一种pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料及其制备方法与在早期肾病诊断中的应用

摘要

本发明公开了一种pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料及其制备方法与在早期肾病诊断中的应用。该方法为：将氯金酸与pH敏感型配体在室温下搅拌混匀，加入硼氢化钠，搅拌，离心，透析，得到pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料。本发明将pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料应用于代谢性酸/碱中毒引起的肾损伤的早期诊断，与目前常用对血液和尿液中生物标志物的检测方法相比，具有较低的背景干扰和快速灵敏的诊断效果。该制备方法简单，成本低，易于工业化生产。此外，由于近红外二区发光纳米材料的高穿透力、低组织吸收、高分辨率的特点，此pH诱导自组装金纳米材料在深层次肿瘤成像、疾病诊断等方面具有较大的优势。

说明书

技术领域

本发明属于功能光学纳米材料领域，具体涉及pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料的制备及在早期肾病诊断方面的应用方法。

背景技术

肾脏是人体的重要器官，它通过产生尿液清除体内代谢产物及某些废物、毒物，同时经重吸收功能保留水分及其他有用物质，如葡萄糖、蛋白质、氨基酸、钠离子、钾离子、碳酸氢钠等，以调节水、电解质平衡及维护体内酸碱平衡。肾脏的代谢紊乱会造成肾单位严重损伤，以及肾实质性不可逆转的功能损害，从而产生临床上以蛋白质代谢产物潴留，水、电解质及酸碱平衡失调和体内各种毒物排泄障碍，出现全身一系列中毒症状。然而，代谢性酸中毒是最常见的一种酸碱平衡紊乱，其表现为细胞外液H

随着纳米科学技术的高速发展，纳米颗粒被广泛应用于生物医学领域。超小尺寸的发光金纳米粒子(d＜3nm)因其具有连续可调的光学性质、表面易功能化修饰、良好的生物相容性等特点，它被开发成为一类新型的荧光探针，在细胞成像与疾病诊断等生物成像领域应用较广。然而，在发展高性能的生物成像技术的方法中，面临着最大的挑战是如何实现荧光探针的高时空、空间分辨以及高灵敏度。利用可见光-近红外一区(Vis-NIR-I)成像会受到其穿透深度的限制，难以实现深层次、高分辨的成像。而在近红外二区(NIR-II,1000-1700nm)不仅具有较深的穿透能力和高的空间分辨率，同时能够有效的减少光子散射、组织吸收以及自发荧光的干扰，实现高分辨、高对比度的荧光成像，其在生物成像、疾病诊断领域展现出巨大潜力。因此，通过表面化学调控策略，设计智能型NIR-II发光的金纳米探针，发展多功能的动态影像成像技术，用于开发对代谢性酸/碱中毒引起的肾损伤的早期诊断方法具有十分重要的意义。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明提供了pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料的制备及在早期肾病诊断方面的应用方法。本发明提供的pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料具有近红外二区发光性质，可用于由代谢性酸/碱中毒引起的肾损伤早期诊断的研究，可通过二区荧光成像仪实时观察材料在肾脏部位滞留时间及清除速率；并且，由于近红外二区纳米材料的高穿透力、低组织吸收、高分辨率的特点，这种生物安全性良好的pH诱导自组装近红外二区发光的金纳米材料在由代谢性酸/碱中毒引起的肾损伤早期诊断等方面具有较大的优势。

本发明的目的通过如下技术方案来实现。

针对pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料的制备方法，包括以下过程：

首先是pH响应型配体的合成，将β-巯基乙胺(CA)与2,3-二甲基马来酸酐(DMA)溶解于DMSO，然后在氮气的保护下加入三乙胺和吡啶，室温下搅拌反应24h，反应完后的溶液通过乙醚沉淀，然后过滤，透析纯化，最后冻干得到产物(pH响应型配体CA-DMA)。

将氯金酸水溶液与pH响应型配体在室温下搅拌反应0.5h，反应液颜色由浅黄色变为无色时，在冰浴下加入还原剂硼氢化钠溶液，搅拌反应，溶液颜色变为棕黄色，停止反应，然后离心去除大颗粒，透析去除多余的未反应物，最后超滤浓缩，得到pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料，并置于4℃冰箱中保存。

进一步的：所述pH响应型配体为CA-DMA，其结构中含有酰胺键(-CO-NH-)，且在β位点上有羧基，因而配体CA-DMA在pH小于6.8时，酰胺键会断裂，具有pH响应特性。

进一步地，pH响应型配体是由β-巯基乙胺(CA)与2,3-二甲基马来酸酐(DMA)合成，具有pH响应特性。

进一步的：所述还原剂为：硼氢化钠。

进一步的：所述氯金酸、pH响应型配体混合得到的反应溶液中，氯金酸与pH响应型配体的物质的量之比为1:4至1:8；氯金酸与硼氢化钠的物质的量之比为1:0.1至1:2.0。

进一步的：所述加入硼氢化钠反应中pH为10～12，反应温度为18-30℃，反应时间为1-3d，所述近红外二区发光金纳米材料为单分散性纳米粒子，单颗金纳米粒子粒径为1.5-2.1nm。

进一步的：所述反应完透析液pH为8-11，透析时间为2-4天，所述超滤浓缩使用超滤管的膜孔径为3-50kDa。

进一步的：所述合成的近红外二区发光金纳米材料分别在pH为6.6、7.4、10.5以及37℃条件下孵育12h，并测量其水合粒径。

进一步的：所述合成的近红外二区发光金纳米材料分别在pH为6.6、7.4、10.5以及37℃条件下孵育12h，并用透射电子显微镜(TEM)观察其形貌。

进一步的：选用Balb/c雌鼠，4-6周龄，将近红外二区发光金纳米材料通过尾静脉注射到小鼠体内，注射浓度为0.5-10μM，6h或7d后处死，收集小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要器官，通过浓王水消解定容后，最后用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)检测材料在各个器官中的分布情况。

进一步的：构建小鼠代谢性酸/碱中毒导致的早期肾损伤模型，选用Balb/c雌性小鼠，4-6周龄。对照组：给小鼠喂食含有5％的蔗糖水溶液7-10d，每天监测其尿液pH变化情况；实验组：代谢性酸中毒，给小鼠喂食含有0.25M NH

由以上所述制备方法得到pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料用于代谢性酸/碱中毒引起的肾损伤早期诊断的方法，包括以下步骤：将近红外二区发光金纳米材料通过尾静脉注射到正常小鼠(对照组)体内，然后通过二区荧光成像仪观察小鼠肾脏部位荧光强度变化及成像效果；以及将近红外二区发光金纳米材料通过尾静脉注射到代谢性酸/碱中毒的小鼠(实验组)体内，然后通过二区荧光成像仪观察小鼠肾脏部位荧光强度变化及成像效果。对以上成像结果进行分析。

本发明合成的pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料在不同的生理环境下(酸性/碱性)具有不同的聚集状态，可以通过二区荧光仪进行活体成像分析，具有较高的识别度和分辨率。此外，由于近红外二区发光纳米材料的高穿透力、低组织吸收以及低的背景干扰等特点，这种生物安全性良好的近红外二区发光的金纳米材料在由代谢性酸/碱中毒引起的肾损伤的早期诊断方面具有较大的优势。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

(1)本发明合成的pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料，合成工艺简单，成本低廉，易于工业化生产。

(2)本发明合成的pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料生物相容性好，毒性低，荧光背景干扰低，信噪比高。

(3)本发明合成的pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料，可通过二区荧光仪成像诊断代谢性酸/碱中毒引起的肾损伤疾病模型，具有操作简单，耗时短，检测灵敏度高。

附图说明

图1为实施例1中pH响应型配体CA-DMA的高分辨质谱图。

图2为实施例2中合成的近红外二区发光金纳米材料的紫外-可见吸收光谱图。

图3为实施例2中合成的近红外二区发光金纳米材料的二区荧光发射光谱图。

图4为实施例2中近红外二区发光金纳米材料在不同pH条件下的水合粒径统计图。

图5为实施例2中近红外二区发光金纳米材料在pH为10.5时的TEM图。

图6为实施例2中近红外二区发光金纳米材料在pH～7.4时的TEM图。

图7为实施例2中近红外二区发光金纳米材料在pH～6.6时的TEM。

图8为实施例3中近红外二区发光金纳米材料在小鼠体内的药代动力学曲线图

图9为实施例4中近红外二区发光金纳米材料在小鼠体内6h的生物分布图。

图10为实施例4中近红外二区发光金纳米材料在小鼠体内7d的生物分布图。

图11为实施例4中近红外二区发光金纳米材料在小鼠体内的代谢路径结果。

图12为实施例5中近红外二区发光金纳米材料用于代谢性酸/碱中毒导致肾损伤的小鼠的荧光成像图。

具体实施方式

以下结合具体实施例及附图对本发明技术方案作进一步详细的描述，但本发明的保护范围及实施方式不限于此。

在以下具体实施例中，所涉及的到的氯金酸和β-巯基乙胺以及2,3-二甲基马来酸酐均购买于上海迈瑞尔化学技术有限公司。观察pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料性质及其在由代谢性酸/碱中毒引起的肾损伤早期诊断等方面的仪器主要包含英国Malvern纳米粒度仪(Zetasizer ULTRA)、美国Thermo Fisher场发射透射电子显微镜(Talos F200x)、美国Chronos DFD瞬态光谱仪(ISS)、近红外二区荧光活体成像系统(NIRCAM)以及美国Thermo Scientific电感耦合等离子体质谱仪(iCAP RQ)等。

实施例1

本发明制备用于合成pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料的pH敏感型配体的最优实施方案如下：在室温条件下，将135.0mgβ-巯基乙胺(CA)与441.3mg 2,3-二甲基马来酸酐(DMA)溶解于13mL DMSO中，然后在氮气保护下加入1.2mL三乙胺和1.2mL吡啶，室温下搅拌反应24h，反应完后的溶液通过乙醚沉淀，然后过滤，透析去除多余未反应的小分子，透析的去离子水溶液的pH维持在8-10之间，最后冻干得到产物(pH响应型配体CA-DMA)。

图1为pH响应型配体CA-DMA的高分辨质谱图，结果表明配体已成功合成，且纯度较高。

实施例2

本发明制备pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料的最优实施方案如下：在室温条件下，在装有3.78mL去离子水的反应瓶中加入20μL NaOH溶液(5M)，随后依次加入175.4μL pH响应型配体CA-DMA(114.0mM)和19.7μL氯金酸(203.4mM)，室温下搅拌30min(1000rpm)，溶液由浅黄色变为无色透明时，加入20μL硼氢化钠(100mM)，常温下搅拌反应2d后，停止反应，然后在21000rpm下离心10min去除大颗粒，再用10kDa的透析袋透析纯化，pH维持在8-10之间，透析2-4天。最后，超滤浓缩得到目标产物，并放入4℃冰箱中保存备用。

考察本实施案例中制得的近红外二区发光金纳米材料在不同pH条件下的形貌及自组装程度：

(1)在pH为10.5条件下的形貌及自组装程度研究

取2μM 50μL以上合成的近红外二区发光金纳米材料，加入DPBS溶液，随后调节溶液pH为10.5，并在37℃下孵育12h，然后用Malvern粒度仪检测其水合粒径，并用场发射透射电子显微镜观察其形貌。

(2)在pH为7.4条件下的形貌及自组装程度研究

取2μM 50μL以上合成的近红外二区发光金纳米材料，加入DPBS溶液，随后调节溶液pH为7.4，并在37℃下孵育12h，然后用Malvern粒度仪检测其水合粒径，并用场发射透射电子显微镜观察其形貌。

(3)在pH为6.6条件下的形貌及自组装程度研究

取2μM 50μL以上合成的pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料，加入DPBS溶液，随后调节溶液pH为6.6，并在37℃下孵育12h，然后用Malvern粒度仪检测其水合粒径，并用场发射透射电子显微镜观察其形貌。

图2为近红外二区发光金纳米材料的紫外-可见吸收光谱。

图3为近红外二区发光金纳米材料的二区荧光发射光谱，其在1030nm处有最大发射峰。

图4表示为近红外二区发光金纳米材料在不同pH条件下的水合粒径，在pH～10.5时，其水合粒径为2.5-3.4nm；在pH～7.4时，其水合粒径为21.0-28.2nm；在pH～6.6时，其水合粒径为750.5-840.2nm。

图5表示为近红外二区发光金纳米材料在pH～10.5时的TEM图，其粒径为1.5-2.1nm。

图6表示为近红外二区发光金纳米材料在pH～7.4时的TEM图，其粒径为1.5-2.1nm。

图7表示为近红外二区发光金纳米材料在pH～6.6时的TEM。结果表明在pH为6.6时，近红外二区发光金纳米材料会自组装形成大的组装体。

实施例3

本发明制备的pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料用于小鼠药代动力学研究的具体实施方案如下：将300μL以上制备的纳米材料(2μM)通过尾静脉注射到小鼠(Balb/c雌鼠，4-6周龄)体内，通过眼眶取血方式获得在不同时间点(2、5、10、30min、1、3、5、8、12、24、48和72h)的血液样本。取得的血液样本置于20mL玻璃瓶中，称重后，加入2-3mL新制王水，室温下消解12h。随后将样品在110℃油浴锅中加热至王水完全蒸干，再加入5mL5％王水(v/v)定容，超声30min至样品完全溶解，最后用0.22μm水相针式过滤器过滤，用ICP-MS测定样品中金离子的浓度。血液中纳米材料的浓度为％注射剂量/g(％ID/g)。

图8表示合成的近红外二区发光金纳米材料在小鼠体内的药代动力学曲线图，可以看出，发光金纳米材料在小鼠体内的分布半衰期为6.6±0.8min，清除半衰期为4.1±0.5h。。

实施例4

本发明制备的pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料用于小鼠生物分布及代谢路径研究的具体实施方案如下：从珠海百试通生物科技有限公司购买4-6周龄Balb/c雌性小白鼠，饲养于室温维持在25±2℃，12h光照/12h黑暗的环境中，自由进水和进食。所有动物实验程序均严格按照实验动物研究伦理委员会的规定执行。通过尾静脉将300μL以上制备的发光金纳米材料(2μM)注射入小鼠体内，分别于注射后的6h、7d收集小鼠的心(He)、肝(Li)、脾(Sp)、肺(Lu)、肾(Ki)、皮(Sk)、肉(Mu)、血(Bl)、胃(St)、肠(In)、脑(Br)、骨(Bo)、尾(Ta)等脏器和组织。称重后加入新制王水消解12h，高温蒸干王水后加入10mL 10％王水(v/v)定容，超声30min溶解样品。离心除去剩余组织，再用0.22μm水相针式过滤器过滤，样品中金离子的浓度用ICP-MS测得。

代谢路径研究：将300μL以上制备的纳米材料(2μM)通过尾静脉注射至雌性Balb/c小鼠体内，将小鼠放置于小动物代谢笼中饲养，保证充足的食物和饮用水。在设定的时间点(0.25、0.5、1、2、3、4、5、6和7d)收集小鼠的尿液和粪便，分别置于40mL洁净玻璃瓶中，将收集到的尿液和粪便用新制的浓王水消解后，高温蒸干王水后加入20mL 20％王水(v/v)定容，超声30min溶解样品，最后，用ICP-MS测定样品中金离子的含量。

图9表示合成的近红外二区发光金纳米材料在小鼠体内6h的生物分布情况。

图10表示合成的近红外二区发光金纳米材料在小鼠体内7d的生物分布情况。

图11表示合成的近红外二区发光金纳米材料在小鼠体内的代谢路径情况。

实施例5

本发明制备的pH诱导自组装的近红外二区发光金纳米材料用于代谢性酸/碱中毒引起的小鼠肾损伤早期诊断实验的具体实施方案如下：从珠海百试通生物科技有限公司购买4-6周龄Balb/c雌性小白鼠，饲养于室温维持在25±2℃，12h光照/12h黑暗的环境中，自由进水和进食。所有动物实验程序均严格按照实验动物研究伦理委员会的规定执行。进一步的：构建小鼠代谢性酸/碱中毒导致的早期肾损伤模型，对照组：给小鼠喂食含有5％的蔗糖水溶液7-10d，每天监测其尿液pH变化情况；实验组：代谢性酸中毒，给小鼠喂食含有0.25M NH

小鼠活体成像实验：对照组：将正常小鼠固定于黑色塑料板上，使用脱毛膏脱毛后，用蒸馏水轻拭小鼠表皮进行初步清洁，用二区荧光活体成像仪对其进行荧光成像，得到的图片作为小鼠自身的背景荧光。随后，通过尾静脉将200μL以上制备的纳米材料(5μM)注射入小鼠体内，利用二区荧光活体成像仪对小鼠肾脏部位荧光强度变化及成像效果进行分析。小鼠拍照条件：激发波长为808nm，曝光时间为1s；实验组：将代谢性酸/碱中毒导致肾损伤的小鼠固定于黑色塑料板上，使用脱毛膏脱毛后，用蒸馏水轻拭小鼠表皮，用二区荧光活体成像仪对其进行荧光成像，得到的图片作为小鼠自身的背景荧光。通过尾静脉将200μL以上制备的纳米材料(5μM)注射入小鼠体内，通过二区荧光活体成像仪对小鼠肾脏部位荧光强度变化及成像效果进行分析。小鼠拍照条件：激发波长为808nm，曝光时间为1s。

图12表示合成的近红外二区发光金纳米材料用于代谢性酸/碱中毒导致肾损伤的小鼠的荧光成像图。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。