一种黄连解毒丸干预的实热上火证候的生物标志物及其应用

摘要

本发明公开了一种黄连解毒丸干预的实热上火证候的生物标志物及其应用，涉及生物医药领域。该生物标志物为所述标志物为TNF‑α、IL‑8、IL‑10、4‑HNE、琥珀酸、泛酸或次黄嘌呤。本发明通过小样本量验证研究，确证黄连解毒丸能够显著调节TNF‑α，IL‑8，4‑HNE，琥珀酸。通过Ⅱ期临床随机、双盲、多中心、安慰剂组对照大样本量探索与筛选研究，发现唾液中IL‑10，血浆中4‑HNE和尿液中泛酸、次黄嘌呤可以成为黄连解毒丸的疗效或实热火毒证病机演变的生物标志物。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种黄连解毒丸干预的实热上火证候的生物标志物及其应用。

背景技术

“上火”是日常生活中习见的一种人体不适，从中医理论解释，属于热证范畴，所谓“火”是形容身体内某些热性的症状，而“上火”认为是人体阴阳失衡后出现的内热症。祖国医学对“上火”病因病机的认识与探究，有着漫长的发展历程。自《黄帝内经》的“病机十九条”，言火者六，言热者四，开创了“火热”病机的先河。到《伤寒论》的六经辨证，金元四大家李东垣“阴火论”、朱震亨“相火论”、刘完素“六气皆从火化”以及清代叶天士的卫气营血论火、王清任的瘀血发热等，体现了“火热”证广泛而多发的特点。

“上火”是机体的一种亚健康状态，会出现头面部一些器官以及皮肤黏膜的炎症性病变，导致智齿性冠周炎、复发性口腔溃疡、慢性咽炎、牙龈炎等的发生，严重者可变生其他病证。“上火”并非某一具体的病证，作为一种中医证候变化，见于各种火热相关的病症中，包括口腔溃疡、牙龈肿痛、口燥咽干、鼻衄、目赤，并可伴有小便短赤、大便干结等症。

由于生存压力的增加和饮食结构的改变，“上火”的发生率有了明显的增加趋势。进食炙烤食品、火锅及较少的饮水量等饮食习惯，极度忙碌的生活状态以及巨大的心理压力、熬夜、失眠等与“上火”的发生密切相关。现代医学认为“上火”与交感神经和垂体-肾上腺系统机能增强、中分子物质过多、营养成分过剩或不足关联。菌群结构以及功能失调与“上火”具有相关性，菌群失调可诱导氧化应激，促使炎症因子分泌增加，同时也会导致脂质代谢紊乱，进而引发局部炎症反应的发生。现代生物学认为“上火”的发生机制为精神紧张、过度劳累、热量摄入过多、菌群失调以及人体易感体质等因素作用下，导致以炎症免疫稳态破坏、氧化应激增强、能量代谢加快为主的内环境紊乱，出现以头面部口、舌、牙龈、咽喉、眼、鼻等部位皮肤黏膜发生炎症反应为主要表现，并可伴有全身症状的一种轻微且易反复的疾病。

“黄连解毒丸”是国内首个获批临床研究的中药证候类新药，临床研究表明，其安全性良好，在改善实热火毒证患者咽喉肿痛、口鼻气热、燥苔症状、小便黄赤、大便燥结方面具有明显的优势。“黄连解毒丸”起源于经典名方“黄连解毒汤”，首载于东晋葛洪的《肘后备急方》，于唐代王焘《外台秘要》中记载并冠名。该方剂由黄连、黄芩、黄柏和栀子以3：2：2：3的比例配伍而成，按照“君、臣、佐、使”的严格原则，方中黄连苦寒，清泻心火，兼泻脾火于中焦，为君药；黄芩泻肺火于上焦，为臣药；黄柏泻肾火于下焦，为佐药；栀子为使药，泻三焦之火，导热下行，从膀胱而出。黄连解毒汤(HLJDD)主治一切实热火毒、三焦热盛之证，是典型的证候类药物。该方也被列为全国高等中医药院校规划教材《方剂学》中清热解毒第一方，已在治疗火热炽盛证引起的各系统疾病中得到广泛应用。症见大热烦渴，口燥咽干，错语不眠；或热病吐血、衄血，或热甚发斑，身热下利，湿热黄疸；外科痈疽疔毒，小便黄赤，舌红苔黄，脉数有力。

然而，中医证候的模糊性及方剂的复杂性限制了中医药的发展，临床生物标志物是证候类中药新药临床疗效评估的客观指标，目前尚缺乏黄连解毒丸干预的实热上火证候的生物标志物。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄连解毒丸干预的实热上火证候的生物标志物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本申请基于多组学及多维色谱技术，以中医临床证候及药物干预为研究对象，筛选出了黄连解毒丸干预的实热上火证候的生物标志物。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种黄连解毒丸干预的实热上火证候的生物标志物，所述标志物为TNF-α、IL-8、IL-10、4-HNE、琥珀酸、泛酸或次黄嘌呤。

本发明还提供一种上述的生物标志物在评估黄连解毒丸对实热上火的疗效中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过小样本量验证研究，确证黄连解毒丸能够显著调节TNF-α，IL-8，4-HNE，琥珀酸。通过Ⅱ期临床随机、双盲、多中心、安慰剂组对照大样本量探索与筛选研究，发现唾液中IL-10，血浆中4-HNE和尿液中泛酸、次黄嘌呤可以成为黄连解毒丸的疗效或实热火毒证病机演变的生物标志物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为三个实验组的血浆中11种炎症因子含量变化，其中N为对照组；A为黄连解毒丸组；B为“实热”上火组；a-k依次为TNF-α、IL-8、IL-10、IL-4、IL-6、IL-12p70、MCP-1、IFN-γ、IL-1β、MIP-1α和IL-13；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；

图2为三个实验组的血浆中4种能量因子含量变化，其中N为对照组；A为黄连解毒丸组；B为“实热”上火组；a-d依次为GC、LDH、TSH和ATP；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；

图3为三个实验组的血浆中4-HNE(a)和ACTH(b)含量变化，其中N为对照组；A为黄连解毒丸组；B为“实热”上火组；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；

图4为三个实验组的血浆中三羧酸循环中间代谢物含量变化，其中N为对照组；A为黄连解毒丸组；B为“实热”上火组；a-p依次为富马酸、乌头酸、柠檬酸、苹果酸、α-酮戊二酸、葡萄糖、琥珀酸、甘氨酸、乳酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、色氨酸、丙氨酸、丙酮酸和AMP；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；

图5为血浆中ATP(A)、4-HNE(B)和ACTH(C)的含量变化。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

选取30例具有“实热”上火证候的受试者，进行小样本验证试验，并纳入30例健康志愿者作为对照。旨在验证前期研究中得到的潜在生物标志物。

N：正常对照组，健康志愿者；

A(After)组：黄连解毒丸组，为给药后的血样。1袋(3.2g)/次，2次/d。早晚饭后0.5～1h内用80℃以上热水冲调。疗程为5d。

B(Before)组：“实热”上火组，为A组给药前取的血样。

1血浆炎症因子验证

1.1材料与方法

人IFN-γELISA试剂盒(ELH：IFN-γ)购于Raybiotech公司(美国)；Luminex多重细胞因子试剂盒(Panomics/Affymetrix，Santa Clara，CA)；仪器：美国Luminex公司

1.2结果

如图1所示，“实热”上火组与健康正常组相比，血浆中TNF-α，IL-10，IL-4，IFN-γ，IL-6，IL-12p70，IL-1β(p<0.0001)；IL-8，IL-13(p<0.01)显著升高，MCP-1显著降低(p<0.01)；黄连解毒丸组与“实热”上火组相比，TNF-α，IL-4，IL-8，IL-6，IL-12p70(p<0.05)；IFN-γ(p<0.01)显著下降。本次研究结果中既与“实热”上火发生机制显著相关，又与黄连解毒丸治疗效果显著相关的炎症因子为TNF-α，IL-4，IL-8，IL-6，IFN-γ。

2血浆能量代谢相关因子验证

2.1材料与方法

人ATP合酶ELISA试剂盒(Cat：OM626460)；人LDH ELISA试剂盒(Cat：OM625740)；人GC ELISA试剂盒(Cat：OM539061)购于Omnimabs公司(加利福尼亚州，美国)；人TSH ELISA试剂盒(ELH：TSH)购于Raybiotech公司(美国)。所有操作均按照制造商的建议进行。

2.结果

如图2所示，“实热”上火组与健康正常组相比，血浆中GC，TSH显著下降(p<0.0001)；黄连解毒丸组与“实热”上火组相比，GC(p<0.0001)，TSH(p<0.05)显著下降；LDH显著上升(p<0.001)显著上升。ATP在本次研究中在“实热”上火组与健康正常组之间以及黄连解毒丸组与“实热”上火组之间作比较，差异均不显著。

3血浆氧化应激因子验证

3.1材料与方法

人ACTH ELISA试剂盒(Cat：OM527142)；人4-HNE ELISA试剂盒(Cat：OM521593)购于Omnimabs公司(加利福尼亚州，美国)；人SOD3 ELISA试剂盒(Cat：ELH-SOD3)购于Raybiotech公司(美国)。所有操作均按照制造商的建议进行。

3.2结果

如图3所示，“实热”上火组与健康对照组相比，血浆中ACTH显著下降(p<0.0001)；黄连解毒丸组与“实热”上火组相比，4-HNE(p<0.0001)显著下降。ACTH无统计学意义。说明4-HNE在黄连解毒丸治疗效果中有显著改善作用。SOD3由于在本次预试实验中含量较低，不在标准曲线范围内，故未再探讨。

4基于UPLC-AB Sciex Triple Quad 6500+液质联用技术的血浆三羧酸循环中间代谢物定量研究

4.1材料与方法

4.1.1仪器及试剂

Thermo Scientific Heraeus Multifuge XIR高速离心机(Thermo公司，美国)；IKA/艾卡MS 3digital涡旋仪(IKA公司，德国)；AB SCIEX Triple Quad 6500+质谱仪(美国)；AB SCIEX液相色谱仪(美国)；ML104电子天平购自梅特勒托利多仪器(中国)有限公司。

琥珀酸，顺式乌头酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-丝氨酸，富马酸，柠檬酸，L-丙氨酸，α-酮戊二酸购于上海诗丹德标准技术服务有限公司；D(+)-无水葡萄糖，丙酮酸购于上海源叶生物科技有限公司；L-乳酸购于CATO公司(美国)；一磷酸腺苷(AMP)购广州硕谱生物科技有限公司，L-苹果酸购于中国食品药品检定研究院；色氨酸购自百灵威科技有限公司(北京)；质谱级甲乙腈，甲酸均购于Thermo scientific公司(美国)，其他化学品与试剂均为分析纯。

4.1.2试验方法

标准品储备溶液的配置：

分别精密称取各标准品富马酸1.08mg，顺式乌头酸0.94mg，柠檬酸1.09mg，乳酸16.84mg，苹果酸1.46mg，琥珀酸1.21mg，α-酮戊二酸0.87mg，色氨酸0.78mg，甘氨酸0.94mg，丝氨酸0.98mg，谷氨酰胺2.47mg，谷氨酸0.81mg，丙氨酸2.45mg，一磷酸腺苷1.36mg，葡萄糖1.68mg，丙酮酸1.08mg于l ml容量瓶中，加蒸馏水定容，配置成标准储备液，置于-80℃冰箱保存，备用。

血浆样品的制备：

取100μL血浆于0.5mL离心管中，加入乙腈200μL，涡旋混匀3min，至于4℃离心机中，12000rpm，离心15min，取上清，在氮吹仪上37℃水浴加热氮气吹干，分别加入5μL正负离子内标后，用90μL水复溶，涡旋混匀3min，至于4℃离心机中，12000rpm，离心15min，取上清于液相小瓶中，备用。

色谱及质谱条件：

色谱柱：Waters，Atlantis

表1梯度洗脱程序

表2正离子模式下分析参数

表3负离子模式下分析参数

4.2实验结果

如图4所示，“实热”上火组与健康正常组相比，血浆中顺式乌头酸，柠檬酸，丙酮酸，AMP(p<0.0001)；α-酮戊二酸(p<0.001)，苹果酸，琥珀酸(p<0.01)，乳酸(p<0.05)显著上升；甘氨酸，丝氨酸，谷氨酰胺，色氨酸(p<0.0001)，葡萄糖，丙氨酸(p<0.05)显著下降；黄连解毒丸组与“实热”上火组相比，富马酸，AMP(p<0.01)，琥珀酸，乳酸，谷氨酸(p<0.05)显著下降。本次研究结果中既与“实热”上火发生机制显著相关，又与黄连解毒丸治疗效果显著相关的指标为琥珀酸，乳酸，谷氨酸，AMP。既与“实热”上火发生机制有相关趋势，又与黄连解毒丸治疗效果有相关趋势的指标为琥珀酸，乳酸，AMP，富马酸，顺式乌头酸，丙酮酸，α-酮戊二酸，苹果酸，柠檬酸，葡萄糖，丙氨酸。

通过上述研究可知TNF-α，IL-8，琥珀酸这三个指标在本次研究结果中既与“实热”上火发生机制显著相关，又与黄连解毒丸治疗效果显著相关。后续需进一步探讨与黄连解毒丸治疗效果相关的指标有IL-4，IL-6，IFN-γ，4-HNE，ACTH，AMP，富马酸，乳酸，谷氨酸，α-酮戊二酸，顺式乌头酸，苹果酸，柠檬酸，葡萄糖，丙氨酸，丙酮酸。

实施例2

采用随机、双盲、安慰剂对照、多中心Ⅱ期临床试验设计，入组与“实热”上火证候符合的受试者，随机分为黄连解毒丸组(A组)和安慰剂组(B组)，分别收集给药前与给药后的生物样品。黄连解毒丸及其模拟剂(安慰剂)：规格：2.5g/袋。由贵州百灵企业集团制药股份有限公司生产提供。试验组A组口服黄连解毒丸，安慰剂组B组口服黄连解毒丸模拟剂，两组服用方法均为1次2袋，1日2次。每例受试者用药期至少3天，用药至“实热火毒证评价量表”中列出的主要症状消失或满5天，以先到达的时间为准。在大样本量的基础上围绕“炎症-氧化应激-能量代谢异常”等引起“实热”上火的关键因素，构建各影响因素间关联性分析，探索和筛选黄连解毒丸治疗“实热火毒证”临床生物标志物。

一、临床疗效研究

根据SAS 9.4统计软件分析系统生成的受试者随机治疗分配，用药周期均为5天，观察治疗前后实热火毒证患者中医证候、中医单项症状积分的变化情况初步探索黄连解毒丸治疗实热火毒证的疗效，采用SPSS 26.0统计学软件进行统计分析。数据显示主要症状消失率黄连解毒丸组69.17％，安慰剂组50.83％；主要症状消失时间黄连解毒丸组为5.00(4.00,5.00)天，安慰剂组为6.00(5.00)天；用药后主要症状(红苔、黄苔、燥苔)评分降低值黄连解毒丸组1.38(0.71)分，安慰剂组0.93(0.95)分；用药后中医症候评分降低值黄连解毒丸组6.09(2.88)分，安慰剂组4.50(3.80)分等。根据研究结果可知，黄连解毒丸组的主要症状消失率、主要症状评分降低值、中医证候评分的降低值以及黄苔评分降低值高于安慰剂组；主要症状消失时间黄连解毒丸组较安慰剂组短。

二、黄连解毒丸治疗“实热”上火证候血浆样品研究

运用MSD电化学发光(MSD electrochemiluminescenc)技术测定了给药前后血浆中炎症因子IFN-γ、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8和TNF-α的含量变化。所有数据采用成对T检验，Wilcoxon秩和分析。

1基于电化学发光技术的黄连解毒丸组与安慰剂组血浆中炎症因子研究

1.1材料与方法

1.1.1试验仪器与材料

MSD超敏多因子试剂盒(货号：K15049D-X；批次：K0081547)；MSD超敏多因子电化学发光分析仪(品牌：美国Meso Scale Discovery；型号：Meso QuickPlex SQ 120)；离心机(品牌：Eppendorf；型号：5424R)；摇床(品牌：IKA；型号：MTS 2/4)；移液枪(品牌：Eppendorf；型号：Research plus)。

1.1.2试验方法

(1)血浆样品在3000rpm/min，4℃下离心15min，取上清进行2倍稀释；加1mL标准品稀释液至标准品中，充分振荡作为最高浓度点，室温下放置15～20min，依次进行2倍稀释，制备7个稀释浓度标准品和一个空白溶液；

(2)取60μL检测抗体，并用抗体稀释液补足至3mL制备检测抗体稀释液；配置1×的PBS(0.05％吐温-20)作为清洗液；配置2×的读板液；

(3)清洗3次MSD板，每次使用150μL的清洗液；每孔加入50μL的样本和标准品，并采用封口膜封上，室温下振荡2小时后按上述方法再次清洗MSD板3次；每孔加入配置好的25μL检测抗体，并用封口膜封上，室温下振荡2小时后按上述方法最后清洗MSD板3次；每孔加入150μL配置好的读板液，上机测定。

1.2炎症因子结果

黄连解毒丸组与安慰剂组IL-2给药前后组间比较P＝0.064，有差异趋势，但无统计学意义，黄连解毒丸组干预后较干预前IL-2显著性下降(P<0.01)，有统计学意义；IL-4，IL-10数据结果显示黄连解毒丸组与安慰剂组给药前基线不一致，采用协方差分析校正后组间比较差异无统计学意义，IL-4在黄连解毒丸组给药后较给药前显著性上升，有统计学意义(P<0.001)，IL-10在黄连解毒丸组给药后有下降趋势但差异无显著性，安慰剂组给药后IL-10下降，差异有统计学意义(P<0.01)。IL-6结果显示黄连解毒丸组与安慰剂组给药前后组间比较差异P＝0.063，有差异趋势，黄连解毒丸组干预后有上升趋势(P＝0.056)；TNF-α结果显示黄连解毒丸组与安慰剂组给药前后组间比较差异无统计学意义，但安慰剂组给药后显著性下降，有统计学意义(P<0.01)。炎症因子IFN-γ，IL-12p70，IL-13，IL-1β，IL-8结果显示黄连解毒丸组和安慰剂组给药后组内比较和组间比较差异均无统计学意义。

2黄连解毒丸组与安慰剂组血浆中能量代谢及氧化应激相关因子研究

2.1材料与方法

人ATP合酶ELISA试剂盒(Cat：OM626460)；人ACTH ELISA试剂盒(Cat：OM527142)；人4-HNE ELISA试剂盒(Cat：OM521593)购于Omnimabs公司(加利福尼亚州，美国)。所有操作均按照制造商的建议进行。

2.2结果

如图5和表4所示，所有数据使用GraphpadPrism 8.0.2软件采用成对T检验，Wilcoxon秩和分析，4-HNE结果显示，黄连解毒丸组与安慰剂组给药前后组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，黄连解毒丸组给药后较给药前4-HNE显著下降(P<0.05)，安慰剂组无统计学意义，并呈现上升趋势；ATP结果显示，给药后黄连解毒丸组与安慰剂组均显著下降(P<0.05)；ACTH分析结果显示黄连解毒丸组与安慰剂组给药后均显著下降(P<0.05)。

表4血浆中三磷酸腺苷(ATP)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、4-羟基壬烯醛(4-HNE)给药前后变化情况

注：A组：黄连解毒丸组；B组：安慰剂组

3黄连解毒丸组与安慰剂组血浆中三羧酸循环中间代谢物定量研究

3.1结果

柠檬酸分析结果显示黄连解毒丸组与安慰剂组给药前后组间比较P＝0.053，有差异趋势，安慰剂组给药后显著下降(P<0.01)；黄连解毒丸组与安慰剂组给药前后组间比较α-酮戊二酸有统计学意义(P<0.01)，安慰剂组给药后显著下降(P<0.001)；顺式乌头酸结果显示黄连解毒丸组与安慰剂组给药前后组间比较有统计学意义(P<0.05)，安慰剂组给药后显著下降(P<0.01)；富马酸，苹果酸，丙酮酸结果显示黄连解毒丸组与安慰剂组给药前后组间比较差异无统计学意义，但黄连解毒丸组富马酸给药后P＝0.062有下降趋势，安慰剂组给药后富马酸显著下降(P<0.01)，苹果酸P＝0.053，丙酮酸P＝0.075有下降趋势；琥珀酸，谷氨酸，谷氨酰胺，丙氨酸，色氨酸，甘氨酸，乳酸，丝氨酸，AMP，葡萄糖结果显示黄连解毒丸组和安慰剂组给药后组内比较和组间比较差异均无统计学意义。

三、黄连解毒丸治疗“实热”上火证候唾液样品研究

1黄连解毒丸组与安慰剂组唾液中炎症因子研究

1.1材料与方法同“二、黄连解毒丸治疗“实热”上火证候血浆样品研究”

1.2结果

唾液中IL-10结果显示黄连解毒丸组和安慰剂组给药前后组间比较有统计学意义(P<0.05)，黄连解毒丸组唾液中IL-10给药后有上升趋势与前期实验结果趋势一致，但差异无统计学意义，安慰剂组给药后显著下降(P<0.01)；IL-6分析结果显示黄连解毒丸组和安慰剂组给药前后组间比较P＝0.095，有差异趋势，安慰剂组给药后显著下降(P<0.001)；IL-8数据结果显示黄连解毒丸组和安慰剂组给药前基线不一致，采用协方差分析校正后组间比较差异无统计学意义，但黄连解毒丸组给药后P＝0.063，有下降趋势，安慰剂组给药后显著性下降(P<0.01)；IFN-γ，IL-12p70，IL-13，IL-1β，IL-2，TNF-α在黄连解毒丸组和安慰剂组给药前后组间比较差异无统计学意义，但IFN-γ分析结果显示黄连解毒丸组给药后P＝0.052，有下降趋势，安慰剂组给药后显著下降(P<0.01)；IL-12p70分析结果显示黄连解毒丸组给药后显著上升(P<0.05)；IL-13结果显示黄连解毒丸组和安慰剂组给药后下降差异均有统计学意义(P<0.01，P<0.001)；IL-1β分析结果显示安慰剂组给药后显著下降(P<0.05)；IL-2结果显示黄连解毒丸组和安慰剂组给药后均显著下降(P<0.0001，P<0.01)；TNF-α分析结果显示安慰剂组给药后显著下降(P<0.001)；IL-4结果显示黄连解毒丸组和安慰剂组给药前后组内比较和组间比较差异均无统计学意义。

2黄连解毒丸组与安慰剂组唾液中三羧酸循环中间代谢物定量研究

2.1材料与方法同“二、黄连解毒丸治疗“实热”上火证候血浆样品研究”

2.2结果

黄连解毒丸组给药后琥珀酸显著下降(P<0.05)，谷氨酸P＝0.053，有下降趋势，谷氨酰胺显著下降(P<0.001)；丙氨酸P＝0.077，具有下降趋势，安慰剂组给药后与给药前组内比较琥珀酸，丙氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺无统计学意义；分析结果显示黄连解毒丸组与安慰剂组给药后色氨酸均显著下降(P<0.001，P<0.05)；甘氨酸结果显示黄连解毒丸组与安慰剂组给药后均显著下降(P<0.05；P<0.01)；柠檬酸分析结果显示安慰剂组给药后下降有统计学意义(P<0.05)。富马酸，苹果酸，α-酮戊二酸，乳酸，丝氨酸，AMP结果显示黄连解毒丸组和安慰剂组给药后组内比较和组间比较差异均无统计学意义。

四、黄连解毒丸治疗“实热”上火证候尿液样品研究

根据“上火”症状，小便赤黄也是临床诊断指标之一，本研究初步设想分析一下引起小便赤黄的物质，首先按分组(A组、B组)进行分析给药前后颜色的变化。

(1)颜色对比：通过比色卡比对A组114例，B组111例样本，结果显示颜色变化较大中，A组给药后颜色变浅的有29例，颜色变深的有30例；B组给药后颜色变浅的有31例，颜色变深的有18例。尿液给药前后颜色变化见表5。

表5

(2)差异代谢物变化根据973项目结果指示关注尿样中的差异代谢物：泛酸，次黄嘌呤的相对含量。因此对泛酸和次黄嘌呤进行了统计分析。

按分组(A组、B组)进行分析，本试验测定了给药前后尿液中泛酸和次黄嘌呤含量变化，结果见表3。组间比较采用成组t检验，组内比较采用配对t检验。给药前基线不均衡时，采用协方差分析校正基线水平。

表3尿样中成分给药前后变化情况

泛酸分析结果显示A组，B组给药前后的OD值组间比较差异有统计学意义(P＝0.040)，A组和B组给药后之间具有统计学差异(P<0.05)，A组给药后呈上升趋势且具有统计学差异(P<0.05)，B组呈下降趋势差异有统计学意义(P<0.05)；泛酸是辅酶A的前体，一个重要作用是以乙酰辅酶A的形式参加代谢过程，CoA促进机体内的脂肪酸β-氧化。泛酸缺乏时，CoA下降，脂肪酸的β-氧化受到抑制，在某些应激情况下如感染、长期饥饿、营养不良时更易出现CoA的不平衡。泛酸不仅促进脂肪酸的氧化，而且还通过不同的机制保护生物膜系统，对抗脂质过氧化，保证机体细胞结构的完整，从而维持机体的正常生理功能。本研究结果显示A组给药后尿液中泛酸明显上升，B组明显下降，两组间差异比较有统计学意义。

次黄嘌呤分析结果显示A组，B组给药前后的OD值组间比较差异有统计学意义(P＝0.001)，A组和B组给药后之间具有统计学差异(P＝0.001)，A组给药后呈上升趋势且具有统计学差异(P<0.05)，B组呈下降趋势差异有统计学意义(P＝0.001)。次黄嘌呤是核苷的代谢产物，是一种重要的生物碱嘌呤，参与能量代谢其也是腺苷的中间代谢物，腺苷在ATP与ADP转换过程中发挥重要作用。本研究结果显示A组给药后尿液中次黄嘌呤呈上升趋势，B组给药后呈下降趋势，两组间差异比较有统计学意义。

此次实热火毒证以七个主要中医症状的轻重程度为评价标准，主要症状为面红目赤，红肿热痛，咽喉肿痛，口鼻气热，口舌生疮，小便黄赤，大便燥结。面红目赤指面部颜色红于正常人，双眼或单眼白睛部位发红的表现，可能与能量代谢紊乱有关。红肿热痛指即损伤或炎症导致的身体某部位组织的肿胀及疼痛，伴有灼热之感；咽喉肿痛指咽喉红肿疼痛。这两个主要症状与机体整体和局部所表现出的炎症反应密切相关。口鼻气热指呼出气体温度较高，口鼻有较重的灼热感，可能与能量代谢紊乱有关。口舌生疮指以口腔内的唇、舌、颊及上颚等处肌膜见单个或多个淡黄色或灰白色如豆大的溃疡点灼热疼痛、反复发作为主要表现，可能为炎症反应、氧化应激及能量代谢引起的内环境紊乱所造成的粘膜损伤。小便黄赤指尿液的颜色呈深黄、黄红或黄褐色，甚至尿如浓茶的表现，可能是能量代谢异常引起的尿液中成分的变化。大便燥结指粪便干燥坚硬，排便困难，排便次数减少的表现。传统医学认为的上火所表现的目赤肿痛、口干渴、口舌生疮、咽喉疼痛、小便短赤、大便秘结等各种症状与现代医学炎症急性反应期所呈现的局部红肿热痛以及功能失调相类似。本次研究筛选出的唾液中IL-10，血浆中4-HNE和尿液中泛酸，次黄嘌呤这四个指标与上火临床证候表现红肿热痛，咽喉肿痛，口舌生疮，小便黄赤高度相关。唾液中IL-8，琥珀酸和谷氨酰胺，血浆中IL-4，IL-6，柠檬酸等有可能与上火临床证候表现面红目赤，红肿热痛，咽喉肿痛，口鼻气热，口舌生疮有关。

前期基于多因子检测和多组学分析，对黄连解毒丸干预“实热”上火证候生物标志物进行小样本量发现研究，结果显示黄连解毒丸能够显著调节炎症因子(TNF-α、IL-10、IL-8和IL-4)、氧化应激因子(4-HNE和ACTH)、能量代谢因子(柠檬酸、琥珀酸、糖皮质激素、ATP、乳酸脱氢酶、丙酮酸和乳酸)以及差异脂质和代谢物。将这些差异表达的物质通过网络相关性分析，发现其与ATP和TCA循环密切相关。本发明通过小样本量进一步进行验证研究，确证黄连解毒丸能够显著调节TNF-α，IL-8，4-HNE和琥珀酸，综合验证试验结果考虑，IL-4，IL-6，IFN-γ，ACTH，AMP，富马酸，乳酸，谷氨酸，α-酮戊二酸，顺式乌头酸，苹果酸，柠檬酸，葡萄糖，丙氨酸，丙酮酸仍需进一步验证。通过Ⅱ期临床随机、双盲、多中心、安慰剂组对照大样本量探索与筛选研究，发现A组效果好于B组，本研究已在2021.9.10日进行了揭盲，A组为黄连解毒丸组，B组为安慰剂组。因此，唾液中IL-10，血浆中4-HNE和尿液中泛酸、次黄嘌呤可以成为黄连解毒丸的疗效或实热火毒证病机演变的生物标志物。A组组内差异有统计学意义，B组内无统计学差异的是唾液中IL-8，琥珀酸，谷氨酰胺，血浆中IL-4等，其中琥珀酸在前期小样本实验中也证实黄连解毒丸可以显著降低琥珀酸的水平。因此，本发明的黄连解毒丸干预的实热上火证候的临床生物标志物为TNF-α、IL-8、IL-10、4-HNE、琥珀酸、泛酸或次黄嘌呤。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。