用于检测生物样品中严重急性呼吸综合征冠状病毒2的存在的方法

摘要

本发明涉及一种用于检测生物样品中SARS‑CoV‑2的存在的方法，包括：将所述生物样品进行裂解以形成裂解物；通过在正向引物、反向引物和分子信标存在的情况下对裂解物中的靶核酸序列进行基于核酸序列(NASBA)的扩增来生成扩增裂解物，所述正向引物具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:17的寡核苷酸序列；所述反向引物具有选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:18的寡核苷酸序列；所述分子信标具有选自SEQID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:19的寡核苷酸序列和荧光团；将扩增裂解物暴露于激发源；检测暴露于激发源的扩增裂解物中荧光团的荧光；响应于检测荧光团的荧光，确定SARS‑CoV‑2是否存在于所述生物样品中。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2020年4月29日提交的美国临时专利申请号63/017043和2020年8月10日提交的美国临时专利申请号63/063731的优先权，本申请是2020年9月4日提交的PCT国际专利申请PCT/US20/49394的部分继续申请，PCT国际专利申请PCT/US20/49394要求2019年9月6日提交的美国临时专利申请号62/897057的优先权，它们的公开内容以全文引用的方式并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及用于识别病原微生物的方法。更具体地，本发明涉及，例如，用于经由特定RNA序列的基于核酸序列的扩增(NASBA)在生物样品中实时识别病原微生物和/或其抗生素抗性的方法。

背景技术

导致Covid 19的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是全球感染的原因，并且目前被分类为流行病。虽然Covid 19发病率和死亡率的完全范围可能永远无人知晓，但是目前被估计为在全世界有数百万。由于无症状病毒携带者不知不觉地扩散病毒极为普遍，因此降低SARS-CoV-2病毒扩散的一个重要工具是快速且可靠的检测。虽然存在一些现有的检测，但这些可能需要数天来提供结果。这种在结果方面的长延迟能够允许发生另外的感染。

因此，仍然需要快速且灵敏的方法，优选地需要最少的或不需要样品制备，用于检测病原体相关分析物的存在，以识别SARS-CoV-2和随后诊断Covid-19。

发明内容

通过本发明，在很大程度上满足上述需要，其中提供了裂解溶液和Covid-19检测系统的各方面。

本公开的一个方面涉及一种用于检测生物样品中严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的存在的方法，所述方法包括以下步骤：将所述生物样品进行裂解以形成裂解物；通过在正向引物、反向引物和分子信标存在的情况下对裂解物中的靶核酸序列进行基于核酸序列(NASBA)的扩增来生成扩增裂解物。所述正向引物具有选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:17组成的组的寡核苷酸序列。所述反向引物具有选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:18组成的组的寡核苷酸序列。所述分子信标具有选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQID NO:11、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:19组成的组的寡核苷酸序列和荧光团。扩增裂解物暴露于激发源。检测暴露于激发源的扩增裂解物中荧光团的荧光。响应于检测荧光团的荧光，确定SARS-CoV-2是否存在于所述生物样品中。

因此已经相当广泛地概述了本发明的某些实施例，以便可以更好地理解本发明中的详细描述，并且可以更好地理解对本领域的当前贡献。当然，本发明的其他实施例将在下面描述并且将形成所附权利要求的主题。

在这方面，在详细解释本发明的至少一个实施例之前，应当理解，本发明在其应用中不限于在以下描述中阐述或在附图中示出的构造细节和部件布置。除了所描述的那些实施例之外，本发明还能够有其他实施例，并且能够以各种方式实践和执行。此外，应当理解的是，本申请所采用的措辞和术语以及摘要是为了描述的目的，而不应被认为是限制性的。

因此，本领域技术人员将理解，本申请所基于的概念可以容易地用作设计用于实现本发明的若干目的的其他结构、方法和系统的基础。因此，重要的是，权利要求被认为包括这样的等同构造，只要它们不脱离本发明的精神和范围。

附图说明

为了可以容易地理解本发明，通过附图中的示例的方式示出了本发明的各方面；然而，本发明的主题不限于所公开的方面。

图1示出了根据本发明的方面的示意性感染检测系统。

参照附图描述根据本发明的方面的感染检测系统的特征，其中相同的附图标记始终表示相同的部分。

具体实施方式

本公开的一个方面涉及一种用于检测生物样品中严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的存在的方法，所述方法包括以下步骤：将所述生物样品进行裂解以形成裂解物；通过在正向引物、反向引物和分子信标存在的情况下对裂解物中的靶核酸序列进行基于核酸序列(NASBA)的扩增来生成扩增裂解物。所述正向引物具有选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:17组成的组的寡核苷酸序列。所述反向引物具有选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:18组成的组的寡核苷酸序列。所述分子信标具有选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQID NO:11、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:19组成的组的寡核苷酸序列和荧光团。扩增裂解物暴露于激发源。检测暴露于激发源的扩增裂解物中荧光团的荧光。响应于检测荧光团的荧光，确定SARS-CoV-2是否存在于所述生物样品中。

图1示出了根据本发明的方面的示例性SARS-CoV-2感染检测系统10的示意图。SARS-Co V-2感染检测系统被配置成处理样品并确定所述样品是否含有一个或多个预定病原体。根据本发明的实施方式的SARS-CoV-2感染检测系统包括采样装置20、裂解室30、过滤器40、计量器50、基于核酸序列的(NASBA)流体网络60和仪器70。SARS-CoV-2感染检测系统还包括样品处理器80，诸如盒，其至少包括NASBA流体网络并且可以包括裂解室、过滤器和计量器中的任一个或全部。所述样本处理器配置为连接到所述采样装置且接收及处理包含于所述采样装置内的样本。样品处理器可以是一次性的和可替换的，并且可以适于使用至少一个NASBA测定处理所收集的样品。SARS-CoV-2感染检测系统可迅速例如在一小时、30分钟或更短时间内处理样品并确定样品是否含有一个或多个预定病原体。SARS-CoV-2感染检测系统可以在护理点(例如在与患者相同的建筑物、房间等内)处理样本并确定样本是否包含一个或多个预定病原体。因此，SARS-CoV-2感染检测系统消除了浪费时间的中间处理、存储和/或采样装置的外来传输的需要。根据本发明的方面，整个样品处理可以发生在SARS-CoV-2感染检测系统的各种部件内，从而消除了在收集样品之后对样品进行直接用户干预的需要。因此，SARS-CoV-2感染检测系统可以由低技能的用户使用，并且可以容易地运输到并应用到各种环境中(例如，家庭、医院房间等)。因此，可以快速地检测和识别患者中的感染，这可以改善患者的预后。

在一些实施方式中，SARS-CoV-2感染检测系统的采样装置可与疾病控制中心(CDC)推荐的商用RNA提取试剂盒(或类似物)结合使用。SARS-CoV-2感染检测系统的采样装置可适用于收集样本，例如鼻咽拭子、唾液、痰、血液(例如全血)、尿液、粪便、化脓/脓等。如本申请中所用，“血液”是指直接从患者身上抽取的血液，血浆、血小板或病原体等任何成分均未从中去除。采样装置可以从医疗装置(未示出)收集样本。例如，采样装置可暴露于医疗装置中的内部空间或内腔的预定和/或延长的时间段，以便收集可在所述空间和/或内腔中形成的任何病原体的样本。医疗装置可以是用于治疗患者的外部通信装置，诸如Foley导管、血管导管、抽吸导管、支气管窥镜、排尿管线、呼吸抽吸导管、支气管肺泡灌洗导管等。采样装置可以附加地或可替代地适于直接从诸如鼻咽拭子、唾液、痰、尿液、粪便、化脓/脓、疑似感染部位(例如手术敷料、伤口和/或插入点)的样本源收集样本。采样装置可以附加地或可替代地适于通过静脉内、皮下或骨内收集样品。采样装置可以是一次性的并且是可替换的。根据本发明的方面，采样装置可以包括样品收集管。样品收集管可以是容纳全血样品的标准血液收集真空管。附加地或替代地，采样装置可以是容纳全血样品的标准注射器。

取决于样品的来源，任选地进行裂解样品。例如，诸如鼻咽拭子和/或唾液的一些样品可能不需要裂解。如果执行裂解，则裂解室可以是被配置成接收样品并将样品裂解成裂解物的任何室。裂解室可与采样装置流体连通。如本申请所使用的，流体连通可以意味着所讨论的结构经由诸如管道、导管等的多个结构中的任何一个流体地连接，这些结构允许流体从一个结构行进到另一个结构。在本发明的实施例中，从采样装置到裂解室的样品的流动可以可操作地连接到仪器，并且可以由仪器控制和/或驱动。贯穿本公开，参考控制和/或驱动流体流动的仪器，例如从采样装置到裂解室的样品的流动。当可操作地连接到流体路径并且经由任何数量的已知流体控制系统(其可以例如包括泵、阀、管道等)可操作地连接时，仪器可以控制和/或驱动流体流动。此外，该仪器可以在不与流体物理接触的情况下控制和/或驱动流体流动。因此，样品收集器和/或样品处理器可以被设置和替换，而仪器可以重复地使用而不污染样品。

裂解室可包括用于裂解包含在其中的样品和病原体细胞并用于提取和纯化病原体信使RNA(即，溶解靶标m RNA并去除可能干扰核酸扩增的抑制剂)的所有材料。例如，裂解室可包括裂解剂，例如冻干的Acris裂解化学品，裂解剂被配置为将样品裂解成裂解物。另外或替代地，裂解室可通过超声或通过冷冻样本来物理地裂解样本。

根据图1所示的本发明的一个方面，裂解室可包括多个室，例如第一腔室和第二腔室。第一腔室可包括裂解化学品，例如冻干的Acris裂解化学品。包含在第一腔室内的裂解化学品可以是具有干燥裂解试剂的(一个或多个)试剂塞的形式。所述第一腔室可与所述采样装置流体连通且可从所述采样装置接收所述样本。在本发明的实施方式中，仪器可以控制和/或驱动样品从采样装置到第一腔室的流动。附加地或替代地，可以经由重力、毛细流动等将样品从采样装置驱动到第一腔室。第二腔室可以包括稀释剂并且可以与第一腔室流体连通。可以将稀释剂从第二腔室驱动到第一腔室以形成裂解物。仪器可以控制和/或驱动稀释剂从第二腔室到第一腔室的流动。在第一腔室中形成的裂解物可以包含裂解剂、稀释剂和样品。可以在样品到达之前将稀释剂驱动到第一腔室中以制备裂解物。或者，可以将稀释剂和样品同时驱动到第一腔室。

取决于样品源，任选地进行裂解物的过滤。例如，鼻咽、唾液等可能不需要过滤。相反，过滤全血可以改善测试结果。如果进行过滤，则过滤器与裂解室流体连通，并被配置成将裂解物过滤成过滤的裂解物。过滤器可以从裂解物(例如，血红蛋白)滤出大的不透明结构，同时允许裂解物内的靶标序列(例如，来自靶标病原体的遗传物质)穿过过滤器以用于随后的处理和分析。在本发明的实施方式中，仪器可以控制和/或驱动裂解物从裂解室的流动并通过过滤器以形成过滤的裂解物。

所述计量器与所述过滤器流体连通，并且被配置为计量用于所述NASBA分析的预定量的经过滤的裂解物。预定量可以例如在1ml和3ml之间。在本发明的实施方式中，所述仪器可以控制和/或驱动来自过滤器和计量器的经过滤的裂解物的流动，以收集预定量的经过滤的裂解物。

NASBA流体网络可以与计量器流体连通，并且可以从计量器接收预定量的经过滤的裂解物。NASBA流体网络可包括在预定量的经过滤的裂解物上执行用于m RNA和/或DNA的预定的基于NASBA的核酸测定所必需的所有材料(例如，试剂、结构等)。NASBA流体网络可以包括多个反应管，每个反应管直接或间接与计量器流体连通，并且被配置为从计量器接收过滤的裂解物。在本发明的实施方式中，所述仪器可以控制和/或驱动经过滤的裂解物从计量器到多个反应管中的每一个的流动。

多个反应管中的每一个可以包括用于处理经过滤的裂解物的所有材料，用于预定病原体靶标序列(例如，靶标m RNA，以识别特定基因的存在)的等温扩增。可包括在多个反应管中的每一个中的材料的具体实例包括裂解缓冲液、mRNA依赖性DNA聚合酶、mRNA引物、DNA引物、氨基酸等。多个反应管中的每一个可以至少包括用于对过滤后的裂解物内的病原体靶标序列执行NASBA测定的酶、引物和信标。所述多个反应管中的每一个可以包括以下三种酶中的一种或多种：禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶、核糖核酸酶H(RNase H)和T7RNA聚合酶。多个反应管中的每一个可以包括两个或更多个寡核苷酸引物。酶和引物可以扩增预定病原体靶标序列中的预定基因序列。在多个反应管中的每一个中提供的信标可以被配置为附接到预定的病原体靶标序列。信标可以包括荧光团，荧光团在附接至预定基因序列时并且当由激发源(例如，激光)激发时发射光。每个反应管可以包括至少一个窗口，使得当附接到预定的病原体靶标序列时，该仪器可以检测从信标发射的光。每个反应管可以设置有与其他反应管中的每一个中提供的信标不同的信标。因此，NASBA流体网络可以在存在反应管时检测到许多不同的预定病原体靶标序列。

NASBA流体网络可包括含有NASBA稀释剂的室。腔室可与多个反应管中的每一个流体连通。在本发明的实施方式中，该仪器可以控制和/或驱动稀释剂从腔室到多个反应管中的每一个的流动。包含在腔室内的稀释剂可以在引入过滤的裂解物之前以预定的时间段(例如，5分钟)流体连通到多个反应管中的每一个。在预定时间段到期之后，经过滤的裂解物可以被分配到多个反应管中的每一个以诱导NASBA反应，并且NASBA反应的结果可以由仪器分析。

SARS-CoV-2感染检测系统的仪器可以适于接收样本处理器，以启动和/或控制样本处理器内的样本的处理的方面，并且分析经处理的样本。如上文详细讨论的，所述仪器可控制和/或驱动流体流动(例如，全血流动、稀释剂流动、裂解物流动、过滤的裂解物流动等)。此外，所述仪器可以包括加热器和/或热交换器，所述加热器和/或热交换器可以将样品处理器保持在预定温度范围内，所述预定温度范围对于在NASBA测定期间预定病原体靶标序列的等温扩增是必要的。预定温度范围可以在35-50摄氏度内。在实施方式中，预定温度范围可以在40-42摄氏度内。

在本发明的实施方式中，所述仪器可以被配置为利用所述试剂对样品执行任何合适的基于NASBA的核-酸测定。例如，该仪器可以被配置为执行用于裂解病原体细胞和提取和纯化病原体信使RNA(即，溶解靶标m RNA并去除可能干扰核酸扩增的抑制剂)的任何步骤。在另一个实施例中，所述仪器可以被配置为执行用于处理来自提取和纯化步骤的输出溶液以用于靶标mRNA的等温扩增以识别特定基因的存在的任何步骤。

根据本公开的多种实施方式，在从患者获得的生物样品中检测与抗生素抗性相关的病原微生物和/或序列。出于本公开的目的，生物样品包括鼻咽拭子、唾液、痰、全血、血清、血浆、脑脊液(CSF)、尿液、滑液、母乳、汗液、眼泪、唾液、精液、粪便、阴道液或组织、痰、鼻咽抽吸物或拭子、泪液、粘液或上皮拭子(颊拭子)和组织(例如，组织匀浆)、器官、骨骼、牙齿等。出于本公开的目的，病原微生物包括，例如β-冠状病毒SARS-CoV-2(Betacoronavirus SARS-CoV-2)(Covid-19)和/或冠状病毒(Coronaviridae)家族中的其它病毒中的一种或多种。更具体地，病原生物可以包括表I中列出的那些。更具体地，可以使用表I中列出的正向引物、反向引物和分子信标来检测病原生物的靶标序列。

表I

表I中列出的正向引物、反向引物和分子信标特别适于在SARS-CoV-2感染检测系统10中使用。在这方面，这些正向引物、反向引物和分子信标被优化以与NASBA扩增和检测系统一起使用。

适用于感染检测系统10的裂解溶液快速裂解微生物细胞壁和膜。在特定实施例中，裂解溶液可以促进在室温下的这种裂解，并且没有物理-机械细胞破坏。此外，裂解溶液对RNA可以是良性的并且在室温是稳定的。合适的裂解溶液的具体实例见于表II中：

表II

根据表II的裂解溶液的优点在于，其适用于裂解多种革兰氏阳性、革兰氏阴性和真菌微生物。此外，根据表II的裂解溶液的优点在于，其在室温下具有大于1年的储存的可行贮存期限。此外，根据表II的裂解溶液的优点在于，其在-20摄氏度(-20℃)下具有大于1年的储存的可行贮存期限。值得注意的是，IGEPAL

根据详细说明，本发明的许多特征和优点是显而易见的，因此，所附权利要求旨在覆盖落入本发明的真实精神和范围内的本发明的所有这样的特征和优点。此外，由于本领域技术人员将容易想到许多修改和变化，所以不希望将本发明限制于所示出和描述的确切结构和操作，并且因此，可以采用落入本发明的范围内的所有合适的修改和等同物。

序列表

<110> 泰利福医疗公司

<120> 用于检测生物样品中严重急性呼吸综合征冠状病毒2的存在的方法

<130> HIP210297CN

<150> US 63/017,043

<151> 2020-04-29

<150> US 63/063,731

<151> 2020-08-10

<150> US 17/137,972

<151> 2020-12-30

<150> US 17/138,037

<151> 2019-12-30

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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