杀虫防病复合微生物菌剂及包含该菌剂的生物肥料

摘要

本发明涉及一种杀虫防病复合微生物菌剂及包含该菌剂的生物肥料，由杀虫防病复合微生物菌剂和有机肥按照质量比为1∶1000～1100进行混合后得到。所述杀虫防病复合微生物菌剂包括微生物的发酵液与草炭按照质量比为1∶3进行混合吸附后得到。微生物的发酵液包括质量比为50～60∶46～42的贝莱斯芽孢杆菌ZLP‑101发酵液和附加菌发酵液；附加菌包括硅酸盐细菌K5、解淀粉芽孢杆菌D1、枯草芽胞杆菌BSD‑2、解磷芽孢杆菌P‑6、短短芽孢杆菌CH2‑22和地衣芽孢杆菌BL‑9中的三种以上。本发明对人畜无害，对环境友好，可广泛应用于作物病虫害的防治和增产。

说明书

技术领域

本发明涉及肥料技术领域，具体涉及一种杀虫防病复合微生物菌剂及包含该菌剂的生物肥料。

背景技术

化学肥料和化学杀虫剂在一定程度上为农作物提供了营养元素、降低地下虫害的发生率，间接提高了农作物的产量。但随着栽培年限的延长以及肥药的长期累积施入，使得地下害虫的耐药性日益增加，及与养分循环、有机质分解及抗病相关的微生物菌群结构失衡，致使土传病原菌和地下害虫的数量增大，土壤养分失衡，出现病虫害加重、肥力降低、理化性状改变等一系列问题，最终导致农作物的产量下降，严重阻碍农业的可持续发展和食品安全，急需环境友好、经济有效且适于农作物的生物有机肥，可在有效保障产品优质供应的基础上降低农作物的病虫害发生率。

有机肥含有丰富有机质、钾及植物需要的营养元素，可为作物及微生物提供营养和生存的空间，达到养分缓释及提高活菌货架期的功效。草炭具有多孔性，表面积较大，自身的结构存在较大空隙，具有较好的亲水性，可以降低土壤硬度，促进农作物更好生长。

针对以上技术现状，若能将上述资源充分利用并解决农作物地下害虫和土传病害问题，势必具有潜在的应用前景和广阔的发展空间。

发明内容

本发明的目的是提供一种对人畜无害，对环境友好，可广泛应用于作物病虫害的防治和增产的杀虫防病复合微生物菌剂及包含该菌剂的生物肥料。

本发明采用如下技术方案：

一种杀虫防病复合微生物菌剂，其包括微生物发酵液和草炭，所述微生物发酵液和草炭的质量比为1∶2.5～3；所述微生物发酵液包括贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101发酵液。

其中，所述贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年7月3日，保藏号为CGMCC No.20130。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101发酵液的菌数≥1.0×10

进一步的，所述微生物发酵液还包括附加菌发酵液，所述贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101发酵液和附加菌发酵液的质量比为50～60∶42～75。

进一步的，所述附加菌发酵液的包括如下菌株的发酵液中的一种以上：硅酸盐细菌K5、解淀粉芽孢杆菌D1、枯草芽胞杆菌BSD-2、解磷芽孢杆菌P-6、短短芽孢杆菌CH2-22和地衣芽孢杆菌BL-9。

其中，所述枯草芽胞杆菌BSD-2，保藏号为CGMCC No.8440。

其中，所述硅酸盐细菌K5、解淀粉芽孢杆菌D1、解磷芽孢杆菌P-6、短短芽孢杆菌CH2-22和地衣芽孢杆菌BL-9由河北省科学院生物研究所提供。

其中，所述硅酸盐细菌K5发酵液的菌数≥2.0×10

优选的，所述附加菌发酵液包括质量比为15∶20∶11的硅酸盐细菌K5发酵液、解淀粉芽孢杆菌D1发酵液、枯草芽胞杆菌BSD-2发酵液。

优选的，所述附加菌发酵液包括质量比为13∶10∶19的解磷芽孢杆菌P-6发酵液、短短芽孢杆菌CH2-22发酵液和地衣芽孢杆菌BL-9发酵液。

优选的，所述附加菌发酵液包括质量比为28∶10∶25∶12的枯草芽胞杆菌BSD-2发酵液、解磷芽孢杆菌P-6发酵液、短短芽孢杆菌CH2-22发酵液和地衣芽孢杆菌BL-9发酵液。

一种包含上述杀虫防病复合微生物菌剂的杀虫防病生物肥料，其由杀虫防病复合微生物菌剂和有机肥按照质量比为1∶1000～1100进行混合后得到。

其中，所述有机肥包括如下重量份的组分经堆肥发酵得到：动物粪便1～4份、植物秸秆2～2.5份、金针菇菌糠1.5～3份以及谷糠1～2份。

其中，所述动物粪便包括鸡粪、牛粪、猪粪、羊粪、鸭粪中的一种或多种；所述植物秸秆包括小麦秸秆、玉米秸秆、棉花秸秆、花生秸秆、大豆秸秆、玉米芯、绿豆秸秆、油菜秸秆、红薯秸秆、茄子秸秆、甘蔗秸秆中的一种或多种。

其中，所述金针菇菌糠为金针菇收获后的培养基剩余物(金针菇菌糠)，俗称食用菌栽培废料或菌渣。

其中，上述杀虫防病生物肥料通过如下步骤制备：

(1)微生物分别进行发酵，分别获得各微生物的发酵菌液；

(2)发酵菌液进行混合，得到混合微生物菌液；

(3)混合微生物菌液与草炭土进行混合，得到复合微生物菌液；

(4)有机肥原料进行堆肥发酵，得到有机肥；

(5)将复合微生物菌液与有机肥进行混合，得到杀虫防病生物肥料。

本发明的有益效果在于：本发明制备的杀虫防病生物肥料具有促进黄瓜、玉米、花生、小麦、土豆、番茄等作物的生长和提高农作物产量的作用，还能防治蛴螬、金针虫、地老虎、蝼蛄等地下虫害，以及防治棉花立枯病、棉花枯萎病、棉花黑腐病、棉花红腐病、马铃薯枯萎病、马铃薯早疫病、马铃薯环腐病、玉米叶斑病、玉米纹枯病、小麦黑穗病、花生根腐病、辣椒青枯病、黄瓜枯萎病、番茄枯萎病等真菌病害的作用。本发明制备的杀虫防病生物肥料对人畜无害，对环境友好，可广泛应用于作物病虫害的防治和增产方面，具有广阔的应用前景和发展空间。

附图说明

图1为贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101在LB固体培养基上的菌落形态图片。

图2为贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101在LB固体培养基上的菌体形态图片。

具体实施方式

以下结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。以下实施例仅仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。

实施例1复合微生物无菌滤液的抑菌谱测定

选取棉花立枯病、棉花枯萎病、棉花黑腐病、马铃薯早疫病菌、马铃薯枯萎病菌、马铃薯环腐病菌、马铃薯干腐病菌、烟草赤星病菌、番茄枯萎病、棉花红腐病菌、辣椒青枯病菌、玉米叶斑病菌、玉米纹枯病菌、小麦黑穗病菌、花生根腐病菌、葡萄白腐病菌、番茄早疫病菌、黄瓜灰霉病菌、黄瓜白粉病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜炭疽病菌为靶标，采用平板对峙法测定ZLP-101、D1、P-6；ZLP-101、BSD-2、D1；ZLP-101、CH2-22、BL-9、K5，3种复合微生物无菌滤液的抑菌谱。通过表1的实施数据可以看出，这几种功能微生物的混合无菌滤对不同病原菌都有较好的抑制效果，说明该复合功能微生物的抑菌谱较宽，对多种不同类型的病原菌均有抑菌作用，在对作物的病害，尤其是土传真菌病害的防治领域具有很好的应用效果。

表1复合功能微生物的无菌滤液对不同病原菌的抑制作用

实施例2

一种杀虫防病生物肥料(配方1)，制备方法如下：

(1)分别将贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101(保藏编号为CGMCC No.20130)、硅酸盐细菌K5、解淀粉芽孢杆菌D1和枯草芽孢杆菌BSD-2(保藏编号为CGMCC No.20129)，分别在固体培养基上使用四区划线法接种培养出单菌落；其中贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101、解淀粉芽孢杆菌D1和枯草芽孢杆菌BSD-2的固体培养基为NB培养基(牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、葡萄糖10g/L，琼脂12.0g/L，pH为7.1±0.1)，置于37℃培养箱中，培养18-24h。硅酸盐细菌K5的固体培养基(酵母浸粉5.0g/L，碳酸钙0.1g/L，氯化钙0.04g/L，K

再将单菌落分别接种于各自100ml的液体培养基(除不加琼脂外，其余成分与固体培养基相同)中，贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101、解淀粉芽孢杆菌D1和枯草芽孢杆菌BSD-2，180r/min，37℃，培养12-18h至对数期。硅酸盐细菌K5，180r/min，25℃，培养12h至对数期；最后将处于对数期的100ml液体培养基分别接种于各自800ml的液体培养基中培养，最终获得发酵菌液。

(2)发酵菌液中贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101的菌数≥1.0×10

(3)将贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101、硅酸盐细菌K5、解淀粉芽孢杆菌D1和枯草芽胞杆菌BSD-2发酵菌液的质量比按照50∶15∶20∶11复配成复合微生物菌液。

(4)将复合微生物菌液与草炭按照质量比1∶3的比例进行混合吸附，制得复合微生物菌剂。

(5)将鸡粪、棉花秸秆、金针菇菌糠和谷糠按照质量比4∶2.5∶1.5∶2进行堆肥发酵，堆肥堆置30天左右，翻堆1次，根据干湿情况及时补水(保持含水量在50～60％)，夏季高温高湿，约60天即可腐熟制成有机肥。

(6)将复合微生物菌剂与堆肥发酵后的有机肥，按照质量比1∶1000的比例进行混合均匀，制得本发明杀虫防病生物肥料。

实施例3

一种杀虫防病生物肥料(配方2)，具体的制备方法如下：

(1)贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101、枯草芽胞杆菌BSD-2、解磷芽孢杆菌P-6、短短芽孢杆菌CH2-22和地衣芽孢杆菌分别在固体培养基上使用四区划线法接种培养出单菌落；其中贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101、短短芽孢杆菌CH2-22、枯草芽孢杆菌BSD-2和地衣芽孢杆菌的固体培养基为NB培养基(牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、葡萄糖10g/L，琼脂12.0g/L，pH为7.1±0.1)，置于37℃培养箱中，培养18-24h。解磷芽孢杆菌P-6的固体培养基为无机磷培养基(蔗糖2g/L、葡萄糖2g/L、NH

再将单菌落分别接种于各自100ml的液体培养基(除不加琼脂外，其余成分与固体培养基相同)中；贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101、解磷芽孢杆菌P-6、枯草芽孢杆菌BSD-2、短短芽孢杆菌CH2-22和地衣芽孢杆菌，180r/min，37℃，培养12-18h至对数期。最后将处于对数期的100ml液体培养基分别接种于各自800ml的液体培养基中培养，最终获得发酵菌液。

(2)最终使得发酵菌液中贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101的菌数≥1.0×10

(3)将贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101、枯草芽胞杆菌BSD-2、解磷芽孢杆菌P-6、短短芽孢杆菌CH2-22和地衣芽孢杆菌BL-9发酵液的质量比按照45∶28∶10∶25∶12复配成复合微生物菌液。

(4)将复合微生物菌液与草炭按照质量比1∶3的比例进行吸附，制得复合微生物菌剂。

(5)将牛粪、玉米秸秆、金针菇菌糠和谷糠按照2∶2.5∶3∶1进行堆肥发酵，堆肥堆置30天左右，翻堆1次，根据干湿情况及时补水(保持含水量在50～60％)，夏季高温高湿，约60天即可腐熟制成有机肥。

(6)将复合微生物菌剂与追肥发酵后的有机肥，按照质量比1∶1200的比例进行混合均匀，制得本发明杀虫防病生物肥料。

实施例4

一种杀虫防病生物肥料(配方3)，具体的制备方法如下：

(1)将贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101、解磷芽孢杆菌P-6、短短芽孢杆菌CH2-22、和地衣芽孢杆菌BL-9，分别在固体培养基上使用四区划线法接种培养出单菌落；其中贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101、短短芽孢杆菌CH2-22和地衣芽孢杆菌BL-9的固体培养基为NB培养基(牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、葡萄糖10g/L，琼脂12.0g/L，pH为7.1±0.1)，置于37℃培养箱中，培养48h。解磷芽孢杆菌P-6的固体培养基为无机磷培养基(蔗糖2g/L、葡萄糖2g/L、NH

再将单菌落分别接种于各自100ml的液体培养基(除不加琼脂外，其余成分与固体培养基相同)中，贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101(37℃)、解磷芽孢杆菌P-6(32℃)、短短芽孢杆菌CH2-22(37℃)和地衣芽孢杆菌BL-9(37℃)，180r/min，培养12-18h至对数期。最后将处于对数期的100ml液体培养基分别接种于各自800ml的液体培养基中培养，最终获得发酵菌液。

(2)发酵菌液中贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101的菌数≥1.0×10

(3)将贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101、解磷芽孢杆菌P-6、短短芽孢杆菌CH2-22、和地衣芽孢杆菌BL-9发酵液的质量比按照60∶13∶10∶19复配成复合微生物菌液。

(4)将复合微生物菌液与草炭按照质量比1∶3的比例进行吸附，制得复合微生物菌剂。

(5)将猪粪、小麦秸秆、金针菇菌糠和谷糠按照1∶2∶2.5∶1.5进行堆肥发酵，堆肥堆置30天左右，翻堆1次，根据干湿情况及时补水(保持含水量在50～60％)，夏季高温高湿，约60天即可腐熟制成有机肥。

(6)将复合微生物菌剂与堆肥发酵后的有机肥，按照质量比1∶1100的比例进行混合均匀，制得本发明杀虫防病生物肥料。

实施例5

一种杀虫防病生物肥料(配方4)，具体的制备方法如下：

(1)将贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101(保藏编号为CGMCC No.20130)在固体培养基上使用四区划线法接种培养出单菌落；其中固体培养基为NB培养基(牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、葡萄糖10g/L，琼脂12.0g/L，pH为7.1±0.1)，置于37℃培养箱中，培养18-24h。

再将单菌落接种于各自100ml的液体培养基(除不加琼脂外，其余成分与固体培养基相同)中，贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101，180r/min，37℃，培养12-18h至对数期。最后将处于对数期的100ml液体培养基分别接种于各自800ml的液体培养基中培养，最终获得发酵菌液。

(2)发酵菌液中贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101的菌数≥1.0×10

(3)将复合微生物菌液与草炭按照质量比1∶3的比例进行混合吸附，制得复合微生物菌剂。

(4)将鸡粪、棉花秸秆、金针菇菌糠和谷糠按照质量比4∶2.5∶1.5∶2进行堆肥发酵，堆肥堆置30天左右，翻堆1次，根据干湿情况及时补水(保持含水量在50～60％)，夏季高温高湿，约60天即可腐熟制成有机肥。

(5)将复合微生物菌剂与堆肥发酵后的有机肥，按照质量比1∶1000的比例进行混合均匀，制得本发明杀虫防病生物肥料。

实施例6复合微生物发酵无菌滤液对蛴螬等害虫的杀虫效果

将贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101、硅酸盐细菌K5、解淀粉芽孢杆菌D1和枯草芽孢杆菌BSD-2(发酵液配比见配方1)；贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101、枯草芽胞杆菌BSD-2、解磷芽孢杆菌P-6、短短芽孢杆菌CH2-22和地衣芽孢杆菌BL-9(发酵液配比见配方2)；贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101、解磷芽孢杆菌P-6、短短芽孢杆菌CH2-22和地衣芽孢杆菌BL-9(发酵液配比见配方3)；贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101发酵液(配方4)；各菌株发酵获得的发酵液按照上述配方进行混合，过滤，得到各配方的无菌滤液。用原液、稀释20倍、稀释50倍、稀释100倍、稀释200倍配置药土，加入适量食料(碎玉米秸秆等)并混匀，以清水配制药土作为对照。选取大小一致的蛴螬(白星花金龟幼虫)、小菜蛾、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、菜青虫、斑衣蜡蝉及蟑螂，处理重复3次，在相对湿度为50％～70％、温度为25℃～28℃的环境中。每处理试虫数量为30头，重复3次。接虫后置于室内常温培养，每隔8h观察一次，56h后统计死亡率。通过表2的实施数据可以看出，本发明杀虫防病生物肥料中的复合微生物发酵产物对蛴螬等害虫具有很好的杀灭效果。

表2本发明复合微生物发酵产物对蛴螬等害虫的灭杀效果

实施例7杀虫防病生物肥料的质量测定

根据表3的检测结果表明，本发明杀虫防病生物肥料的质量符合中华人民共和国农业行业标准NY884-2012的要求。

表3本发明杀虫防病生物肥料的质量检测结果

实施例8杀虫防病生物肥料对大田作物及蔬菜的增产效果

将本发明杀虫防病生物肥料(配方1、配方2、配方3、配方4)在玉米、花生、小麦大田作物及黄瓜、番茄、马铃薯蔬菜上进行了施用，处理1组为施用本发明杀虫防病生物肥料组，每平方施用150g。处理2组为市面上普通生物有机肥(根力多生物有机肥)，购自根力多生物科技股份有限公司，每平方施用100-200g。对照组施用化学肥料组(氮磷钾有机三元复合肥16-16-16)，购自劲多宝生物科技有限公司，每平方施用50g左右，均匀撒施或埋在土壤下15cm处，远离根部。不同的作物施用不同的量。统计了4种配方各组各种作物及蔬菜的产量，从表4中各组的产量可以看出，本发明在提高作物产量方面优于市面上现有的生物有机肥，其中，玉米、花生、小麦、黄瓜、番茄和马铃薯的产量较普通生物有机肥分别提高了6.76％-17.51％、12.64％-19.90％、7.29％-9.71％、2.25％-6.28％、6.05％-9.30％、3.72％-6.14％，且都有显著性差异。与化学肥料相比，产量没有显著性差异，说明本发明杀虫防病生物肥料有替代化学肥料的潜力。

表4不同处理对玉米、花生、小麦、黄瓜、番茄等作物的影响

注：同行相同小写字母表示差异不显著，P＞0.05。不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。下同。

实施例9杀虫防病生物肥料对设施蔬菜土传病害防效

分别在种植马铃薯、玉米、小麦、花生等大田作物及辣椒、黄瓜、番茄等蔬菜大棚中进行杀虫防病生物肥料的施用(配方1、配方2、配方3、配方4)，处理组施用本发明杀虫防病生物肥料，每平方施用150g，对照组施用化肥(氮磷钾有机三元复合肥16-16-16)，每平方施用50g左右，均匀撒施或埋在土壤下15cm处，远离根部。

通过对各作物及蔬菜发病情况的记录和统计，得配方1的处理组对马铃薯枯萎病、马铃薯早疫病、马铃薯环腐病、玉米叶斑病、玉米纹枯病、小麦黑穗病、花生根腐病、辣椒青枯病、黄瓜枯萎病和番茄枯萎病的防效较对照组增加了67.8％、63.62％、64.05％、58.47％、67.30％、58.80％、62.91％、57.05％、69.82％和68.12％。配方2的处理组对马铃薯枯萎病、马铃薯早疫病、马铃薯环腐病、玉米叶斑病、玉米纹枯病、小麦黑穗病、花生根腐病、辣椒青枯病、黄瓜枯萎病和番茄枯萎病的防效较对照组增加了61.09％、60.55％、71.78％、62.76％、65.99％、59.63％、67.02％、69.09％、68.34％和66.20％。配方3的处理组对马铃薯枯萎病、马铃薯早疫病、马铃薯环腐病、玉米叶斑病、玉米纹枯病、小麦黑穗病、花生根腐病、辣椒青枯病、黄瓜枯萎病和番茄枯萎病的防效较对照组增加了58.32％、53.65％、53.80％、69.43％、68.55％、55.40％、70.26％、67.24％、68.44％和66.44％。配方4的处理组对马铃薯枯萎病、马铃薯早疫病、马铃薯环腐病、玉米叶斑病、玉米纹枯病、小麦黑穗病、花生根腐病、辣椒青枯病、黄瓜枯萎病和番茄枯萎病的防效较对照组增加了57.40％、49.23％、49.20％、60.39％、65.46％、54.40％、60.84％、61.07％、65.81％和60.24％。实施结果表明，本发明杀虫防病生物肥料对大田作物及设施蔬菜的土传病害有很好的防治效果。

表5不同处理对茄子、生菜、辣椒等设施蔬菜土传病害的防效

实施例10杀虫防病生物肥料对地下害虫的防效

分别在玉米、花生和马铃薯地进行，对照底施化学肥料(氮磷钾有机三元复合肥16-16-16)，每平方施用50g左右，均匀撒施或埋在土壤下15cm处，远离根部。处理底施本发明杀虫防病生物肥料(配方3)，每平方施用150g。将每种作物或蔬菜共计12个小区，每小区面积20m

保苗率(％)＝(总株数-受害株数)/总株数×100。

防效(％)＝(处理保苗率-CK保苗率)/(1-CK保苗率)×100。

表6本发明对地老虎、金针虫和蛴螬地下害虫的防治效果

根据表6的实施数据可以看出，本发明杀虫防病生物肥料对花生地地老虎、玉米地金针虫和马铃薯地蛴螬的防效分别为75.56％、69.23％和77.16％，表明，本发明杀虫防病生物肥料对花生、玉米和马铃薯的地下害虫有显著的防治效果。