一种反刍动物瘤胃微生物研究的样品处理方法

摘要

本发明涉及一种反刍动物瘤胃微生物研究的样品处理方法，包括样品的选择和样品的处理方法及流程，所述样品的选择模式一共分为四个模式，且四个模式分别为固液混合样、固液同时选择、只选固相样品和只选液相样品，所述样品的处理方法及流程分为采样时间的选择、样品的采集和样品的处理三个大步骤，且样品的处理又包括液相样品的处理和固相样品的处理。本发明的有益效果是：该反刍动物瘤胃微生物研究的样品处理方法，采用固液分离的方法进行瘤胃微生物的研究，能有效避免选择瘤胃液进行研究产生的偏差，同时更全面地筛选出目标物种，而且能在很大程度上改善利用宏基因组技术进行研究时所产生的杂基因组污染的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及反刍动物瘤胃微生物研究技术领域，具体为一种反刍动物瘤胃微生物研究的样品处理方法。

背景技术

反刍动物区别于其他动物最显著的特征就是拥有独特的瘤胃，瘤胃是一个复杂且处于动态的生态系统，主要由厌氧细菌、厌氧真菌、原生动物、产甲烷古菌和噬菌体等微生物组成，微生物之间进行密切的相互作用，并通过向寄生宿主提供微生物蛋白质(microbial protein，MCP)、挥发性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)和维生素等营养物质而与宿主共生。健康的瘤胃是保证反刍动物健康、福利和维持高生产性能的基础。

目前的这种主流的瘤胃微生物研究模式存在一定的缺陷。主要表现在以下几个方面：1.选择瘤胃液进行研究，可能会导致结果的偏差。因为基于微生物培养和高通量测序的一些研究表明，瘤胃固体附着和液体漂浮的微生物可能存在差异。因此用瘤胃液进行研究可能是不全面的。2选择瘤胃食糜虽然避免了上述的问题，但目前的测序技术可能会覆盖掉一些丰度不高但有重要作用的物种。例如，密螺旋体属的细菌在固体附着样本中能够轻易检测到，并且证明对纤维降解有重要的作用。但是如果采用原始食糜可能就被覆盖掉了。3.无论是瘤胃液还是瘤胃食糜样品，在进行宏基因组测序技术进行研究时，会被来自于饲料植物的基因组污染(宿主本身的污染比较单一，可以剔除掉，但是饲料组成比较复杂，完全剔除几乎是不可能的)。

所以需要针对上述问题设计一种反刍动物瘤胃微生物研究的样品处理方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种反刍动物瘤胃微生物研究的样品处理方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种反刍动物瘤胃微生物研究的样品处理方法，包括样品的选择和样品的处理方法及流程，所述样品的选择模式一共分为四个模式，且四个模式分别为固液混合样、固液同时选择、只选固相样品和只选液相样品，所述样品的处理方法及流程分为采样时间的选择、样品的采集和样品的处理三个大步骤，且样品的处理又包括液相样品的处理和固相样品的处理。

进一步的，所述固液混合样的选择一般在进行常规的瘤胃微生物研究时，可以将处理后的固液相样品混合进行研究，优点是测序成本低，数据也较全面，缺点是可能覆盖掉偏爱定植于固相或液相体系中的低丰度微生物。

进一步的，所述固液同时选择，即同时选择固相和液相样品并分别进行测序研究，虽然成本高，数据量大，但能获得更准确全面的结果，而且能观察到试验处理对固相或液相体系特殊的影响结果。

进一步的，所述只选固相样品在进行诸如纤维素、木质素降解，或者对某一单一饲料原料的特定种群进行研究时，或通过文献资料明确目标物种存在于固相样品中时。

进一步的，所述只选液相样品在进行可溶性营养物质相关的研究，或通过文献明确目标物种存在于液相样品中时。

进一步的，所述采样时间的选择：采样时间对结果的影响该至关重要，有研究表明饲料进入瘤胃后五分钟，瘤胃微生物就开始附着于饲料表面，在采食后24小时之前固液相分离最明显，也是饲料消化的高峰期。随着消化时间的延长，饲料易消化的部分被微生物降解，最终附着于饲料上的微生物主要是一些难降解的纤维素或木质素利用物种。因此根据研究目的，合理选择样品采集时间非常重要。

进一步的，所述样品的采集：在选定好采样时间后，通过瘤胃瘘管、口鼻插管或屠宰等方式收集瘤胃内容物，注意取瘤胃不同部位的样品进行混合。然后在无菌条件下通过四层无菌棉布等方式进行过滤，将所得样品粗分为固液两部分，液氮冷冻然后-80℃保存或直接进行处理。

进一步的，所述样品的处理：将采集回的固液粗分样品进行微生物洗脱处理，若是冷冻样品需要在4°条件下解冻后处理，处理中生理盐水可用PBS代替。

进一步的，所述液相样品的处理：将过滤后的瘤胃液在室温下350g离心15min。取上清液，弃沉淀，以去除悬浮于滤液当中的植物饲料颗粒及其他杂质，然后将上清液在室温下10000g离心20min取沉淀，用少量灭菌生理盐水悬浮沉淀，作为瘤胃液相微生物，-80℃保存，直接进行接下来的DNA提取环节。

进一步的，所述固相样品处理：将粗分得到的固体样品用灭菌生理盐水轻轻冲洗几遍，以去除液相微生物的残留，缓慢挤掉多余水分，将50克的固体样本转移到离心管中，并加入150毫升灭菌生理盐水，以重悬植物颗粒，混合物震荡混匀30s，然后在室温下350g离心15min，沉淀植物颗粒，将上清液小心取出并转移到新管S中置于4℃或冰上，将回收的沉淀物重新悬浮在25ml含0.15％(v/v)吐温-80的灭菌生理盐水中，震荡混匀30s，并将该混合物置于冰上2.5h以洗脱紧密附着的细菌，将洗脱完的混合物体系震荡混匀30s，在室温下350g离心15min除去植物颗粒后，滤液与S瓶中的上清液混合并在4℃下10000g离心20min，沉淀部分即回收的固相微生物细胞，将沉淀重新悬浮在最小体积的灭菌生理盐水中，即为瘤胃固相微生物，并在-80℃下储存分析。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本方法采用固液分离的方法进行瘤胃微生物的研究，能有效避免选择瘤胃液进行研究产生的偏差，同时更全面地筛选出目标物种，而且能在很大程度上改善利用宏基因组技术进行研究时所产生的的杂基因组污染的问题。

具体实施方式

本发明提供一种技术方案：一种反刍动物瘤胃微生物研究的样品处理方法，包括样品的选择和样品的处理方法及流程，所述样品的选择模式一共分为四个模式，且四个模式分别为固液混合样、固液同时选择、固相样品和液相样品，所述样品的处理方法及流程分为采样时间的选择、样品的采集和样品的处理三个步骤，且样品的处理又包括液相样品的处理和固相样品的处理。

一、样品选择模式

在进行瘤胃微生物研究时，为了获得全面和准确的结果，固相和液相样品同时选择是最好的。但这往往导致数据量大和成本过高，因此应该根据研究目的进行选择，一般有四个选择模式。

固液混合样：一般在进行常规的瘤胃微生物研究时，可以将处理后的固液相样品混合进行研究。

固液同时选择：即同时选择固相和液相样品并分别进行测序研究，虽然成本高，数据量大，但能获得更准确全面的结果。

只选固相样品：在进行诸如纤维素、木质素降解，或者对某一单一饲料原料的特定种群进行研究时，或通过文献资料明确目标物种存在于固相样品中时。

只选液相样品：进行可溶性营养物质相关的研究，或通过文献明确目标物种存在于液相样品中时。

二、样品的处理方法及流程

1、采样时间的选择

采样时间对结果的影响该至关重要，有研究表明饲料进入瘤胃后五分钟，瘤胃微生物就开始附着于饲料表面，在采食后24小时之前(推荐8-12小时)固液相分离最明显，也是饲料消化的高峰期。随着消化时间的延长，饲料易消化的部分被微生物降解，最终附着于饲料上的微生物主要是一些难降解的纤维素或木质素利用物种。因此根据研究目的，合理选择样品采集时间非常重要。

2、样品的采集

在选定好采样时间后，通过瘤胃瘘管、口鼻插管或屠宰等方式收集瘤胃内容物，注意取瘤胃不同部位的样品进行混合。然后在无菌条件下通过四层无菌棉布(纱布)等方式进行过滤，将所得样品粗分为固液两部分，液氮冷冻然后-80℃保存或直接进行处理。

3、样品的处理

将采集回的固液粗分样品进行微生物洗脱处理，若是冷冻样品需要在4°条件下解冻后处理。处理中无菌生理盐水可用无菌PBS代替。

液相样品的处理：将过滤后的瘤胃液在室温下350g离心15min。取上清液，弃沉淀，以去除悬浮于滤液当中的植物饲料颗粒及其他杂质。然后将上清液在室温下10000g离心20min取沉淀。用少量灭菌生理盐水悬浮沉淀，作为瘤胃液相微生物，-80℃保存。直接进行接下来的DNA提取环节。(整个操作过程注意避免污染)

固相样品处理：将粗分得到的固体样品用灭菌生理盐水轻轻冲洗几遍，以去除液相微生物的残留，缓慢挤掉多余水分。将50克(据实际重量)的固体样本转移到离心管中，并加入150毫升(据实际重量而定)灭菌生理盐水，以重悬植物颗粒。混合物震荡混匀30s，然后在室温下350g离心15min，沉淀植物颗粒。将上清液小心取出并转移到新管中(标记为S)置于4℃或冰上。将回收的沉淀物重新悬浮在25ml(据实际重量而定)含0.15％(v/v)吐温-80的灭菌生理盐水中，震荡混匀30s，并将该混合物置于冰上2.5h以洗脱紧密附着的细菌。将洗脱完的混合物体系震荡混匀30s，在室温下350g离心15min除去植物颗粒后，滤液与S瓶中的上清液混合并在4℃下10000g离心20min，沉淀部分即回收的固相微生物细胞，将沉淀重新悬浮在最小体积的灭菌生理盐水中，即为瘤胃固相微生物，并在-80℃下储存分析；

具体操作如下，采用固液分离的方法进行瘤胃微生物的研究，能有效避免选择瘤胃液进行研究产生的偏差，同时更全面地筛选出目标物种，而且能在很大程度上改善利用宏基因组技术进行研究时所产生的的杂基因组污染的问题。