氧化苦参碱作为天然抑制剂在制备抗焦亡药物中的应用

摘要

本发明公开了氧化苦参碱作为天然抑制剂在制备抗焦亡药物中的应用，属于医药技术领域。本发明发现LPS/ATP联合刺激对腹腔巨噬细胞及小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7焦亡有促进作用。本发明首次发现氧化苦参碱在巨噬细胞体外焦亡实验中可以通过抑制caspase‑1与GSDMD及其活性形式产生从而发挥抑制焦亡治疗疾病的保护作用。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种氧化苦参碱作为天然抑制剂在制备抗细胞焦亡药物中的应用。

背景技术

细胞焦亡是一种新发现的由胱天蛋白酶介导的细胞死亡方式。细胞焦亡由特定细胞时间与特殊病原体引发，经模式识别受体介导，并最终引起GSDMD在细胞膜内侧形成非选择性大分子通道引起细胞内容物释放。该细胞死亡方式属于非特异性免疫的组成部分，可引起强烈的炎症反应，越来越多的证据表明，NLRP3炎症小体诱导的细胞焦亡在慢性炎症性疾病如溃疡性结肠炎、克罗恩病、痛风、银屑病等中有重要的作用。

NLRP3广泛分布于上皮组织、固有层组织以及免疫细胞中。区别于AIM2、pyrin、NAIP1等其他类型由特定的病原体组分激活的炎症小体，NLRP3炎症小体可以感知各种由感染产生的病原体模式分子(PAMP)或无菌损伤相关分子模式(DAMP)，如毒素、病原体、尿酸结晶及ATP等，是自身免疫疾病的重要靶点。

NLRP3炎症小体由NLRP3、ASC、caspase-1组装而成，此大分子复合物的中caspase-1形成具有酶活性active-caspase-1，进而切割GSDMD、IL-1β、IL-18引起细胞焦亡。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)以无活性前体形式储存于细胞质中。在焦亡的经典途径中，活化的炎性小体可促进胞内caspase-1自身剪切成为有活性的active-caspase-1，并进一步剪切GSDMD、IL-1β、IL-18的胱天蛋白酶酶切位点使之成熟。GSDMD位于细胞焦亡信号通路末端，为细胞焦亡执行蛋白。正常情况下，具有膜结合性的氨基端结构域GSDMD-N被其天然抑制剂羧基端结构域GSDMD-C抑制。active-caspase-1对GSDMD的裂解位点位于GSDMD-N和GSDMD-C相连的部位。焦亡发生时，GSDMD裂解使GSDMD-C解除对GSDMD-N的抑制，GSDMD-N立即发生寡聚化并转位至胞膜上，与细胞膜内侧酸性磷脂结合形成非选择性大分子通道，并引起细胞内容物外泄，最终使细胞发生溶解死亡。同时，胞内无法跨膜转运的促炎因子如IL-1β，IL-18也可通过GSDMD-N形成的通道释放至胞外放大炎症反应。

综上所述，NLRP3炎症小体活化是炎症疾病广泛存在的炎症放大机制，找到一种NLRP3炎症小体抑制剂就成为了一个具有潜力的药物靶点，在治疗过度炎症反应引起的慢性自身免疫疾病中有着重要的作用前景。然而，目前尚没有良好的天然药物作为NLRP3炎症小体信号通路抑制剂抑制细胞焦亡的报告。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种氧化苦参碱作为天然抑制剂在制备抗焦亡药物中的应用。

一种氧化苦参碱作为天然抑制剂在制备抗细胞焦亡药物中的应用。

进一步地，上述技术方案中，所述细胞包括巨噬细胞。

进一步地，上述技术方案中，所述巨噬细胞包括腹腔巨噬细胞、单核巨噬细胞白血病细胞系RAW264.7。

进一步地，上述技术方案中，所述药物的剂型包括注射剂、栓剂、片剂、颗粒剂。

进一步地，上述技术方案中，所述药物的剂量为≥50μM。

进一步地，上述技术方案中，所述药物的剂量为50μM～250μM。

有益效果：氧化苦参碱可以降低无菌损伤模式分子NLRP3介导的细胞焦亡通路中caspase-1、GSDMD的表达，减少其具有杀伤细胞作用的对应活化形式active-caspase-1与GSDMD-N产生，减少强致炎物质cleave-IL-1β产生。

本发明发现LPS/ATP联合刺激对腹腔巨噬细胞及小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7焦亡有促进作用。本发明首次发现氧化苦参碱可以通过抑制caspase-1与GSDMD及其活性形式产生从而发挥抑制焦亡治疗疾病的保护作用。

附图说明

图1为本发明实施例1中通过Western blot分析TNBS干预后8小时、24小时、3天、6天、9天结肠组织中NLRP3炎症小体表达与激活情况。

图2为本发明实施例1中通过Western blot分析OMT80mg/kg治疗8-24小时结肠组织中NLRP3炎症小体激活情况。

图3为本发明实施例1中通过Western blot分析OMT80mg/kg治疗6天结肠组织中NLRP3炎症小体激活情况。

图4为本发明实施例2中RAW264.7细胞LPS/ATP联合诱导细胞焦亡镜下观察图。

图5为本发明实施例2中RAW264.7细胞LPS/ATP联合诱导细胞焦亡后15、30、45minLDH释放法检测细胞死亡率统计图。

图6为本发明实施例2中RAW264.7细胞caspase-1、GSDMD表达与激活情况。

图7为本发明实施例2中Western blot分析LPS刺激大鼠原代腹腔巨噬细胞NLRP3炎症小体信号通路相关蛋白表达情况。

图8为本发明实施例2中Western blot分析大鼠原代腹腔巨噬细胞LPS/ATP联合诱导细胞焦亡相关蛋白caspase-1、IL-1β表达与激活情况。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1氧化苦参碱作为天然抑制剂在抑制大鼠实验性结肠炎模型中的抗焦亡作用

1.1实验动物

SPF级6-7周龄的SD雄性大鼠，体重250±20g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司(动物许可证号：SCXK(辽)2020-0001)

1.2实验材料

大鼠维持饲料购于辽宁长生生物技术股份有限公司；5％w/v三硝基苯磺酸(TNBS)溶液购于Sigma；无水乙醇购于天津市科密欧化学试剂有限公司科密欧；一次性直肠给药管购于邯郸一超医疗器械销售有限公司；水合氯醛购于国药集团化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲溶液(PBS)购于德国欧蒙公司；

1.3TNBS诱导大鼠溃疡性结肠炎模型制备及给药

雄性SD大鼠250±10g，造模前禁食24h。10％水合氯醛腹腔注射麻醉，35mg/kgTNBS(MP生物制药),配制40％乙醇溶液经硅胶管注入距肛门8cm处。大鼠次日出现明显稀便血便及腹痛症状，即获得TNBS诱导大鼠溃疡性结肠炎模型。自TNBS诱导UC前2天开始治疗组每日经肛门灌入40、80mg/kg OMT(氧化苦参碱)(Bidepharm,BD8220)，阳性对照组每日给予0.4g/kg 5-Aminosalicylic Acid(5-氨基水杨酸，5-ASA)(Macklin,C12848546)混悬液，造模后给药六天。空白对照组(ctrl组)和TNBS模型组(model组)均直肠灌注等量生理盐水。

1.4Western blot法检测TNBS诱导实验性结肠炎大鼠结肠粘膜在不同时间细胞焦亡相关蛋白表达量

NLRP3炎症小体的表达和激活在体内受到严格调控，在炎症反应的不同阶段可能有不同的表现。通过Western blot法检测了TNBS注射后8小时至9天NLRP3炎性体信号通路表达和激活的变化，观察NLRP3炎性体作用的规律性。GSDMD-N、active-caspase-1和IL-1β-mature在24h达到峰值，表明TNBS诱导的UC中NLRP3炎性体激活诱导的细胞焦亡主要发生在TNBS输注后24h内。此外，IL-1β-成熟度和GSDMD-N从1到6天逐渐消失(图1)。

1.5Western blot法检测在氧化苦参碱干预下对溃疡性结肠炎早期细胞焦亡相关蛋白表达量

由于细胞焦亡主要发生在炎症反应初期，我们分别检测了TNBS大鼠结肠的8h和24h样本，旨在揭示氧化苦参碱对NLRP3炎症小体信号通路及其下游蛋白激活的影响。激活效果。Western blot结果显示，作为感觉刺激的NLRP3在TNBS干预后8h内显着下调，这可能与保护机体免受过度刺激有关。在NLRP3炎症小体信号通路中起关键催化作用的Active-caspase-1在TNBS干预后24小时显着增加，而OMT 80mg/kg预给药可显着抑制active-caspase-1的产生。另一方面，相应的前体蛋白caspase-1和IL-1β在8h时无显着差异，但24h样品的OMT处理组与模型组相比有显着降低(图2)。

1.6Western blot法检测在氧化苦参碱干预下对溃疡性结肠炎愈后细胞焦亡相关蛋白表达量

与ctrl组相比，模型组caspase-1、IL-1β和GSDMD的表达水平升高。但氧化苦参碱40和80mg/kg组和5-ASA阳性对照组的NLRP3、caspase-1和GSDMD水平显着降低，IL-1β水平没有明显降低，提示氧化苦参碱作为NLRP3炎症小体信号通路抑制剂可以在实验性结肠炎中发挥抗焦亡作用(图3)。

实施例2氧化苦参碱作为天然抑制剂在抑制巨噬细胞焦亡的作用

2.1实验动物及细胞

SPF级6-7周龄的SD雄性大鼠，体重250±20g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司(动物许可证号：SCXK(辽)2020-0001)；小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系RAW264.7，购于China Center for Type Culture Collection(CCTCC,Shanghai)。

2.2实验材料

大鼠维持饲料购于辽宁长生生物技术股份有限公司；DMEM高糖培养基购于Gbico；F-12培养基购于广州鼎国生物技术有限公司鼎国；BCA蛋白浓度测定试剂盒购于Solarbio；LPS购于Solarbio；ATP购于Solarbio；NLRP3抗体购于沈阳万类生物科技有限公司；caspase-1/active-caspase-1,、IL-1β/cleave-IL-1β、GSDMD/GSDMD-N购于ABclonal；山羊抗兔IgG-HRP抗体购于ABclonal；β-actin抗体购于Bioworld；山羊抗小鼠IgG-HRP抗体购于ABclonal；胎牛血清购于上海鼎国生物技术有限公司；青霉素-链霉素双抗购于Solarbio；90mm细胞培养皿购于NEST；细胞刮刀购于NEST；

2.3腹腔巨噬细胞制备及培养

SD大鼠购得后应尽快用于实验。乙醚麻醉下脱颈处死SD大鼠，腹腔注射预冷的F12培养基10ml，按揉腹部5min，逐层剪开腹部皮肤及腹膜收集腹腔灌洗液。将收集的灌洗液4℃、1000rpm离心10min收集沉淀，以10

2.4RAW264.7细胞培养

小鼠巨噬细胞系RAW264.7在含10％FBS，1％青链霉素DMEM高糖培养基中培养，并储存在37℃、5％CO

2.5细胞焦亡模型制备及给药

生长状态良好的RAW264.7细胞用细胞刮刀刮下后反复吹打使之充分分散，1100rpm离心5min收集沉淀。将分散后的细胞以10

如图4所示，与ctrl组巨噬细胞比较，model组巨噬细胞膜出现明显凸出物，并伴有孔隙形成,细胞膜完整性受到破坏，内容物释放。OMT250μM组细胞膜完整性破坏得到纠正。图5中结果显示，经3mM ATP处理后与ctrl组相比，model组在45min出现明显死亡；与model组相比OMT 100μM和250μM处理使细胞死亡率显著降低(P＜0.05)。说明OMT提前处理可以抑制巨噬细胞焦亡。

2.6western blot法检测RAW264.7单核巨噬细胞系相关蛋白表达量

在RAW264.7细胞中，经过LPS致敏的细胞caspase-1明显升高，经ATP刺激后active-caspase-1与GSDMD-N水平上升。OMT 50-250μmol/L治疗逆转了LPS引起的caspase-1的表达，并降低了active-caspase-1与GSDMD-N的水平(图6)。

2.7western blot法检测腹腔原代巨噬细胞相关蛋白表达量

图7结果显示，在大鼠原代腹腔巨噬细胞上我们进一步研究该现象，仅LPS刺激的大鼠腹腔巨噬细胞使得炎症小体组分caspase-1水平升高，cleave-caspase-1的底物GSDMD、IL-1β出现明显上调，经过50-250μmol/LOMT干预后，GSDMD、caspase-1出现明显下调。模型组相较于正常组active-caspase-1与cleave-IL-1β出现上调。OMT提前1h给药后，在50-250μmol/L剂量范围内呈现剂量依赖性下调。说明OMT可以通过下调caspase-1表达，从而抑制active-caspase-1的产生及其下游通路的激活(图8)。

需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。