一株产布雷菲德菌素A的毛黄堇内生真菌及其应用

摘要

本发明公开了一株产布雷菲德菌素A(brefeldin A，BFA)的毛黄堇内生真菌，它是从罂粟科紫堇属植物毛黄堇(Corydalis tomentellaFranch.)植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为Dactylonectria alcacerensis CT‑6。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年10月20日，保藏编号为CGMCC No.23290。本发明应用毛黄堇内生真菌菌株Dactylonectria alcacerensis CT‑6大米培养基固体发酵产生了BFA，是寻找BFA新资源的重要微生物。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株产布雷菲德菌素A的毛黄堇内生真菌及其应用。

背景技术

植物内生真菌是指存在于健康植物根茎叶等组织部位内部，不会对宿主植物造成明显伤害或者引起宿主植物组织明显病症的真菌。植物内生真菌能够产生很多结构多样且具有广泛生物活性的次生代谢产物。因此，植物内生真菌已成为寻找活性天然产物的重要来源，能够为新药研发提供更多的先导化合物或候选药物。

BFA是一种天然的大环内酯类抗生素，能有效抑制蛋白质由内质网向高尔基体的转运过程，是一种广泛应用于哺乳动物信号传导研究的分子工具。最早由Singleton等从Penicillium decumben发酵液中分离得到。BFA具有抗真菌、抗病毒、抗有丝分裂、抗肿瘤等生物学活性，BFA及其衍生物是重要的抗肿瘤候选药。

目前，已有报道青霉属(Penicillium)、壳二孢属(Ascochyta)、棒曲霉(Aspergillus)、分支孢属(Cladosporium)、链格孢菌属(Alternaria)、拟青霉(Paecilomyces)、茎点霉属(Phoma)、踝节菌属(Talaromyces)、布雷正青霉属(Eupenicillium)、曲霉属(Aspergillus)等真菌均能产生BFA。但目前报道的微生物发酵产生BFA的产量较低。

发明内容

1.要解决的技术问题

本发明的目的是为了解决现有技术中目前报道的微生物发酵产生BFA产量较低的问题，而提出的一株产布雷菲德菌素A的毛黄堇内生真菌及其应用。

2.技术方案

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一株产布雷菲德菌素A的毛黄堇内生真菌，其命名为Dactylonectriaalcacerensis CT-6，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年10月20日，保藏编号为CGMCC No.23290。

本发明还提供了一种毛黄堇内生真菌Dactylonectria alcacerensis CT-6的应用，利用所述的毛黄堇内生真菌制备BFA。

本发明还提供了一种毛黄堇内生真菌Dactylonectria alcacerensis CT-6制备BFA的方法，该制备方法包括下列步骤：

1)取本发明的毛黄堇内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体PDA培养基试管，活化培养7天。

2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体培PDA种子培养基中，培养5天，得种子。

3)配制好的大米培养基121℃灭菌处理30分钟，冷却备用。无菌条件下，按照50ml/瓶的接种量接种入种子液，并用镊子搅拌大米培养基使种子液与其充分混匀，室温放置培养40天。

4)将上述培养物每瓶加入300ml乙酸乙酯超声提取1小时，重复3次，合并浓缩乙酸乙酯提取液得乙酸乙酯粗提物。

5)将上述粗提物采用中压制备正相硅胶柱色谱法分离，先后使用一定体积比的石油醚/乙酸乙酯溶剂系统和一定体积比的乙酸乙酯/甲醇溶剂系统进行洗脱，收集5:1和3:1乙酸乙酯/甲醇溶剂洗脱液浓缩，丙酮溶解过夜即得95-99％的BFA晶体。

优选地，所述步骤1中菌丝在已灭菌的固体PDA培养基试管中，于26±1℃温度环境中活化培养7天。

优选地，所述步骤2中液体培PDA种子培养基在26±1℃下180rpm的摇床中培养5天。

优选地，所述步骤3中大米培养基包括500ml三角烧瓶中含大米150g，蛋白胨1.5g，自来水150ml。

优选地，所述步骤5中石油醚/乙酸乙酯溶剂系统的体积比为10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5(v/v)。

优选地，所述步骤5中乙酸乙酯/甲醇溶剂系统的体积比为5:1、3:1、1:1、1:3(v/v)。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的优点在于：

本发明中，毛黄堇内生真菌，通过菌株大米培养基发酵能够高效产生BFA，是寻找BFA新资源的重要微生物，具有较大的应用价值。

附图说明

图1为布雷菲德菌素A(brefeldin A，BFA)的化学结构；

图2为本发明所述毛黄堇内生真菌基于ITS基因序列构建的系统进化树；

图3为本发明所述毛黄堇内生真菌在PDA平板培养基上的形态；

图4为本发明所述毛黄堇内生真菌在PDB液体培养基中的形态；

图5为本发明所述毛黄堇内生真菌产生的BFA的ESIMS图；

图6为本发明所述毛黄堇内生真菌产生的BFA的

图7为本发明所述毛黄堇内生真菌产生的BFA的

图8为本发明所述毛黄堇内生真菌产生的BFA的DEPT(DMSO)光谱图；

图9为本发明所述毛黄堇内生真菌产生的BFA的HSQC(DMSO)光谱图；

图10为本发明所述毛黄堇内生真菌产生的BFA的HMBC(DMSO)光谱图；

图11为本发明所述毛黄堇内生真菌产生的BFA的H-H COSY(DMSO)光谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1：

参考图1-11，一株产布雷菲德菌素A的毛黄堇内生真菌，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏日期为2021年10月20日，保藏编号为CGMCC No.23290。

本发明中，毛黄堇内生真菌的ITS和5.8S rDNA碱基序列为：

CCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCTATTTGTTGCCTCGGCGGTGCCTGTTCCGACAGCCCGCCAGAGGACCCCAAACCCTGATTACATTTAAGAAGTCTTCTGAGTAAACCGATTAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCTAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCCCGGGCTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGCCTCCGCGCCCGCCGTCCCCTAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGTAGCTTCCTCTGCGTAGTAACACACCTCCCACTGGGAAACAACGCGGCCACGCCGTTAAACCCCCGACTTCTGAACGT。

本发明中，BLAST比对分析结果显示，菌株CT-6与Dactylonectriaalcacerensis同源性最高，达100％。进化树分析(图2)结果显示，CT-6与4株Dactylonectria属的真菌聚为一大支，与菌株Dactylonectria alcacerensis(NR121498)聚为一小支。综上，将CT-6鉴定为Dactylonectria alcacerensis。

本发明中，毛黄堇内生真菌DactylonectriaalcacerensisCT-6的应用，利用所述的毛黄堇内生真菌制备BFA。

本发明中，毛黄堇内生真菌，经大米培养基发酵可得BFA，其工艺步骤如下：

菌种活化→种子培养→发酵培养→乙酸乙酯超声提取→减压浓缩→硅胶柱色谱法分离→5:1和3:1乙酸乙酯/甲醇溶剂洗脱液浓缩→丙酮溶解过夜→BFA晶体。

本发明中，一种毛黄堇内生真菌Dactylonectria alcacerensisCT-6制备BFA的方法，该制备方法包括下列步骤：

1)取本发明的毛黄堇内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体PDA培养基试管，于26±1℃活化培养7天(图3)。

2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体培PDA种子培养基中，26±1℃下180rpm摇床培养5天，得种子(图4)。

3)配制好的大米培养基(500ml三角烧瓶中含大米150g，蛋白胨1.5g，自来水150ml)121℃灭菌处理30分钟，冷却备用。无菌条件下，按照50ml/瓶的接种量接种入种子液，并用镊子搅拌大米培养基使种子液与其充分混匀，共计40瓶，室温放置培养40天。

4)将上述培养物每瓶加入300ml乙酸乙酯超声提取1小时，重复3次，合并浓缩乙酸乙酯提取液得乙酸乙酯粗提物(113.25g)。

5)将上述粗提物采用中压制备正相硅胶柱色谱法分离，先后使用10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5(v/v)石油醚/乙酸乙酯溶剂系统和5:1、3:1、1:1、1:3(v/v)乙酸乙酯/甲醇溶剂系统进行洗脱，收集5:1和3:1乙酸乙酯/甲醇溶剂洗脱液浓缩得BFA富集部位(16.72g)，将富集部位丙酮溶解过夜结晶，即得95-99％的BFA晶体(12.71g)。

本发明中，BFA的结构鉴定：无色晶体，ESI-MS(图5)给出m/z281.5[M+H]

表1 BFA的NMR信号归属及特征(DMSO)

本发明中，毛黄堇内生真菌，通过菌株大米培养基发酵能够高效产生BFA，是寻找BFA新资源的重要微生物，具有较大的应用价值。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。