一种用于鸭血清中多杀性巴氏杆菌抗体检测的胶体金试纸条及其制备方法

摘要

本发明涉及一种用于鸭血清中多杀性巴氏杆菌抗体检测的胶体金试纸条及其制作方法，所述胶体金试纸条包括PVC底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。PVC底板的一端粘附样品垫；PVC底板的另一端粘附有吸水垫，其中部依次粘附有金标垫、硝酸纤维素膜；金标垫的一端与样品垫相粘附，另一端与硝酸纤维素膜相粘附，硝酸纤维素膜的另一端与吸水垫相粘附；所述的胶体金试纸条的制备方法包括以下步骤：(1)重组多杀性巴氏杆菌脂蛋白B的制备；(2)兔抗鸭IgG抗体的胶体金标记；(3)胶体金试纸条的组装；本发明的胶体金试纸条可快速检测鸭血清中的抗多杀性巴氏杆菌抗体，特异性强，重复性好。

说明书

技术领域

本发明涉及家禽传染病学领域，具体为一种用于鸭血清中多杀性巴氏杆菌抗体检测的胶体金试纸条及其制作方法。

背景技术

禽巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的可侵害各种禽类的一种慢性或急性接触性、败血性传染病，是危害养禽业最为重要的细菌性传染病，也是许多国家和地区列为重点预防的一种疾病。所有品种鸭均对本病易感，1月龄以内鸭的易感性略低，成年鸭的易感性高，产蛋鸭最易感。生物安全的饲养模式加上合理的免疫接种是预防该病的有效方法。血清中多杀性巴氏杆菌抗体的检测，可以为鸭感染禽巴氏杆菌病的流行病学调查提供数据，也可以监测疫苗免疫后抗体的消长规律，为制定合理的免疫程序提供科学依据。

现有的检测鸭血清中多杀性巴氏杆菌抗体的方法有全血清平板凝集试验、琼脂扩散试验、间接血凝试验及酶联免疫吸附试验(ELISA)等。全血清平板凝集试验简单易行，几分钟即可出结果，但凝集抗原存在自凝问题，结果易受非特异性因素的影响而造成假阳性，影响结果的准确性。琼脂扩散试验操作简便，需时较长，一般需1～3天，且灵敏度不高。间接血凝试验的敏感性与琼脂扩散试验相似，几分钟即可出结果，但间接血凝抗原的制备很繁琐，需要制备细菌的热浸抗原或超声波粉碎抗原，然后致敏绵羊红细胞，且这种抗原不易保存，2个月后效价即降低且非特异性升高。以多杀性巴氏杆菌的全菌、超声波裂解液或原核表达的重组蛋白作包被抗原，已建立了多种间接ELISA，敏感性大大提高，特异性也好，一次检测需时数小时即可，但对仪器设备、人员素质等的要求较高。基层兽医站和养殖场迫切需要简单、快速、不需要精密仪器且能保证检测准确性和一定敏感度的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于鸭血清中多杀性巴氏杆菌抗体检测的胶体金试纸条及其制备方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种用于鸭血清中多杀性巴氏杆菌抗体检测的胶体金试纸条，它包括PVC底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。PVC底板的一端粘附样品垫，是样品加样处；PVC底板的另一端粘附有吸水垫，其中部依次粘附有金标垫、硝酸纤维素膜；金标垫的一端与样品垫相粘附，另一端与硝酸纤维素膜相粘附，硝酸纤维素膜的另一端与吸水垫相粘附。

所述金标垫包被了胶体金标记的兔抗鸭IgG抗体；

所述硝酸纤维素膜上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线；所述硝酸纤维素膜的检测线包被重组多杀性巴氏杆菌脂蛋白B，所述硝酸纤维素膜的质控线包被羊抗兔IgG抗体。

优选的，金标垫上，胶体金标记的兔抗鸭IgG抗体的包被浓度为2～20μg/mL。

优选的，硝酸纤维素膜上检测线，重组多杀性巴氏杆菌脂蛋白B的包被浓度为0.1～1mg/mL。

优选的，硝酸纤维素膜上质控线，羊抗兔IgG抗体的包被浓度为0.2～2mg/mL。

所述的胶体金试纸条的制备方法，它包括以下步骤：

(1)重组多杀性巴氏杆菌脂蛋白B的制备：先分析多杀性巴氏杆菌的脂蛋白B的基因序列，并对其进行优化后合成，同时在序列的5‘端和3’端分别加上BamHI和XhoI的酶切位点，连接于pMD18-TS载体上；之后构建重组表达质粒，再进行重组蛋白的低温表达及纯化；

(2)兔抗鸭IgG抗体的胶体金标记；

(3)胶体金试纸条的组装：制备样品垫；将标记好的金标兔抗鸭IgG抗体喷涂于封闭好的结合垫上制得金标垫；用喷膜系统将重组多杀性巴氏杆菌脂蛋白B喷涂于NC膜上的检测线，用喷膜系统将羊抗兔IgG抗体喷涂于NC膜上的质控线制得硝酸纤维素膜(NC膜)；将制得的样品垫、金标垫、NC膜和吸水纸依次粘贴于PVC底板上，得所述胶体金试纸条。

其中，步骤(1)重组多杀性巴氏杆菌脂蛋白B的制备具体包括以下步骤：

1.1多杀性巴氏杆菌脂蛋白B基因的分析与合成

分析多杀性巴氏杆菌pm70株脂蛋白B的基因序列后，选取多杀性巴氏杆菌pm70株脂蛋白B基因的第61-第831位并对其进行优化，然后合成，且在序列的5‘端和3’端分别加上BamHI和XhoI的酶切位点，连接于pMD18-TS载体上，得pMD18-TS-PLPB质粒；其中，优化后的多杀性巴氏杆菌pm70株脂蛋白B基因序列如SEQ ID NO.1所示，优化后的多杀性巴氏杆菌pm70株脂蛋白B基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

1.2重组表达质粒的构建；

步骤1.2的具体方法为：将pMD18-TS-PLPB质粒和表达载体pGEX-6P-1分别以BamHI和XhoI双酶切，凝胶回收约771bp的插入片段和表达载体片段，以T4连接酶连接，将得到的连接产物转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，用AMP筛选转化子，经PCR和质粒的限制性酶切分析，鉴定

pGEX-6P-1-PLPB/BL21阳性重组菌株，测序再次验证。

1.3重组蛋白的低温表达及纯化；

步骤1.3的具体方法为：将pGEX-6P-1-PLPB/BL21重组菌于37℃振荡培养至OD600值为0.5左右时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，于16℃诱导表达12h；诱导结束后，离心收集菌体，超声波裂解，收集上清，按GST HP手册方法纯化，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定蛋白浓度。

步骤(2)兔抗鸭IgG抗体的胶体金标记具体包括以下步骤：

2.1胶体金的制备

取1mL 10g/L氯金酸溶液加入到经泡酸和硅化处理过的锥形瓶中，加入100mL去离子水，锡箔纸封口，放入到微波炉中；高火3min使溶液煮至沸腾，取出锥形瓶，迅速加入10g/L柠檬酸三钠溶液1.5mL，同时混匀；溶液会从淡黄色变为无色，再变为灰黑色；锡箔纸封口，将锥形瓶放入到微波炉，中高火加热3min，溶液变为酒红色后，再加热3min，待其冷却至室温后，用去离子水补至100mL，使用450nm滤膜过滤后，4℃避光保存；

2.2胶体金标记

将制备好的胶体金于4℃3000r/min离心20min，取上清，用0.1mol/L的K

所述的胶体金试纸条在制备检测鸭血清中多杀性巴氏杆菌抗体试剂盒中的应用。

一种含有所述用于鸭血清中多杀性巴氏杆菌抗体检测的胶体金试纸条的试剂盒。

本发明的发明人还尝试了利用其它一些蛋白作为检测线的包被蛋白(如重组OMPA、重组OMPH)，但均无法建立良好的胶体金反应，制得的试纸条重复性差且不敏感。OMPA、OMPH等蛋白均可以原核表达，且经western-Blot验证，亦均可与禽多杀性巴氏杆菌阳性血清起反应，即具有反应原性，但是，经实验验证OMPA、OMPH等蛋白均无法建立良好的胶体金反应，由此可知并不是所有具有反应原性的蛋白均可作为检测线的包被蛋白，用于制备检测鸭血清中多杀性巴氏杆菌抗体的胶体金试纸条。另外，本发明对多杀性巴氏杆菌pm70株脂蛋白B基因进行优化，利用优化后的多杀性巴氏杆菌pm70株脂蛋白B基因进行重组多杀性巴氏杆菌脂蛋白B的制备，利用该重组多杀性巴氏杆菌脂蛋白B制得的胶体金试纸条，其在检测鸭血清中多杀性巴氏杆菌抗体的敏感性方面，虽不及在检测鸡血清中多杀性巴氏杆菌抗体的敏感性，但是用该重组多杀性巴氏杆菌脂蛋白B制得的用于鸭血清中多杀性巴氏杆菌抗体检测的胶体金试纸条，其相比传统的琼脂扩散试验而言更敏感，且还具有较好的重复性以及特异性。

本发明对制备好的试纸条进行特异性的验证。结果表明，本发明的胶体金试纸条对鸭抗多杀性巴氏杆菌血清的检测结果为阳性，对鸭抗大肠杆菌血清、鸭抗沙门氏菌血清、鸭抗禽流感病毒血清、鸭抗鸭瘟病毒血清、鸭抗副黏病毒血清的检测结果为阴性，证明本发明的胶体金试纸条有较好的特异性。

对制备好的试纸条进行重复性的验证。结果表明，同一批次的试纸条对同一份鸭抗多杀性巴氏杆菌血清的检测结果均为阳性；3个不同批次的试纸条，对同一份鸭抗多杀性巴氏杆菌血清的检测结果均为阳性。证明本发明的胶体金试纸条有较好的重复性。

本发明对制备好的试纸条进行与间接ELISA、琼脂扩散试验的符合性验证。结果，15份间接ELISA检测阴性的鸭血清，琼脂扩散试验全为阴性，试纸条检测结果也全为阴性。33份间接ELISA检测阳性的鸭血清，琼脂扩散试验检测，25份为阳性、8份为阴性；试纸条检测结果，31份为阳性(琼脂扩散试验阳性的25份鸭血清，试纸条检测也为阳性)、2份为阴性。说明本发明的胶体金试纸条与琼脂扩散试验的符合率为100％，虽然其敏感性较间接ELISA方法略低，但比琼扩法更敏感，可作为用于鸭血清中多杀性巴氏杆菌抗体检测的胶体金试纸条，而进行广泛推广。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：本发明的胶体金试纸条可快速检测鸭血清中的抗多杀性巴氏杆菌抗体，特异性强，重复性好，具有一定的敏感性，操作简便，3min即可凭肉眼观察结果，阴阳性判定直观，可应用于鸭巴氏杆菌病的流行病学调查，也可应用于禽巴氏杆菌病疫苗对鸭的免疫效果的评价。

附图说明

下面结合附图对本发明做进一步说明。

图1：血清的胶体金试纸条检测结果，从上至下依次为：鸭抗多杀性巴氏杆菌血清、鸭阴性血清。

图2：本发明胶体金试纸条的示意图。

标号说明：1PVC底板、2样品垫、3金标垫、4硝酸纤维素膜、41检测线、42质控线、5吸水垫。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图2所示，为本发明提供的一种用于鸭血清中多杀性巴氏杆菌抗体检测的胶体金试纸条的结构示意图。

所述用于鸭血清中多杀性巴氏杆菌抗体检测的胶体金试纸条，它包括PVC底板1、样品垫2、金标垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5；所述PVC底板1的一端粘附有所述样品垫2，其另一端粘附有所述吸水垫5，其中部依次粘附有所述金标垫3、所述硝酸纤维素膜4；所述金标垫3的一端与所述样品垫2相粘附，其另一端与所述硝酸纤维素膜4相粘附，所述硝酸纤维素膜4与所述吸水垫5相粘附；

所述金标垫3包被了胶体金标记的兔抗鸭IgG抗体；

所述硝酸纤维素膜4上沿样品流动方向依次设有检测线41和质控线42；所述硝酸纤维素膜4的检测线41包被重组多杀性巴氏杆菌脂蛋白B，所述硝酸纤维素膜4的质控线42包被羊抗兔IgG抗体。

所述胶体金标记的兔抗鸭IgG抗体的包被浓度为13.3μg/mL。

所述硝酸纤维素膜4上重组多杀性巴氏杆菌脂蛋白B的包被浓度为0.3mg/mL。

所述硝酸纤维素膜4上羊抗兔IgG抗体的包被浓度为0.2mg/mL。

所述的胶体金试纸条的制备方法，它包括以下步骤：

实施例1：重组多杀性巴氏杆菌脂蛋白B的制备

1.1多杀性巴氏杆菌脂蛋白B基因的分析与合成

分析多杀性巴氏杆菌pm70株脂蛋白B序列(GenBank登陆号：NC002663)，选取多杀性巴氏杆菌pm70株脂蛋白B基因的第61-第831位并对其进行优化，然后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，5’端和3’端分别加上BamHI和XhoI的酶切位点，连接于pMD18-TS载体上，得pMD18-TS-PLPB质粒。

其中，优化后的多杀性巴氏杆菌pm70株脂蛋白B的第61-第831位基因序列为：

TGTAAGGATGATAAGCCGGCAGCAGCAGCCGCCCCGCAGGAACCTGCTGCTCGTAAACTGACCGTTGGCGTGATGACCGGTGCAGAAGCCCAGGTTACCGAAGTTGCCGCCAAAATTGCAAAAGAAAAATATAATATCGACGTGAAGCTGGTTGAATTCACTGAATATACCCAGCCGAATGATGCCCTGACCAAAGGCGATCTGGATGCAAATGCCTTTCAGCATAAACCGTATATGGATAAAGAAGTTGAACAGCGTGGCTATAAACTGGCCATTGTGGGCAATACCTTTGTTTTTCCGATTGCCGCCTATAGTAAAAAGATTAAGAATGTTAGCGAGCTGCAGGATGGCGCAACCGTTGCAGTGCCGAATAATCCGAGCAATCTGGGCCGCGCACTGCTGCTGCTGGAAAAACAGGGTCTGATTAAGCTGAAAGATCCGAGTAATCTGTTTAGTACCAGCATTGATGTTATTGAAAACCCGAAAAATCTGCAGATTAAGGAAGTGGAAGGCAGTCTGCTGCCGCGCATGCTGGATGATGTGGATTTTGCAATTATTAATAACAACTACGCGGTGCAGCAGGGTCTGACCGCAGAAAAAGATGGTATTTTTGTTGAAGATAAGGACAGTCCGTATGTTAATCTGGTGGTGAGTCGTGAAGATAATAAGGATAATGAAGCAATTAAGGACTTCGTTAAAGCATTTCAGACCGAAGAAGTTTATCAGGAAGCACTGAAACATTTTCAGGGCGGCGTTGTGAAAGGCTGGTAA

优化后的多杀性巴氏杆菌pm70株脂蛋白B基因编码的氨基酸序列为：

CKDDKPAAAAAPQEPAARKLTVGVMTGAEAQVTEVAAKIAKEKYNIDVKLVEFTEYTQPNDALTKGDLDANAFQHKPYMDKEVEQRGYKLAIVGNTFVFPIAAYSKKIKNVSELQDGATVAVPNNPSNLGRALLLLEKQGLIKLKDPSNLFSTSIDVIENPKNLQIKEVEGSLLPRMLDDVDFAIINNNYAVQQGLTAEKDGIFVEDKDSPYVNLVVSREDNKDNEAIKDFVKAFQTEEVYQEALKHFQGGVVKGW*

1.2重组表达质粒的构建

pMD18-TS-PLPB质粒和表达载体pGEX-6P-1分别以BamHI和XhoI双酶切，双酶切采用20μL的反应体系：10×buffer 2μL、BamHI 0.5μL、XhoI 0.5μL、质粒或DNA不超过1μg、补足双蒸水至20μL；37℃水浴1h；之后，凝胶回收约771bp的插入片段和表达载体片段，以T4DNA连接酶连接，连接采用10μL的反应体系：10×T4 DNA Ligation buffer 1μL、质粒DNA50ng、插入片段DNA 25ng、T4 DNA连接酶1μL、补足双蒸水至10μL，16℃水浴18h；接着，将得到的连接产物转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，用AMP筛选转化子，经PCR和质粒的限制性酶切分析，鉴定pGEX-6P-1-PLPB/BL21阳性重组菌株，测序再次验证。

1.3重组蛋白的低温表达及纯化

pGEX-6P-1-PLPB/BL21重组菌于37℃振荡培养至OD600值为0.5左右时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，于16℃诱导表达12h。诱导结束后，离心收集菌体，超声波裂解，收集上清，按GST HP手册方法纯化，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定蛋白浓度。

实施例2：兔抗鸭IgG抗体的胶体金标记

2.1胶体金的制备

取1mL 10g/L氯金酸溶液加入到经泡酸和硅化处理过的锥形瓶中，加入100mL去离子水，锡箔纸封口，放入到微波炉中。高火3min使溶液煮至沸腾，取出锥形瓶，迅速加入10g/L柠檬酸三钠溶液1.5mL，同时混匀。溶液会从淡黄色变为无色，再变为灰黑色。锡箔纸封口，将锥形瓶放入到微波炉，中高火加热3min，溶液变为酒红色后，再加热3min，待其冷却至室温后，用去离子水补至100mL，使用450nm滤膜过滤后，4℃避光保存。

2.2胶体金标记

将制备好的胶体金于4℃3000r/min离心20min，取上清，用0.1mol/L的K

实施例3：胶体金试纸条的组装

3.1样品垫的制备

将样品垫浸泡于封闭液(含10g/L的BSA、1％(v/v)吐温20的pH 7.4 0.01mol/L的PBS)中30min，取出后在37℃干燥箱烘干过夜。

3.2金标垫的制备

将空白SB08结合垫于封闭液中浸泡30min，37℃干燥箱烘干过夜，将标记好的金标兔抗鸭IgG抗体稀释3倍，按10μL/cm喷涂于封闭好的结合垫上，37℃干燥箱烘干过夜。

3.3硝酸纤维素膜(NC膜)的制备

用喷膜系统将0.3mg/mL的重组多杀性巴氏杆菌脂蛋白B喷涂于NC膜上的检测线(T)，用喷膜系统将0.2mg/mL的羊抗兔IgG抗体喷涂于NC膜上的质控线(C)，37℃干燥箱烘干过夜。

3.4组装

将样品垫、制备好的金标垫、NC膜和吸水纸依次粘贴于PVC底板上，切割成4mm宽的试纸条，置于装有干燥剂的铝箔袋中即可，常温保存。

实施例4：条件优化

为了使本发明所述的胶体金试纸条达到最佳的效果，本发明的发明人对步骤2.2中胶体金标记兔抗鸭IgG抗体最适pH值以及最适抗体量进行了选择、对步骤3.3中重组多杀性巴氏杆菌脂蛋白B的最佳浓度以及羊抗兔IgG抗体的最佳浓度进行了选择。

其中，胶体金标记兔抗鸭IgG抗体最适pH值的选择方法如下：

4.1胶体金标记兔抗鸭IgG抗体最适pH值的选择

将兔抗鸭IgG抗体调整为2mg/mL，按下表将各物品加入酶标孔，反应30min，每孔加入20μL 10％氯化钠溶液终止，反应10min，肉眼观察，当200μL胶体金加入6μL 0.01mol/L的K

胶体金标记兔抗鸭IgG抗体最适抗体量的选择方法如下：

4.2胶体金标记兔抗鸭IgG抗体最适抗体量的选择

按下表将各物品加入酶标孔，反应30min，每孔加入20μL 10％氯化钠溶液终止，反应10min，肉眼观察，当200μL胶体金加入4μL 2mg/mL的兔抗鸭IgG抗体时，标记物达到饱和状态。据此，确定200μL胶体金标记兔抗鸭IgG抗体的最适量为8μg，实际应用时，将兔抗鸭IgG抗体增加25％，即1mL胶体金标记的兔抗鸭IgG抗体为50μg。

通过上述筛选结果可知，最终确定胶体金标记兔抗鸭IgG抗体最适pH值为8.5，1mL胶体金标记的兔抗鸭IgG抗体为50μg。本发明实施例2中的步骤2.2胶体金标记采用了上述最适pH值以及最适抗体量。

重组多杀性巴氏杆菌脂蛋白B的最佳浓度筛选方法如下：

4.3重组多杀性巴氏杆菌脂蛋白B的浓度筛选

4.3.1样品垫的制备

将样品垫浸泡于封闭液(含10g/L的BSA、1％(v/v)吐温20的pH 7.4 0.01mol/L的PBS)中30min，取出后在37℃干燥箱烘干过夜。

4.3.2金标垫的制备

将空白SB08结合垫于封闭液中浸泡30min，37℃干燥箱烘干过夜，将标记好的金标兔抗鸭IgG抗体稀释3倍，按10μL/cm喷涂于封闭好的结合垫上，37℃干燥箱烘干过夜。

4.3.3T线制备

用喷膜系统将0.6、0.5、0.4、0.3、0.2mg/mL的重组多杀性巴氏杆菌脂蛋白B，按1μL/cm喷涂于NC膜上的检测线(T)，37℃干燥箱烘干过夜。

4.3.4组装

将样品垫、制备好的金标垫、NC膜和吸水纸依次粘贴于PVC底板上，切割成4mm宽的试纸条，常温保存。

4.3.5检测

取鸭抗多杀性巴氏杆菌血清5份、阴性鸭血清5份，各往样品垫中加入50μL，3min后肉眼观察，重组多杀性巴氏杆菌脂蛋白B为0.3mg/mL时，检测鸭抗多杀性巴氏杆菌血清的T线显色最明显，检测阴性鸭血清的T线均不显色。

羊抗兔IgG抗体的浓度筛选方法如下：

4.4羊抗兔IgG抗体的浓度筛选

4.4.1样品垫和金标垫的制备：同步骤4.3.1和步骤4.3.2。

4.4.2C线制备

用喷膜系统将1.0、0.8、0.4、0.2、0.1mg/mL的羊抗兔IgG抗体，按1μL/cm喷涂于NC膜上的质控(C)，37℃干燥箱烘干过夜。

4.4.3组装

将样品垫、制备好的金标垫、NC膜和吸水纸依次粘贴于PVC底板上，切割成4mm宽的试纸条，常温保存。

4.4.4检测

取鸭抗多杀性巴氏杆菌血清5份、阴性鸭血清5份，各往样品垫中加入50μL，3min后肉眼观察，羊抗兔IgG抗体为0.2mg/mL时，所有血清样品的C线显色最明显。

通过上述筛选结果可知，重组多杀性巴氏杆菌脂蛋白B的最佳浓度为0.3mg/mL，羊抗兔IgG抗体的最佳浓度为0.2mg/mL。实施例3中的步骤3.3采用了上述最佳的重组多杀性巴氏杆菌脂蛋白B浓度以及最佳的羊抗兔IgG抗体浓度。

实施例5：胶体金试纸条的特异性研究

用制备的胶体金试纸条检测，鸭抗多杀性巴氏杆菌血清的检测结果为阳性；鸭抗大肠杆菌血清、鸭抗鸭疫里默氏菌血清、鸭抗沙门氏菌血清、鸭抗禽流感病毒血清、鸭抗鸭瘟病毒血清，检测结果全为阴性。

实施例6：胶体金试纸条的重复性研究

同一批次的3根试纸条对同一份鸭抗多杀性巴氏杆菌血清的检测结果均为阳性；3个批次的试纸条各取1根，对同一份鸭抗多杀性巴氏杆菌血清的检测结果均为阳性。

实施例7：胶体金试纸条与间接ELISA、琼脂扩散试验的符合性研究

采集不同鸭场的血清样品48份，分别用琼脂扩散试验、胶体金试纸条、ELISA进行检测，结果见表1，结果显示，琼扩法阳性25份、阴性23份；试纸法阳性31份、阴性17份；ELISA阳性33份、阴性15份。从中可以看出，ELISA阴性的样品，试纸法检测结果全为阴性，说明试纸法没有假阳性结果。试纸法阳性的样品，ELISA检测均为阳性，说明试纸法检测正确。琼扩法为阴性而试纸法检测为阳性的1份血清，ELISA检测为阳性，说明试纸法比琼扩法更敏感。

表1临床鸭血清抗多杀性巴氏杆菌抗体的检测结果

上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种用于鸭血清中多杀性巴氏杆菌抗体检测的胶体金试纸条及其制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 771

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtaaggatg ataagccggc agcagcagcc gccccgcagg aacctgctgc tcgtaaactg 60

accgttggcg tgatgaccgg tgcagaagcc caggttaccg aagttgccgc caaaattgca 120

aaagaaaaat ataatatcga cgtgaagctg gttgaattca ctgaatatac ccagccgaat 180

gatgccctga ccaaaggcga tctggatgca aatgcctttc agcataaacc gtatatggat 240

aaagaagttg aacagcgtgg ctataaactg gccattgtgg gcaatacctt tgtttttccg 300

attgccgcct atagtaaaaa gattaagaat gttagcgagc tgcaggatgg cgcaaccgtt 360

gcagtgccga ataatccgag caatctgggc cgcgcactgc tgctgctgga aaaacagggt 420

ctgattaagc tgaaagatcc gagtaatctg tttagtacca gcattgatgt tattgaaaac 480

ccgaaaaatc tgcagattaa ggaagtggaa ggcagtctgc tgccgcgcat gctggatgat 540

gtggattttg caattattaa taacaactac gcggtgcagc agggtctgac cgcagaaaaa 600

gatggtattt ttgttgaaga taaggacagt ccgtatgtta atctggtggt gagtcgtgaa 660

gataataagg ataatgaagc aattaaggac ttcgttaaag catttcagac cgaagaagtt 720

tatcaggaag cactgaaaca ttttcagggc ggcgttgtga aaggctggta a 771

<210> 2

<211> 256

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Cys Lys Asp Asp Lys Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro Gln Glu Pro Ala

1 5 10 15

Ala Arg Lys Leu Thr Val Gly Val Met Thr Gly Ala Glu Ala Gln Val

20 25 30

Thr Glu Val Ala Ala Lys Ile Ala Lys Glu Lys Tyr Asn Ile Asp Val

35 40 45

Lys Leu Val Glu Phe Thr Glu Tyr Thr Gln Pro Asn Asp Ala Leu Thr

50 55 60

Lys Gly Asp Leu Asp Ala Asn Ala Phe Gln His Lys Pro Tyr Met Asp

65 70 75 80

Lys Glu Val Glu Gln Arg Gly Tyr Lys Leu Ala Ile Val Gly Asn Thr

85 90 95

Phe Val Phe Pro Ile Ala Ala Tyr Ser Lys Lys Ile Lys Asn Val Ser

100 105 110

Glu Leu Gln Asp Gly Ala Thr Val Ala Val Pro Asn Asn Pro Ser Asn

115 120 125

Leu Gly Arg Ala Leu Leu Leu Leu Glu Lys Gln Gly Leu Ile Lys Leu

130 135 140

Lys Asp Pro Ser Asn Leu Phe Ser Thr Ser Ile Asp Val Ile Glu Asn

145 150 155 160

Pro Lys Asn Leu Gln Ile Lys Glu Val Glu Gly Ser Leu Leu Pro Arg

165 170 175

Met Leu Asp Asp Val Asp Phe Ala Ile Ile Asn Asn Asn Tyr Ala Val

180 185 190

Gln Gln Gly Leu Thr Ala Glu Lys Asp Gly Ile Phe Val Glu Asp Lys

195 200 205

Asp Ser Pro Tyr Val Asn Leu Val Val Ser Arg Glu Asp Asn Lys Asp

210 215 220

Asn Glu Ala Ile Lys Asp Phe Val Lys Ala Phe Gln Thr Glu Glu Val

225 230 235 240

Tyr Gln Glu Ala Leu Lys His Phe Gln Gly Gly Val Val Lys Gly Trp

245 250 255