脾脏，放在盛有20mL无菌PBS的50mL EP管当中。

(3)将脾脏放置于200目的无菌一次性筛网上，用无菌的针芯轻轻研磨脾脏，获取细胞悬液。

(4)离心(1500r/min，10min)，吸除上清液。

(5)加入等体积的红细胞裂解液，颠倒混匀，离心(1500r/min，5min)，吸除上清液，重复此步骤至红细胞裂解完全。

(6)用PBS清洗次，离心(900r/min，5min)，吸除上清液。

(7)放入1640完全培养基中，置于5％CO

1.2细胞共培养

收集4T1细胞和脾细胞，以每孔4000个4T1细胞及4000个脾细胞的密度加入96孔培养板中共培养(4T1细胞和脾细胞的数量比约1:1)，每孔100μL于培养箱中培养24h。各组除空白组外，分别用1μM苏齐内酯(浓度为10

1.3定量RT-qPCR分析

在定量RT-qPCR分析中，使用Trizol试剂从1.2共培养体系中的脾细胞中提取总RNA。使用逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录成cDNA。RT-qPCR的程序如下：95℃预变性15min，95℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环。用于RT-qPCR的引物序列如下：

GAPDH：

F：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′；

R：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′；

PIK3R1：

F：5'-AAACAAAGCGGAGAACCTATTG-3'；

R：5'-TAATGACGCAATGCTTGACTTC-3'。

1.4MTT分析

用1.2共培养体系中的脾细胞及4T1细胞分别进行MTT实验。每孔加入10μL MTT溶液(5mg/ml)，放入培养箱中培养4h。将96孔板离心(1500r/min，5min)，吸除上清液，每孔加入100μL DMSO，待结晶物充分溶解后，使用酶标仪在570nm下测量各孔的吸光值。

1.5酶联免疫吸附测定(ELISA)

(1)稀释标准品：按照说明书稀释标准品。

(2)加样：设空白孔、待测样品孔。在酶标包被板上计划好的的待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品(1.2共培养体系上清液样品)10μL(样品最终稀释度为5倍)，轻轻混匀。

(3)温育：用封板膜封板，置37℃环境下温育30min。

(4)配液：将洗涤液用蒸馏水稀释(30倍)后备用。

(5)洗涤：弃去液体，每孔加100μL稀释后的洗涤液，静置30s后弃去，重复5次。

(6)加酶：50μL(空白孔除外)。

(7)温育：同(3)。

(8)洗涤：同(5)。

(9)显色：每孔加入显色剂A 50μL和显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃环境下避光显色15min。

(10)终止：加终止液50μL，终止反应，此时颜色色转变成黄色。

(11)测定：把空白孔作为调零孔，测量吸光度(波长450nm)。

1.6脾脏免疫细胞的流式细胞仪分析

将脾脏(1.1中的脾组织样品)放置于200目的不锈钢筛网上，用注射器的针芯轻轻研磨脾脏，获取细胞悬液。离心(1200r/min 10min)，吸除上清液。加入红细胞裂解液，颠倒混匀，离心(1200r/min 10min)，吸除上清液。用PBS缓冲液冲洗2次。用PBS轻轻重悬细胞并计数。取细胞总数约5x10

2、结果

苏齐内酯，苏齐内酯与山柰酚的混合物对脾细胞活性、4T1细胞活性的影响如表1～4。

表1苏齐内酯对脾细胞活性的影响

表2苏齐内酯与山柰酚的混合物对脾细胞活性的影响

表3苏齐内酯对4T1细胞活性的影响

表4苏齐内酯与山柰酚的混合物对4T1细胞活性的影响

苏齐内酯，苏齐内酯与山柰酚的混合物，苏齐内酯与槲皮素的混合物对γ-干扰素表达量的变化如表5～表7所示。

表5苏齐内酯对γ-干扰素表达量的影响

表6苏齐内酯与山柰酚的混合物对γ-干扰素表达量的影响

表7苏齐内酯与槲皮素的混合物对γ-干扰素表达量的影响

由以上试验结果可见，苏齐内酯能够提高免疫细胞活力，降低肿瘤细胞活力，并能够产生γ-干扰素；苏齐内酯与山柰酚、槲皮素合用后可显著提高γ-干扰素的表达量，且当苏齐内酯与山柰酚在1:1的摩尔比下合用时对γ-干扰素表达量的影响最为显著。

对比例1

本对比例提供了山柰酚单独使用时对脾细胞活性、4T1细胞活性、γ-干扰素分泌的影响。

按上述实施例11中的操作过程，在1.2中用1μM山柰酚处理24小时。实验方法同实施例11。

实验数据如表8～表11所示。

表8山柰酚对脾细胞活性的影响(与空白组平均值相比的相对值)

表9山柰酚对4T1细胞活性的影响(与空白组平均值相比的相对值)

表10山柰酚对γ-干扰素表达量的影响(与空白组平均值相比的相对值)

将表8与实施例11中表1、2的数据对比(如图1所示)，表9实施例11中表3、4的数据对比(如图2所示)，表10实施例11中表5、6的数据对比(如图3所示)可见，山柰酚或苏齐内酯单独使用时，在增强脾细胞活性、降低4T1细胞活性(苏齐内酯与山柰酚摩尔比为1:4时除外)、促进γ-干扰素分泌方面的效果明显不及相同药物浓度下苏齐内酯与山柰酚合用后的效果。

对比例2

本对比例提供了槲皮素单独使用时对γ-干扰素分泌的影响。

按上述实施例11中的操作过程，在1.2中用1μM槲皮素处理24小时。实验方法同实施例11。

实验数据如表11所示。

表11槲皮素对γ-干扰素表达量的影响

将表11与实施例11中表5、7的数据对比(如图4所示)可见，槲皮素或苏齐内酯单独使用时，在促进γ-干扰素分泌方面的效果明显不及相同药物浓度下苏齐内酯与槲皮素合用后的效果。

对比例3

本对比例提供了其他黄酮类化合物单独使用以及苏齐内酯与其他黄酮类化合物配合使用时对γ-干扰素分泌的影响。。

按上述实施例11中的操作过程，在1.2中分别用1μM毛蕊异黄酮、华良姜素、异鼠李素，或苏齐内酯/毛蕊异黄酮、苏齐内酯/华良姜素、苏齐内酯/异鼠李素的组合(摩尔比均为1:1，总浓度均为10

实验数据如表12、表13所示。

表12其他黄酮类化合物对γ-干扰素表达量的影响

表13其他组合对γ-干扰素表达量的影响

从表12、表13的结果结合实施例11中表5的数据可见(如图5所示)，毛蕊异黄酮、华良姜素、异鼠李素也能促进γ干扰素的释放，但与苏齐内酯合用后所产生的促进γ干扰素释放的效果并不及单独使用时的效果。可见，并非任何可促进γ干扰素释放的黄酮类化合物在与苏齐内酯合用后均能产生协同作用。

对比例4

本对比例提供了苏齐内酯与山柰酚在其他比例下合用时对脾细胞活性、4T1细胞活性、γ-干扰素分泌的影响。

按上述实施例11中的操作过程，在1.2中分别用摩尔比为9:1，1:9，4:1的苏齐内酯与山柰酚的混合物(总浓度均为10

实验数据如表14～表16所示。

表14其他比例的苏齐内酯与山柰酚的混合物对脾细胞活性的影响

表15其他比例的苏齐内酯与山柰酚的混合物对4T1细胞活性的影响

表16其他比例的苏齐内酯与山柰酚的混合物对γ-干扰素表达量的影响

将表14～16与实施例11中表2、4、6的数据对比可见，苏齐内酯与山柰酚在(7～2):(3～8)的比例下合用后对提高脾细胞活性、降低4T1细胞活性、促进γ-干扰素分泌的效果明显优于其他比例下的效果，如图6～8所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。