戟叶马鞭草苷在治疗肝纤维化药物中的应用

摘要

本发明涉及戟叶马鞭草苷在治疗肝纤维化药物中的应用。戟叶马鞭草苷可抑制四氯化碳诱导的肝纤维化层粘连蛋白，III型胶原，透明质酸酶的水平，降低肝功能指标谷丙转氨酶，谷草转氨酶的水平，降低I型胶原蛋白和α平滑肌肌动蛋白的表达，抑制转化生长因子‑β1引起的肝星状细胞的活化与增殖。本发明首次发现戟叶马鞭草苷对肝纤维化具有保护作用，其机制与其抑制肝星状细胞的活化与增殖有关，具有发展成为治疗肝纤维化损伤的药物的前景。

说明书

技术领域

本发明属于药物治疗学技术领域，具体涉及戟叶马鞭草苷在预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用。

背景技术

肝纤维化(Liver fibrosis,LF)是由多种慢性损伤性致病因子导致的肝内结缔组织异常增生的病理过程，被认为是肝硬化和肝细胞癌的危险因素。主要特征是以胶原蛋白沉积在肝脏组织为主的细胞外基质异常堆积，最终导致肝脏正常结构被破坏以及正常肝功能下降。若没有及时干预LF的进展，轻微的肝纤维化会变成肝硬化，最终可能会发生肝癌。目前，临床上尚缺乏治疗肝脏纤维化的有效手段。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种缓解肝脏损伤的新的天然产物，具体为戟叶马鞭草苷在预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用。

本发明采用的技术方案如下：

戟叶马鞭草苷在预防或治疗肝纤维化药物中的应用，所述戟叶马鞭草苷结构式如式(A)所示：

优选的，所述药物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂中的任意一种。

本发明还提供一种预防或治疗肝纤维化的药物，其含有药学有效剂量的戟叶马鞭草苷，所述戟叶马鞭草苷结构式如式(A)所示：

优选的，所述药物还包含有药学上可接受的载体。

优选的，所述药学上可接受的载体包括赋形剂、稳定剂、抗氧化剂、着色剂、稀释剂、缓释剂等一种或几种功能的辅料；如淀粉、脂类、蜡、糊精、蔗糖、乳糖、微晶纤维素、明胶、柠檬酸、无机盐类、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素等。

优选的，所述药物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂中的任意一种。

本发明的有益效果为：

马鞭草(Verbena officinalis L.)系马鞭草科(verbenaceae)马鞭草属植物。马鞭草以全草入药，始载于《名医别录》，在中国作为传统中药，具有活血散瘀、截疟，解毒、利水消肿的作用，广泛用于治疗伤风感冒、流感、治卒大腹水、鼓胀烦渴、痢疾、疟疾、黄疽、咽喉肿痛、牙周炎、牙髓炎、白喉、症瘕积聚、经闭、痛经等。在印度，马鞭草作为民间药物用于治疗支气管炎，利尿等。马鞭草中有多种化学成分，其中戟叶马鞭草苷为其主要活性成分。目前尚未有戟叶马鞭草苷在治疗肝纤维化方面的研究报道，戟叶马鞭草苷的药理作用尚待进一步发现。

本发明通过整体、细胞、蛋白水平研究，深入观察探讨戟叶马鞭草苷对四氯化碳诱导的肝纤维化保护作用及可能的作用机制，为预防和减轻肝纤维化发现新的药物作用靶点提供了实验依据。

本发明通过药效学结果显示，在整体动物和细胞水平上，戟叶马鞭草苷对四氯化碳诱导的肝纤维化模型具有较强的保护作用。探究其机制，在整体动物和细胞水平上均证实戟叶马鞭草苷可通过抑制肝星状细胞的活化与增殖对四氯化碳引起的肝纤维化发挥保护作用。

本发明在整体动物水平考察戟叶马鞭草苷对肝纤维化的保护作用，通过动物大体观、肝脏的病理、血清的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、透明质酸、层粘连蛋白、III型胶原蛋白水平，I型胶原和α-平滑肌肌动蛋白的表达变化，证明戟叶马鞭草苷对肝纤维化具有保护作用。

本发明在细胞水平，用TGF-β1刺激肝星状细胞使其活化，同时给与戟叶马鞭草苷治疗，运用CCK8法及检测肝星状细胞活化的标志物α-平滑肌肌动蛋白表达变化以及相关增殖蛋白的表达变化，证明戟叶马鞭草苷可通过抑制肝星状细胞的活化与增殖对四氯化碳引起的肝纤维化发挥保护作用。

本发明实验证明，戟叶马鞭草苷可抑制肝纤维化层粘连蛋白、III型胶原、透明质酸酶的水平，降低肝功能指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶的水平，降低I型胶原蛋白和α平滑肌肌动蛋白的表达，抑制转化生长因子-β1引起的肝星状细胞的活化与增殖。本发明首次发现戟叶马鞭草苷对肝纤维化具有保护作用，其机制与其抑制肝星状细胞的活化与增殖有关，为中药对肝脏疾病的的辅助治疗中提供了新的潜在药物。

附图说明

图1为戟叶马鞭草苷对CCL4诱导的小鼠肝纤维化肝脏的影响。

图2-3为戟叶马鞭草苷对对CCl4诱导肝纤维化小鼠肝脏病理的影响，其中图2为H&E染色(20×)，图3为Massion染色(20×)。

图4A为戟叶马鞭草苷对CCl4诱导肝纤维化小鼠血清ALT的影响，图4B为戟叶马鞭草苷对CCl4诱导肝纤维化小鼠血清AST的影响。

图5A为戟叶马鞭草苷对CCl4诱导肝纤维化小鼠血清LN的影响；图5B为戟叶马鞭草苷对CCl4诱导肝纤维化小鼠血清HA的影响；图5C为戟叶马鞭草苷对CCl4诱导肝纤维化小鼠血清PCIII的影响。

图6为戟叶马鞭草苷对肝纤维化小鼠的col1α1表达水平的影响；其中图6A为Western blot检测，图6B为Real time q-PCR检测。

图7为戟叶马鞭草苷对肝纤维化小鼠的α-SMA表达水平的影响；其中，图7A、7B为小鼠肝脏组织免疫组化结果，7B是7A的统计图，图7C为小鼠肝脏组织Western blot检测结果，图7D为小鼠肝脏组织Real time q-PCR检测结果。

图8为戟叶马鞭草苷对肝星状细胞活化与增殖的影响；其中，图8A为CCK8法检测肝星状细胞增殖情况结果，图8B为肝星状细胞Western blot检测α-SMA结果，图8C为肝星状细胞Real time q-PCR检测α-SMA结果，图8D为肝星状细胞Western blot检测COLIα1结果，图8E为肝星状细胞Real time q-PCR检测COLIα1，图8F为肝星状细胞Western blot检测C-myc,CyclinD1结果。

具体实施方式

除非另有说明，本文中所使用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义。

下面结合实施例对本发明的技术方案做出更为具体的说明：

实施例1

戟叶马鞭草苷对四氯化碳(CCL4)诱导的小鼠一般状况与肝脏的影响：

实验设计：

60只雄性C57BL/6J小鼠，体重20±2克，随机分为如下6组(n＝10)：对照组(Vehicle)，对照+戟叶马鞭草苷(50mg/kg)组，CCL4模型组，CCL4+戟叶马鞭草苷(12.5mg/kg)组，CCL4+戟叶马鞭草苷(25mg/kg)组和CCL4+戟叶马鞭草苷(50mg/kg)组。

模型组和低、中、高剂量组小鼠腹腔注射10％CCl4橄榄油溶液(0.01mL/g/小鼠)，首次注射剂量加倍，每周注射两次，共注射4周，正常组小鼠腹腔注射等体积的橄榄油溶液。同时不同剂量给药组小鼠每天灌胃12.5，25和50mg/kg的戟叶马鞭草苷。造模结束后，所有小鼠均断食不断水24h。在麻醉状态下使小鼠死亡，收集小鼠血液、肝脏组织用于后续研究。

观察各组小鼠的一般状况和肝脏组织，结果如下：

新鲜的在体和离体肝脏外观结果如图1，可以看出，正常组小鼠的肝脏外观鲜红细腻有光泽，质地柔软。模型组小鼠的肝脏外观无光泽且肿大，呈典型纤维化外观：肿大色泽暗淡，质地较硬实，肝脏表面和切面呈弥漫的细小结节。低、中、高剂量组小鼠的肝脏依次渐接近于正常组颜色、光泽度及质地。正常加高剂量组的肝脏外观与正常组相比无异样。

即从小鼠肝脏外观上看，肝纤维化小鼠在不同浓度给药后，肝脏由原来的颜色暗淡后不同程度接近正常肝脏鲜红的颜色。表明戟叶马鞭草苷(12.5、25、50mg/kg)可缓解CCL4诱导的肝纤维化小鼠肝脏颜色，不同程度改善小鼠肝脏纤维化程度，表明戟叶马鞭草对肝脏具有一定保护作用。

实施例2

马鞭草苷对CCL4诱导的小鼠肝脏纤维化病理的影响

1.H&E(苏木精-伊红)染色

将实施例1中不同组别的小鼠肝脏大叶组织固定于4％多聚甲醛溶液中24～48h，样品经过酒精脱水和二甲苯透明后，用石蜡包埋。待包埋好的组织块变硬，用切片机进行切片。染色前，在二甲苯中脱去石蜡切片中的石蜡，经过由高浓度到低浓度的乙醇脱水后，最后用双蒸水冲洗即可开始染色。于苏木素染色液中染色8min，用流水稍洗去多余的染色液。在1％盐酸乙醇中分化5s，水洗后加入适量0.6％氨水至颜色微蓝时流式冲洗10min，用0.5％伊红染液进行染色1～3min左右。蒸馏水稍洗后，再在由低浓度到高浓度乙醇溶液中进行脱水处理，二甲苯中透明、中性树脂胶封片后在显微镜下观察，分析结果后选取需要的位置拍照。

结果如图2所示，H&E染色检测小鼠肝脏病理发现，与CCl4诱导肝纤维化小鼠相比，戟叶马鞭草苷(12.5、25、50mg/kg)治疗的小鼠肝组织的结构明显有不同程度的改善，纤维沉积较和炎性细胞浸润模型组呈有不同程度的减少。

2.Masson染色

将各组石蜡切片在二甲苯中脱去石蜡切片中的石蜡，经过由高浓度到低浓度的乙醇脱水后，最后用双蒸水冲洗即可开始染色。Weigert铁苏木素液染色5-10min，双蒸水冲洗。1％盐酸酒精对切片进行分化，双蒸水冲洗。把片子用丽春红染液进行5-10min的染色，双蒸水冲洗。磷钼酸染色5min，直接甩干。苯胺蓝染色5min，双蒸水冲洗。1％冰醋酸处理1min后脱水透明后封片，后在显微镜下观察，分析结果后选取需要的位置拍照。

结果如图3所示，Masson染色的结果显示，与CCl4诱导肝纤维化小鼠相比，戟叶马鞭草苷(12.5、25、50mg/kg)治疗小鼠肝组织纤维组织增生呈现不同程度减少，肝细胞大小趋于一致且排列较整齐，纤维间隔的形成减少，胶原沉积受到抑制。

表明戟叶马鞭草在一定程度上可以减轻肝脏细胞损伤。

实施例3

戟叶马鞭草苷对CCL4诱导的小鼠血清ALT与AST的影响

获取实施例1取得的小鼠血液血清作为样品，按照谷丙转氨酶(ALT)试剂盒和谷草转氨酶(AST)试剂盒(微孔96T微板法)(南京建成生物工程研究所)说明书进行操作。

检测血清ALT与AST结果如图4A、图4B所示。与CCl4诱导的肝纤维化小鼠相比戟叶马鞭草苷(25、50mg/kg)可明显降低血清ALT与AST水平(p<0.01)，提示戟叶马鞭草苷对CCl4诱导的小鼠肝纤维化具有一定的肝脏保护作用。

实施例4

戟叶马鞭草苷对对CCl4诱导的小鼠血清LN,HA与PCIII的影响

实施例1中获取的小鼠血液血清作为样品，按照层粘连蛋白(LN)，透明质酸酶(HA)和III型前胶原(PCIII)ELISA检测试剂盒(武汉基因美)说明书进行操作。

结果分别如图5A、5B、5C所示。图中可以看出，与CCl4诱导的肝纤维化小鼠相比，戟叶马鞭草苷(12.5、25、50mg/kg)可明显降低血清LN，HA与PCIII水平(p<0.01)，提示戟叶马鞭草苷能有效降低CCl4诱导的肝纤维化小鼠的纤维化指标。

实施例5

取实施例1中各组适量的小鼠肝脏组织提取总蛋白和RNA，分别进行蛋白质印迹(Western blot)实验和实时荧光定量RCR(real time q-PCR)实验，实验按照常规方法进行。

结果如图6A、6B所示。可以看出，模型组小鼠的col1α1表达水平明显高于正常组，给药组与模型组相比，col1α1的表达水平呈剂量依赖性降低。

实施例6

戟叶马鞭草苷对肝纤维化小鼠的α-SMA表达水平的影响

将实施例1中获取的肝组织按实施例2方法制成蜡块并切片，常规脱蜡，水化后，把片子放在盛有足量的枸橼酸盐缓冲液的抗原修复盒中，100℃微波加热10min。取出盒子待其恢复至室温后，将片子先用蒸馏水缓慢冲洗后放在盛有3％H

选取正常组，模型组和中剂量(25mg/kg)组给药组小鼠肝脏组织用于免疫组化(图7A、7B)，Western blot(图7C)和real time q-PCR(图7D)检测α-SMA在肝组织中的表达。结果显示，模型组小鼠的col1α1表达水平明显高于正常组，中剂量给药组与模型组相比，α-SMA的表达水平显著降低。表明在四氯化碳诱导的肝纤维化中，小鼠肝脏肝星状细胞明显活化，而在戟叶马鞭草苷给药治疗后肝星状细胞活化减少，表明戟叶马鞭草苷对肝纤维化具有一定的治疗作用。

实施例7

戟叶马鞭草苷对肝星状细胞活化与增殖的影响

肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSCs)的表型激活变成肌成纤维细胞在HF进程中起着核心作用，HSCs是肝脏中主要的胶原生成细胞，其激活可促进HF。如果能抑制HSCs的激活和增殖，理论上可以减少甚至逆转HF的发生和发展。

分别使用96孔板和六孔板培养细胞，TGF-β1刺激肝星状细胞可以使其活化，肝星状细胞同时接受TGF-β(10ng/ml)和戟叶马鞭草苷(20μM)刺激48小时。使用CCK8检测96孔板中肝星状细胞的增殖情况，同时提取六孔板中细胞的总蛋白和RNA。用Westrn blot检测α-SMA和COLIα1以及增殖相关蛋白C-myc和Cyclin D1的表达情况，同时使用Real time q-PCR检测α-SMA和COLIα1的基因表达情况。

结果如图8所示，与正常组相比，TGF-β1刺激组细胞增殖明显(图8A)，且α-SMA(图8B、8C)和COLI-α1(图8D、E)以及增殖相关蛋白C-myc和CyclinD1表达(图8F)明显增加，而给药戟叶马鞭草苷后细胞较模型组比较增殖减少，且α-SMA和COLI-α1以及增殖相关蛋白C-myc和CyclinD1表达显著下降。

以上仅为本发明的较佳实用例而已，并不用以限制本发明创造；尽管参照前述实施方式对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。