一种芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱及其建立方法和应用

摘要

本发明公开了一种芪蛭胶囊UPLC‑UV对照指纹图谱，由35个特征峰组成。本发明还公开了一种芪蛭胶囊UPLC‑UV对照指纹图谱的建立方法及其在芪蛭胶囊整体质量控制中的应用。本发明公布的对照指纹图谱是利用超高效液相色谱分离和紫外光谱双波长切换扫描采集获得，确定了35个特征峰组成，其中7个特征峰用对照品进行指认，特征峰涵盖了芪蛭胶囊组方全药味的化学信息，既包括植物药又包括动物药，既包含脂溶性成分又包含水溶性成分，能够用于芪蛭胶囊的全药味整体质量控制。

说明书

技术领域

本发明涉及一种芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱及其建立方法和应用，属于中药质量控制技术领域。

背景技术

中药指纹图谱是指所共有的、具有特异性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。通过指纹图谱的特异性，能有效鉴别样品的真伪与来源；通过指纹图谱主要特征峰的含量或比例，能有效控制样品的整体质量，确保样品质量的相对稳定。与现有的单一有效成分或指标性成分的鉴定相比，中药指纹图谱技术在一定范围内能基本反映中药整体概貌，使其质控指标由原有的对单一成分的测定上升为对整个中药内在品质的检测，实现对整体物质的全面控制和中药内在质量的综合评价，有效保障了中医临床疗效的稳定。特别是，中药复方由几味乃至十余味中药组成，具有“君臣佐使”配伍特点，其临床疗效是来源于多味中药的多种活性成分综合作用的结果，采用测定其中一个或几个成分含量的方法，很难保证产品的质量及疗效。中药色谱指纹图谱技术为中药复方制剂的质量控制提供了有效方法，然而，由于中药复方化学成分复杂，特别是包含植物药和动物药的中药复方，化合物极性范围宽泛，使建立能够全面表征复方全药味成分信息的指纹图谱具有极大挑战性。

芪蛭胶囊是由哈尔滨中药四厂有限公司生产的中药复方制剂，由黄芪、水蛭、桃仁、三棱、莪术、何首乌、山楂、决明子、土鳖虫等9味中药制备而成，现行质量标准中仅对黄芪、莪术、水蛭、何首乌进行薄层鉴别和对2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷(来源于何首乌)进行含量测定，而三棱、山楂、决明子、土鳖虫的物质基础信息均未在质量标准中体现，因此，现行质量标准不能有效控制制剂的质量，有待建立新的质量控制方法。

色谱指纹图谱技术为建立芪蛭胶囊的全药味化学信息提供了表征方法，有助于实现芪蛭胶囊全药味的整体质量控制。然而，芪蛭胶囊组方复杂，既含有植物药又含有动物药，既含有药材全粉又含有药材水提物，既含有极性的嘌呤类成分又含有非极性的脂质和挥发性成分，化学成分极性跨度大，含量范围差异大，因此，建立能够表征芪蛭胶囊全药味化学信息的色谱指纹图谱具有一定技术难度。本发明利用超高效液相色谱的高分离度和高峰容量的性能，优选色谱柱，优化色谱流动相洗脱程序，整合双波长检测，建立了涵盖组方全药味化学信息的芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱，进一步优化相似度评价方法，实现了芪蛭胶囊的整体、全药味质量控制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术存在的上述问题，提供一种芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱及其建立方法和应用，以克服现有技术的不足之处。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱，由35个特征峰组成，以18号峰为参照峰，计算各特征峰与参照峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.11-峰1、0.13-峰2、0.14-峰3、0.18-峰4、0.19-峰5、0.21-峰6、0.27-峰7、0.29-峰8、0.42-峰9、0.59-峰10、0.61-峰11、0.66-峰12、0.72-峰13、0.74-峰14、0.75-峰15、0.87-峰16、0.98-峰17、1.00-峰18、1.13-峰19、1.17-峰20、1.21-峰21、1.43-峰22、1.44-峰23、1.58-峰24、1.68-峰25、1.74-峰26、1.76-峰27、1.77-峰28、1.79-峰29、1.85-峰30、1.93-峰31、2.06-峰32、2.07-峰33、2.12-峰34、2.14-峰35。

为对芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱主要特征峰进行鉴定，利用化学对照品进行指认，其中，峰2为次黄嘌呤，峰5为尿囊素，峰15为苦杏仁苷，峰17为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，峰18为2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷，峰22为橙黄决明素，峰31为吉马酮。

本发明对特征峰的来源进行了药材归属，其中，峰7、17、19、20、21、23为黄芪特征峰，峰1、2、32为水蛭特征峰，峰24、26、27、28、29、31为莪术特征峰，峰30为三棱特征峰，峰10、14、15为桃仁特征峰，峰4、16为山楂特征峰，峰3、8为土鳖虫特征峰，峰6、22为决明子特征峰，峰13、18、25为何首乌特征峰，峰9为新产生峰。

芪蛭胶囊由以下重量份数的原料药制成：黄芪100～400份、水蛭40～160份、桃仁75～300份、何首乌75～300份、莪术55～220份、三棱55～220份、决明子62.5～250份、山楂62.5～250份和土鳖虫15～60份。

一种芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

取芪蛭胶囊内容物细粉0.5-5.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入适当浓度的甲醇10-100mL，称定重量，超声提取10-100分钟，放冷，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

芪蛭胶囊样品的供试品溶液利用超高效液相色谱法进行成分的分离，色谱条件为：Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1×100mm，1.8μm)，流动相乙腈-0.05～0.3％磷酸水溶液，线性梯度洗脱，流速0.2～0.5mL/min，柱温20～40℃，进样量0.5～5μL；

流动相线性洗脱梯度为：0～3min，乙腈1→4％；3～4min，乙腈4→8％；4～7min，乙腈8→11％；7～18min，乙腈11→64％；18～22min，乙腈64→100％；22～24min，乙腈100％；

采用紫外光谱双波长切换扫描方式进行检测，检测波长为：0～5min检测波长为260nm，5～24min检测波长为210nm；

取至少10批芪蛭胶囊样品，分别制备供试品溶液，采集指纹图谱，导入国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，生成对照指纹图谱。

为标定芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱特征峰的保留时间，采用保留时间居中、峰面积较大的18号峰(2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷)作为参照峰，优化的参照物溶液的制备方法为：取2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷对照品适量，加75％甲醇制成浓度为40μg/mL的溶液。

芪蛭胶囊内容物的溶解方法为采用75％甲醇溶解。

本发明的芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱，其生成方法是通过制备10批芪蛭胶囊样品的供试品溶液，采集UPLC-UV指纹图谱，利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行处理，生成包含35个共有特征峰的芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱。

一种芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱在芪蛭胶囊整体质量控制中的应用。

以18号峰之外的34个特征峰用于相似度评价，样品指纹图谱与对照指纹图谱比较的相似度不得低于0.90。

将18号峰之外的34个特征峰进行统一积分后，将所得图谱以AIA格式导入国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行相似度计算，除18号峰外，样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度应不得低于0.90。

本发明的有益效果是：

(1)芪蛭胶囊由9味中药制备而成，既包括植物药，又包括动物药，其活性成分极为复杂，其中动物药水蛭、土鳖虫的活性成分为水溶性的次黄嘌呤、尿囊素、多肽等成分，而莪术、三棱的活性成分为吉马酮等脂溶性成分，另外还含有氰苷、黄酮苷、苯乙烯苷、蒽醌、脂质、有机酸等成分，给表征全药味化学信息带来了困难。本发明的芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱，经对照品比对和药材来源归属分析，表明能够使水溶性和脂溶性成分、动物药和植物药成分、代表组方原料药的成分，都能得到表征，从而能够用于芪蛭胶囊整体质量控制。

(2)本发明公布的芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱应用于10批芪蛭胶囊样品的质量评价，各批次样品指纹图谱相似度均大于0.9，表明芪蛭胶囊批次间具有较好的一致性。应用于超过保质期芪蛭胶囊样品质量分析，发现相似度显著低于0.9，指纹图谱特征峰中来源于山楂、莪术的特征峰显著降低或消失，表明本发明的对照指纹图谱能够有效控制芪蛭胶囊的质量。

(3)本发明公布的芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱，在24分钟内完成良好的分离和紫外光谱双波长切换扫描检测，与HPLC-UV法、TLC法等其检测方法相比，不仅检测组方全药味特征化学成分信息，而且具有操作简便、快速、准确的优点，实现了芪蛭胶囊的整体质量控制，有效保障了芪蛭胶囊的质量可控性和疗效稳定性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱；

图2为10批芪蛭胶囊UPLC-UV指纹图谱；

图3为超过保质期芪蛭胶囊样品UPLC-UV指纹图谱与对照指纹图谱的比较图；

图4为芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱特征峰的药材归属图；

图5为芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱特征峰的化学成分指认图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合附图及实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

1.供试品溶液的制备

取芪蛭胶囊样品内容物细粉2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇20mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.参照物溶液的制备

精密称取2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成每1mL分别含100μg的对照品溶液，作为参照物溶液。

3.色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1×100mm，1.8μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，线性梯度洗脱程序如下表；检测波长:0～5min检测波长为260nm，5～24min检测波长为210nm；柱温为30℃；流速为0.4ml/min。

4.对照指纹图谱的建立

取10批芪蛭胶囊样品，分别制备供试品溶液，采集指纹图谱，导入国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)，生成对照指纹图谱(见图1)，选择35个共有峰作为对照指纹图谱的特征峰。芪蛭胶囊对照指纹图谱中峰18(2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷)的峰面积最大，分离度良好，保留时间适中，选择峰18作为参照峰，分别计算各特征峰与之相比的相对保留时间，用于标定各共有峰。35个特征峰的相对保留时间为：0.11(峰1)、0.13(峰2)、0.14(峰3)、0.18(峰4)、0.19(峰5)、0.21(峰6)、0.27(峰7)、0.29(峰8)、0.42(峰9)、0.59(峰10)、0.61(峰11)、0.66(峰12)、0.72(峰13)、0.74(峰14)、0.75(峰15)、0.87(峰16)、0.98(峰17)、1.00(峰18)、1.13(峰19)、1.17(峰20)、1.21(峰21)、1.43(峰22)、1.44(峰23)、1.58(峰24)、1.68(峰25)、1.74(峰26)、1.76(峰27)、1.77(峰28)、1.79(峰29)、1.85(峰30)、1.93(峰31)、2.06(峰32)、2.07(峰33)、2.12(峰34)、2.14(峰35)。

实施例2：

芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱在芪蛭胶囊整体质量控制中的应用：

1.芪蛭胶囊样品UPLC-UV指纹图谱特征峰的认定：

取10批芪蛭胶囊样品，分别制备供试品溶液，采集指纹图谱，导入国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)，分别与芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱比较，认定样品指纹图谱中的特征峰，结果表明各批芪蛭胶囊样品指纹图谱均含有对照指纹图谱中的35个特征峰(见图2)。

2.芪蛭胶囊样品UPLC-UV指纹图谱相似度的计算：

芪蛭胶囊指纹图谱中峰18(2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷)的峰面积最大，但由于占总峰面积为30％，不利于指纹图谱相似度的整体评价，以峰18之外的其他34个共有峰进行指纹图谱相似度计算，各峰的峰面积差异较小，有利于芪蛭胶囊的整体质量控制。采集10批芪蛭胶囊样品的指纹图谱，除峰18外，对其它34个共有峰进行统一积分后，将所得图谱以AIA格式导入国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)进行相似度计算。结果表明各批芪蛭胶囊样品指纹图谱与对照指纹图谱比较的相似度均大于0.9，具体见表1。

表1芪蛭胶囊样品UPLC-UV指纹图谱与对照指纹图谱比较的相似度

3.已超过保质期芪蛭胶囊样品UPLC-UV指纹图谱相似度的计算：

取已过期芪蛭胶囊样品(批号为190101)，制备供试品溶液，采集指纹图谱，导入国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)，与芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱比较(见图3，其中，S1为超过保质期芪蛭胶囊样品UPLC-UV指纹图谱，S2为对照指纹图谱)，计算相似度，结果已过期芪蛭胶囊样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度为0.846，小于0.9。比较各特征峰发现，过期样品指纹图谱中，13号、16号、24号、27号、29号峰等来源于山楂、莪术的特征峰显著降低或消失。表明本发明的对照指纹图谱，由35个特征峰为组成，设定相似度不小于0.9，能够有效控制芪蛭胶囊的质量。

实施例3：

参照物峰选择的可行性分析：

为了说明18号峰(2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷)相对峰面积太大，不利于指纹图谱整体相似度的评价，利用已过保质期的芪蛭胶囊样品(批号为190101)指纹图谱作为评价对象，比较18号峰排除前后的相似度。批号为190101芪蛭胶囊指纹图谱与对照指纹图谱的比较见图3，图中可见13号、16号、24号、27号、29号峰在该批芪蛭胶囊样品中未检出或仅微量检出，显然该批样品由于超过保质期，其指纹图谱特征峰强度显著减少，不能保障应有的临床疗效。不排除18号峰时该批样品指纹图谱相似度达到0.97，而排除18号峰后该批样品指纹图谱相似度为0.846，低于0.9，与13号、16号、24号、27号、29号特征峰显著减少或消失显著相关，显然以排除18号峰的其他34个特征峰进行指纹图谱相似度计算是合理的，有利于芪蛭胶囊的整体质量控制。因此，本发明以18号峰之外的34个共有峰作为相似度评价指标，并限定与对照指纹图谱比较相似度不小于0.9，能够有效控制芪蛭胶囊的整体质量。需要说明的是，对18号峰的控制已在质量标准含量测定项中进行了控制，本对照指纹图谱作为原质量标准的提升，更全面控制了芪蛭胶囊的质量。

实施例4：

芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱特征峰的药材归属：

为说明芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱能够表征组方各原料药材的代表性化学成分，对特征峰的药材来源进行了归属分析。

1.芪蛭胶囊样品供试品溶液的制备：

取芪蛭胶囊样品，按照对照指纹图谱检测的供试品溶液制备方法，制备芪蛭胶囊样品供试品溶液。

2.芪蛭胶囊组方药材供试品溶液的制备：

按照芪蛭胶囊处方组成称取原料药材，按照芪蛭胶囊制法及对照指纹图谱检测的供试品溶液制备方法，制备各原料药材的供试品溶液。

3.芪蛭胶囊UPLC-UV指纹图谱与组方药材指纹图谱的比较：

分别取芪蛭胶囊供试品溶液和各药材供试品溶液，按照芪蛭胶囊对照指纹图谱检测条件采集指纹图谱(见图4，其中，A：芪蛭胶囊，B：何首乌，C：莪术，D：水蛭，E：桃仁，F：黄芪，G：山楂，H：土鳖虫，I：三棱，J：决明子)，比较各特征峰保留时间和紫外光谱图，确定特征峰的药材来源，结果见表2。表明芪蛭胶囊UPLC-UV指纹图谱特征峰涵盖了制成该制剂的所有原料药材，能够用于控制该制剂的整体质量。

表2芪蛭胶囊指纹图谱特征峰来源药材归属

实施例5：

芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱特征峰的认定：

为对芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱主要特征峰进行鉴定，并说明特征峰涵盖了不同极性的化学成分，利用对照品对特征峰进行了认定，结果认定了7个主要特征峰，包括大极性的次黄嘌呤、尿囊素，中极性的苦杏仁苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷，小极性的橙黄决明素，非极性的吉马酮，说明该对照指纹图能够表征芪蛭胶囊各极性的小分子化学成分。

1.对照品溶液的制备

分别精密称取2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、次黄嘌呤、尿囊素、苦杏仁苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙黄决明素、吉马酮对照品适量，加甲醇制成每1mL分别含100μg、40μg、20μg、100μg、20μg、20μg、20μg的混合对照品溶液。

2.芪蛭胶囊样品供试品溶液的制备

取芪蛭胶囊样品内容物细粉2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇20ml，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.芪蛭胶囊UPLC-UV指纹图谱与对照品溶液图谱的比较

分别取供试品溶液和混合对照品溶液，按照芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱检测条件采集色谱图，见图5，其中，2：次黄嘌呤，5：尿囊素，15：苦杏仁苷，19：毛蕊异黄酮葡萄糖苷，22：2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷，31：橙黄决明素，30：吉马酮。根据色谱峰的保留时间和紫外光谱图信息，对指纹图谱共有峰进行化学成分的归属，结果表明，芪蛭胶囊UPLC-UV指纹图谱共有峰中，峰2为次黄嘌呤，峰5为尿囊素，峰15为苦杏仁苷，峰17为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，峰18为2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷，峰22为橙黄决明素，峰31为吉马酮。

实施例6：

芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱检测方法的优化与方法学考察：

为说明芪蛭胶囊UPLC-UV指纹图谱检测方法的可行性，对其检测方法进行了优化，并进行了方法学考察。

1.检测方法优化

1.1.检测波长的选择

由于芪蛭胶囊组成复杂，各成分紫外吸收情况差异较大。采用PDA检测器先对样品在200～400nm波长范围内进行扫描。扫描结果发现，在210nm～300nm，色谱峰信息比较丰富；其中，在260nm波长下，0～5分钟时间段的色谱峰信息较多；在210nm波长下，5～24min时间段色谱峰信息较多，特别是在5～9min时间段苦杏仁苷峰能得到良好检测，对于桃仁的质量控制尤为重要；在210nm波长下，20～24min时间段色谱峰信息也较多，主要是来自水蛭的特征峰，对于水蛭的质量控制尤为重要。为尽可能最大地获取复方中不同中药的色谱组分信息，避免峰面积信息的丢失，确定采用210nm和260nm分段切换波长的方法，即0～5min在260nm波长下检测，5～24min在210nm波长下检测。

1.2.色谱柱的选择

取芪蛭胶囊供试品溶液，考察Waters UPLC BEH C18柱(2.1×100mm，1.7μm)、Waters UPLC HSS T3柱(2.1×100mm，1.8μm)、Waters UPLC COTEX T3柱(2.1×100mm，1.8μm)的分离效果，分别测定初步优化后的指纹图谱。结果表明，HSS T3色谱柱对水溶性成分具有更好的保留，0～5min洗脱出来的峰分离度相对较好，其他峰分离度差异不大，均能满足指纹图谱测定要求，因此，选择Waters UPLC HSS T3柱。

1.3.提取溶剂的选择

将用不同提取溶剂制备的供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，测得色谱图。比较色谱图发现，25％甲醇和50％甲醇对于保留时间20～24min的脂溶性成分峰不能获得良好提取，75％甲醇和100％甲醇对其能获得良好提取；100％甲醇对于保留时间0～5min的水溶性成分峰提取不充分，而75％甲醇对于水溶性成分和脂溶性成分均能获得良好提取，故选择75％甲醇作为提取溶剂。

1.4.提取时间的选择

将用不同的提取时间制备的供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录35个主要色谱峰的单位浓度峰面积进行比较。比较结果表明，超声提取30min明显优于15min，与45min和60min无显著差异，超声提取30min即可获得各峰良好的提取，因此选择超声提取30分钟。

1.5.取样量的选择

将不同取样量制备的供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进行测定。记录35个主要色谱峰的单位浓度峰面积。比较结果表明，取样量为0.5g、1.0g、2.0g时，样品提取比较完全，而取样量为0.5g和1.0g时，绝对峰面积比较小，取样量为2.0g时可获得充分提取并具有更高的峰面积，因此，确定取样量为2.0g。

2.分析方法学考察

2.1.精密度考察

取芪蛭胶囊样品(批号191202)，称取内容物2.0g，精密称定，制备供试品溶液，按指纹图谱检测条件连续进样5针，采集指纹图谱，以2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果测得各共有色谱峰的相对保留时间RSD＜1.0％，共有峰的相对峰面积除11号峰以外，RSD＜10.0％，表明，该方法精密度良好。

2.2.重复性考察

取同一批芪蛭胶囊样品(批号191202)，称取内容物2.0g，精密称定，共6份，平行制备供试品溶液，按指纹图谱检测条件进行测定，采集指纹图谱。以2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果测得各共有色谱峰的相对保留时间RSD＜0.1％，共有峰的相对峰面积除12号和13号峰以外，RSD＜2.0％，表明方法的重复性良好。

2.3.稳定性考察

取同一批供试品溶液(批号191202)，按指纹图谱检测条件分别于0、2、4、6、8、10、12小时注入液相色谱仪，采集指纹图谱。以2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果测得各共有色谱峰的相对保留时间RSD＜0.1％，共有峰的相对峰面积RSD＜3.6％，表明供试品溶液在12h内稳定。

实施例7：

一种芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱，由35个特征峰组成，以18号峰为参照峰，计算各特征峰与参照峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.11(峰1)、0.13(峰2)、0.14(峰3)、0.18(峰4)、0.19(峰5)、0.21(峰6)、0.27(峰7)、0.29(峰8)、0.42(峰9)、0.59(峰10)、0.61(峰11)、0.66(峰12)、0.72(峰13)、0.74(峰14)、0.75(峰15)、0.87(峰16)、0.98(峰17)、1.00(峰18)、1.13(峰19)、1.17(峰20)、1.21(峰21)、1.43(峰22)、1.44(峰23)、1.58(峰24)、1.68(峰25)、1.74(峰26)、1.76(峰27)、1.77(峰28)、1.79(峰29)、1.85(峰30)、1.93(峰31)、2.06(峰32)、2.07(峰33)、2.12(峰34)、2.14(峰35)。

将18号峰之外的34个特征峰进行统一积分后，将所得图谱以AIA格式导入国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行相似度计算，样品指纹图谱与对照指纹图谱比较的相似度不得低于0.90。

芪蛭胶囊由以下重量份数的原料药制成：黄芪100～400份、水蛭40～160份、桃仁75～300份、何首乌75～300份、莪术55～220份、三棱55～220份、决明子62.5～250份、山楂62.5～250份和土鳖虫15～60份。

实施例8：

一种芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

取芪蛭胶囊内容物细粉0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入适75％浓度的甲醇10mL，称定重量，超声提取10分钟，放冷，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

芪蛭胶囊样品的供试品溶液利用超高效液相色谱法进行成分的分离，色谱条件为：Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1×100mm，1.8μm)，流动相乙腈-0.05％磷酸水溶液，线性梯度洗脱，流速0.2mL/min，柱温20℃，进样量0.5μL；

流动相线性洗脱梯度为：0～3min，乙腈1→4％；3～4min，乙腈4→8％；4～7min，乙腈8→11％；7～18min，乙腈11→64％；18～22min，乙腈64→100％；22～24min，乙腈100％；

采用紫外光谱双波长切换扫描方式进行检测，检测波长为：0～5min检测波长为260nm，5～24min检测波长为210nm；

取10批芪蛭胶囊样品，分别制备供试品溶液，采集指纹图谱，导入国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，生成对照指纹图谱。

实施例9：

一种芪蛭胶囊UPLC-UV对照指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

取芪蛭胶囊内容物细粉5.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％浓度的甲醇100mL，称定重量，超声提取100分钟，放冷，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

芪蛭胶囊样品的供试品溶液利用超高效液相色谱法进行成分的分离，色谱条件为：Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1×100mm，1.8μm)，流动相乙腈-0.3％磷酸水溶液，线性梯度洗脱，流速0.5mL/min，柱温40℃，进样量5μL；

流动相线性洗脱梯度为：0～3min，乙腈1→4％；3～4min，乙腈4→8％；4～7min，乙腈8→11％；7～18min，乙腈11→64％；18～22min，乙腈64→100％；22～24min，乙腈100％；

采用紫外光谱双波长切换扫描方式进行检测，检测波长为：0～5min检测波长为260nm，5～24min检测波长为210nm；

取15批芪蛭胶囊样品，分别制备供试品溶液，采集指纹图谱，导入国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，生成对照指纹图谱。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。