用于敲除cFOS宿主基因的质粒、人肺癌细胞系H1299及其制备方法和用途

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于敲除cFOS宿主基因的质粒，所述质粒为连接有sgRNA的载体，所述sgRNA包括添加有Bbsl酶切位点的sgRNA‑F和sgRNA‑R；sgRNA‑F如核苷酸序列SEQ ID NO：1所示；sgRNA‑R如核苷酸序列SEQ ID NO：2所示。此外还公开了敲除了cFOS宿主基因的人肺癌细胞系H1299及其制备方法和用途。本发明通过上述方案得到的H1299细胞系对于cFOS宿主基因的把控更为稳定，能够更确切的为cFOS基因及其调控基因的全功能研究。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于敲除cFOS宿主基因的质粒、人肺癌细胞系H1299及其制备方法和用途。

背景技术

cFOS宿主基因是一种即刻早期基因(Immediate early gene,IEGs)。当细胞在面对各种外部的刺激时，例如血清、激素、生长因子、细胞因子、紫外线辐射、压力等刺激时，这种即刻早期因子会迅速上调，从而对刺激作出应激反应。cFOS基因大小约为1140bp，编码约62kDa大小的蛋白，是细胞内重要的核磷酸蛋白，该蛋白含有DNA结构域和亮氨酸拉链结构域。cFOS是一种非独立活性基因，但是其可以通过亮氨酸拉链序列和另一种即刻早期基因JUN相互作用，从而产生活性。cFOS基因在细胞反应中起着关键的作用，包括细胞的增殖、分化和生存，是真核细胞内重要的转录因子，参与生物信息传递和细胞的新陈代谢等多种生理过程。当病原微生物入侵细胞时，cFOS基因能够迅速被大量诱导表达，并参与细胞的各种信号通路包括细胞的天然免疫反应、细胞凋亡通路以及炎症反应等来对抗病原微生物的侵袭。

目前大量有关病原微生物对cFOS基因及其上下游调控因子的研究多采用瞬时过表达和小干扰RNA(Small interference RNA,siRNA)介导的暂时性抑制来进行。这些方法虽具有较大的灵活性但缺乏稳定性，及效果严重受细胞的转染效率影响，限制了对cFOS基因及其调控基因的全功能研究，如寻找与cFOS基因调控机理相关的病原分子以及cFOS基因上下游因子。

本案所要解决的技术问题是：如何寻找一种更为稳定的cFOS基因表达对象用于cFOS基因及其调控基因的全功能研究、病原微生物复制、调控、致病机制研究以及抗病药物筛选。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于敲除cFOS宿主基因的质粒，以及敲除了cFOS宿主基因的人肺癌细胞系H1299及其制备方法和用途。

本发明通过上述方案得到的H1299细胞系对于cFOS宿主基因的把控更为稳定，能够更确切的为cFOS基因及其调控基因的全功能研究。

本发明的技术方案为：

一种用于敲除cFOS宿主基因的质粒，所述质粒为连接有sgRNA的载体，所述sgRNA包括添加有Bbsl酶切位点的sgRNA-F和sgRNA-R；

sgRNA-F如核苷酸序列SEQ ID NO：1所示；

sgRNA-R如核苷酸序列SEQ ID NO：2所示。

在上述的用于敲除cFOS宿主基因的质粒中，所述载体为PX459。任何可用载体均可以实现本发明的技术方案，但是优选地，所述载体为PX459载体。

同时，本发明还公开了一种敲除了cFOS宿主基因的人肺癌细胞系H1299，其含有突变型cFOS基因；突变型cFOS基因序列如核苷酸序列SEQ ID NO：4所示。

本发明的构建方法适用于任何人源细胞或其它物种，只要它们的cFOS基因序例含有与本专利应用的sgRNA靶位相同的序列都能通此专利应用的方法制备敲除cFOS基因的细胞系。

本发明优选为H1299，起源于在于H1299对于cFOS相比于其他人源细胞来说，表达量更大，其敲除目标基因后更利于研究，稳定性更好。

在上述的敲除了cFOS宿主基因的人肺癌细胞系H1299中，突变型cFOS基因所表达的突变型cFOS的氨基酸序列如氨基酸序列SEQ ID NO：3所示。

此外，本发明还公开了一种敲除了cFOS宿主基因的人肺癌细胞系H1299的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：制备如权利要求1所述的用于敲除cFOS宿主基因的质粒；

步骤2：将质粒转染进入人肺癌细胞系H1299；需要说明的是：任何转染方式均可实现本发明的技术方案，优选地，所述转染为阳离子脂质体介导的转染。

步骤3：筛选敲除了cFOS宿主基因的人肺癌细胞系H1299；所述敲除了cFOS宿主基因的人肺癌细胞系H1299含有突变型cFOS基因；突变型cFOS基因序列如核苷酸序列SEQ IDNO：4所示。

在上述的敲除了cFOS宿主基因的人肺癌细胞系H1299的制备方法中，所述步骤1具体为：

将添加有Bbsl酶切位点的sgRNA-F、sgRNA-R磷酸化修饰和退火，将PX459载体通过Bbsl内切酶进行酶切，接着将制备好的sgRNA与线性化的PX459连接，最后将连接产物直接转化到DH5a感受态细菌，获得用于敲除cFOS宿主基因的质粒；

所述sgRNA-F、sgRNA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

在上述的敲除了cFOS宿主基因的人肺癌细胞系H1299的制备方法中，所述步骤2具体为：将H1299细胞培养于细胞培养皿，根据公司说明书将用于敲除cFOS宿主基因的质粒与转染试剂混合，静置，接着将质粒和转染试剂的混合液逐滴加入到人肺癌细胞H1299进行转染；待转染细胞培养36小时后，在培养皿内加入嘌呤霉素使其终浓度为5μg/ml，并坚持每3天用含嘌呤霉素的10％FBS的DMEM细胞培养液更换一次；10天后改为用不含嘌呤霉素的10％FBS的DMEM细胞培养液每5天更换一次，直到有明显的细胞群落出现。

最后，上述的敲除了cFOS宿主基因的人肺癌细胞系H1299用于cFOS基因及其调控基因的全功能研究、病原微生物复制、调控、致病机制研究以及抗病药物筛选。

本发明的有益效果如下：

本发明提供了用于特异性靶向cFOS基因的sgRNA、构建了用于CRISPR/Cas9敲除cFOS基因的质粒以及敲除cFOS宿主基因的人肺癌细胞系(H1299)的构建方法。以往探究宿主基因与病原微生物的相互作用时，更多的是采用瞬时转染或者是siRNA的暂时抑制方法来探究，本专利中成功构建得到的敲除cFOS宿主基因的人肺癌细胞系(H1299)对于cFOS宿主基因的把控更为稳定，能够更确切的为cFOS基因及其调控基因的全功能研究，如寻找与cFOS基因调控机理相关的病原分子以及cFOS基因上下游因子；病原微生物，如病毒，复制、调控、致病机制的研究；抗病药物筛选等提供了不可多得的研究工具。

附图说明

图1构建用于敲除cFOS基因的sgRNA质粒pX459-sgcFOS的质粒图谱；

图2H1299野生型和敲除cFOS基因的H1299细胞生长活性测定图；

图3H1299野生型和敲除cFOS基因的H1299细胞感染IBV病毒后，cFOS蛋白表达水平图；

图4H1299野生型和敲除cFOS基因的H1299细胞感染IBV病毒后的病毒滴度水平图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1构建用于敲除cFOS基因的sgRNA质粒pX459-sgcFOS

1)设计两条特异性靶标cFOS基因的sgRNA，如下所示：

sgRNA-F：gttgtgaagaccatgacagg(SEQ ID NO：1)；

sgRNA-R：cctgtcatggtcttcacaac(SEQ ID NO：2)。

2)在sgRNA两端加上Bbsl酶切位点(斜体)

sgRNA-F：CACCGGTTGTGAAGACCATGACAGG

sgRNA-R：AAACCCTGTCATGGTCTTCACAACC

将上述引物送生物工程公司合成。

3)将引物磷酸化修饰和退火，具体操作如下：

首先用蒸馏水重悬两条sgRNA到终浓度100μM，按表1方法加磷酸基团和退火。

表1加磷酸基团反应体系和退火反应条件

4)将PX459载体通过Bbsl酶切，首先取1μg PX459质粒，37℃下用Bbsl酶切30min，配制的酶切反应体系如下表2所示：

表2酶切反应体系

将反应后的酶切体系在琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并用胶回收试剂盒回收线性化后的片段。

5)将按上述方法制备好的sgRNA与线性化的PX459载体进行连接，室温连接半小时。连接反应体系如下表3所示：

表3连接反应体系

上表中线性化PX459为50ng，体积Xμl是指满足50ng条件，体积根据总量50ng可调整；水为Xμl是指最后加水至体系为10μl即可。

6)通过氯化钙化学转化的方法，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，取适量转化产物于含100μg/ml的氨苄西林LB固体培养基中进行涂布培养。

7)37℃培养过夜，挑取单克隆细菌进行扩增培养并提取DNA提质粒，命名为PX459-sgcFOS并送生物公司进行测序验证。

实施例2筛选cFOS基因敲除的H1299细胞系

1)将H1299细胞培养于30mm细胞培养皿，根据公司说明书将PX459-sgcFOS质粒与转染试剂(Transfection EL Transfection Reagent，FT201-2，全式金)混合，静置20分钟，接着将质粒转染试剂混合液逐滴加入到前一天铺好的人肺癌细胞H1299(American TypeCulture Collection,ATCC)进行转染。

2)待转染细胞培养36小时后，在培养皿内加入嘌呤霉素使其终浓度为5μg/ml，并坚持每3天用含嘌呤霉素(5μg/ml)的10％FBS的DMEM细胞培养液更换一次(如果细胞密度太大需将细胞稀释培养以利于筛选单个细胞系)。10天后改为用不含嘌呤霉素的10％FBS的DMEM细胞培养液每5天更换一次，直到有明显的细胞群落出现(约需2-3周)。在本专利中我们挑选了3个细胞群落进行单群落细胞培养，并将这些细胞株命名为H1299-dcFOS-1，H1299-dcFOS-2，H1299-dcFOS-3。

3)鉴定H1299-dcFOS细胞株的cFOS基因突变情况

首先将上述3个细胞株分别单独提取细胞全基因组DNA，并用Premix Taq(北京全式金生物技术有限公司)和引物F:ACCAGGATCCATGATGTTCTCGGGCTTCAAC；R:ATTACTCGAGCCCAGGGCCAGCAGCGTGGGT进行PCR扩增，获得PCR产物A、B、C。将PCR产物A、B、C进行纯化，接着将纯化后的A、B、C产物分别与载体pMD19-T(TAKARA公司)进行TA克隆体系配制，然后将配制好的反应体系16℃反应30min，反应体系如下表4所示，接着将三个反应好的TA克隆连接体系分别加入到DH5α感受态细胞中进行氯化钙化学转化，取适量转化产物于含100μg/ml的氨苄西林LB固体培养基中进行涂布培养。

表4 TA克隆连接体系

4)从三个进行了TA克隆反应转化的平板中挑取单克隆菌落进行扩增培养并进行质粒提取，接着将这三个质粒送生物公司分别用M13-F：GTAAAACGACGGCCAGT或者M13-R；GTCATAGCTGTTTCCTG引物检测这3个质粒的核苷酸序列。结果显示3个PCR产物中有1个出现碱基插入突变。经测序显示，与野生型cFOS基因(SEQ ID NO：5)相比，突变型cFOS基因(SEQID NO：4)的第348(C)核苷酸是新插入的碱基，该碱基的插入造成了氨基酸移码突变，突变造成第116个氨基酸(T)以后移码并在第148个氨基酸的位置提前终止，突变型cFOS的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

SEQ ID NO：3：

MMFSGFNADYEASSSRCSSASPAGDSLSYYHSPADSFSSMGSPVNAQDFCTDLAVSSANFIPTVTAISTSPDLQWLVQPALVSSVAPSQTRAPHPFGVPAPSAGAYSRAGVVKTMTRRPSAEHWQEGQGGTVISRRRREKENPKGKE

斜体字部分为异常cFOS序列，其余为正常cFOS序列。

实施例3鉴定cFOS突变细胞株(H1299-dcFOS)的生物学功能

1.用CCK法测定细胞生长特性

将野生型的H1299细胞和进行敲除cFOS基因的3株突变H1299细胞株进行胰酶消化成单个细胞，再用细胞培养液重悬接种于96孔板中，100μl/每孔，每个时间点设置3孔，置37℃，5％CO2培养。在细胞培养16小时后取出细胞，每孔加入10μl CCK-8并轻轻混匀，避免产生气泡，再置回培养箱孵育4小时后用酶标仪测定450nm的吸收值。计算3孔的平均值和标准误，作图。结果(图1)显示野生型H1299细胞和进行敲除cFOS基因的3株突变H1299细胞株的细胞生长活性无明显差异。因而，H1299细胞宿主基因cFOS的敲除并不会影响细胞的生长活性。

2.蛋白免疫印迹法检测H1299细胞cFOS基因的敲除情况

通过cFOS蛋白免疫印迹法法(Western Blot)检验蛋白的表达情况，具体步骤：将野生型H1299细胞和进行敲除cFOS基因的突变H1299细胞株取适量比例培养于12孔的细胞培养皿中，每株细胞铺5个孔，隔天细胞长满时，在每株细胞的每个孔中加入适量的IBV病毒液感染细胞，接着在接毒0h，12h，16h，20h和22h这几个时间点用蛋白裂解液分别收取接了毒的细胞蛋白样品。将蛋白样品于95℃的金属浴中煮10分钟，每个蛋白取等量在SDS-PAGE胶中进行蛋白电泳实验，再通过膜转移实验将蛋白转移到NC膜上，接着对NC膜用5％的脱脂奶进行封闭实验，最后用人源的cFOS蛋白抗体孵育出目的蛋白，如图2所示。结果显示敲除cFOS基因的突变H1299细胞株相比于野生型的H1299细胞，cFOS基因明显被敲除，与测序结果相一致。

3.蛋白免疫印迹法检测敲除cFOS基因对IBV复制的影响

通过IBVS和IBVN结构蛋白免疫印迹法法(Western Blot)检验蛋白的表达情况，具体步骤：将上述2中收取的蛋白样品取出，在95℃的金属浴中煮10分钟，每个蛋白取等量在SDS-PAGE胶中进行蛋白电泳实验，再通过膜转移实验将蛋白转移到NC膜上，接着对NC膜用5％的脱脂奶进行封闭实验，最后用IBVS和IBVN结构蛋白抗体孵育出目的蛋白，如图2所示。结果显示敲除cFOS基因的突变H1299细胞株相比于野生型的H1299细胞，IBV的S和N结构蛋白的表达量减少，说明cFOS基因的敲除能够抑制IBV在细胞中的复制。

4.半数组织感染剂量法(TCID50)检测敲除cFOS基因对IBV复制的影响

通过半数组织感染剂量法(TCID

5.蛋白免疫印迹法检测敲除cFOS基因对细胞凋亡的影响

通过凋亡标志蛋白PARP蛋白免疫印迹法法(Western Blot)检验蛋白的表达情况，具体步骤：将上述2中收取的蛋白样品取出，在95℃的金属浴中煮10分钟，每个蛋白取等量在SDS-PAGE胶中进行蛋白电泳实验，再通过膜转移实验将蛋白转移到NC膜上，接着对NC膜用5％的脱脂奶进行封闭实验，最后用凋亡标志蛋白PARP抗体孵育出目的蛋白，如图2所示。结果显示敲除cFOS基因的突变H1299细胞株相比于野生型的H1299细胞，PARP蛋白在感染病毒16h时出现了切割条带，说明感染IBV之后cFOS基因的敲除能够促进细胞的凋亡。

对比例1-4

本对比例1-4与实施例1大体相同，唯一不同之处在于sgRNA的选择；对比例1-4的sgRNA的引物序列如下：

对比例1：

FOS-gRNA2-TOP:caccgggggcaaggtggaacaggtg

FOS-gRNA2-BTM:aaaccacctgttccaccttgccccc；

对比例2：

FOS-gRNA3-TOP:caccgagccttacctgcgcgttgac

FOS-gRNA3-BTM:aaacgtcaacgcgcaggtaaggctc；

对比例3：

FOS-gRNA4-TOP:caccggcccgccctcgtctcctccg

FOS-gRNA4-BTM:aaaccggaggagacgagggcgggcc；

对比例4

FOS-gRNA5-TOP:caccgcagccactgcaggtccggac

FOS-gRNA5-BTM:aaacgcccgccctcgtctcctccgc。

上述sgRNA制备得到的质粒采用实施例2的方法转染进入H1299细胞系后，按照实施例3的方法进行相关的测试。

经过蛋白免疫印迹法、半数组织感染剂量法进行如上的测试可以发现：

1.对比例1-4的相关质粒转染H1299后，H1299在感染IBV病毒后IBV病毒的复制与野生型的H1299细胞相比未明显受抑制、病毒滴度与野生型的H1299细胞相似；

2.对比例1-4的相关质粒转染H1299后，H1299在感染IBV病毒后，细胞凋亡速度和野生型的H1299细胞相似。

通过上述实验可以得知：

本案的sgRNA的选择选择尤为重要，其对于cFOS基因的有效敲除具有非常重要的影响。

综上所述，本案的有益效果如下：

1.本发明提供了用于特异性靶向cFOS基因的sgRNA、构建了用于CRISPR/Cas9敲除cFOS基因的质粒以及敲除cFOS宿主基因的人肺癌细胞系(H1299)的构建方法。以往探究宿主基因与病原微生物的相互作用时，更多的是采用瞬时转染或者是siRNA的暂时抑制方法来探究，本专利中成功构建得到的敲除cFOS宿主基因的人肺癌细胞系(H1299)对于cFOS宿主基因的把控更为稳定，能够更确切的为cFOS基因及其调控基因的全功能研究，如寻找与cFOS基因调控机理相关的病原分子以及cFOS基因上下游因子；病原微生物，如病毒，复制、调控、致病机制的研究；抗病药物筛选等提供了不可多得的研究工具。

2.本案选择H1299细胞系，该细胞系相比其他实验用细胞系来说，对于cFOS的表达量非常大，这对于病原微生物，如病毒，复制、调控、致病机制的研究等方面可以提供更为稳定的研究对象；经过cFOS宿主基因的敲除，其表达完全受到抑制，H1299细胞系采用本发明所述的质粒进行目标基因敲除后，表现为高度稳定性和可靠性。

3.本案质粒对敲除cFOS宿主基因贡献巨大。

序列表

<110> 华南农业大学

华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司

<120> 用于敲除cFOS宿主基因的质粒、人肺癌细胞系H1299及其制备方法和用途

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> sgRNA-F(人工序列)

<400> 1

gttgtgaaga ccatgacagg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> sgRNA-R(人工序列)

<400> 2

cctgtcatgg tcttcacaac 20

<210> 3

<211> 147

<212> PRT

<213> 突变型cFOS(人工序列)

<400> 3

Met Met Phe Ser Gly Phe Asn Ala Asp Tyr Glu Ala Ser Ser Ser Arg

1 5 10 15

Cys Ser Ser Ala Ser Pro Ala Gly Asp Ser Leu Ser Tyr Tyr His Ser

20 25 30

Pro Ala Asp Ser Phe Ser Ser Met Gly Ser Pro Val Asn Ala Gln Asp

35 40 45

Phe Cys Thr Asp Leu Ala Val Ser Ser Ala Asn Phe Ile Pro Thr Val

50 55 60

Thr Ala Ile Ser Thr Ser Pro Asp Leu Gln Trp Leu Val Gln Pro Ala

65 70 75 80

Leu Val Ser Ser Val Ala Pro Ser Gln Thr Arg Ala Pro His Pro Phe

85 90 95

Gly Val Pro Ala Pro Ser Ala Gly Ala Tyr Ser Arg Ala Gly Val Val

100 105 110

Lys Thr Met Thr Arg Arg Pro Ser Ala Glu His Trp Gln Glu Gly Gln

115 120 125

Gly Gly Thr Val Ile Ser Arg Arg Arg Arg Glu Lys Glu Asn Pro Lys

130 135 140

Gly Lys Glu

145

<210> 4

<211> 1144

<212> DNA

<213> 突变型cFOS基因序列(人工序列)

<400> 4

atgatgttct cgggcttcaa cgcagactac gaggcgtcat cctcccgctg cagcagcgcg 60

tccccggccg gggatagcct ctcttactac cactcacccg cagactcctt ctccagcatg 120

ggctcgcctg tcaacgcgca ggacttctgc acggacctgg ccgtctccag tgccaacttc 180

attcccacgg tcactgccat ctcgaccagt ccggacctgc agtggctggt gcagcccgcc 240

ctcgtctcct ccgtggcccc atcgcagacc agagcccctc accctttcgg agtccccgcc 300

ccctccgctg gggcttactc cagggctggc gttgtgaaga ccatgaccag gaggccgagc 360

gcagagcatt ggcaggaggg gcaaggtgga acagttatct ccagaagaag aagagaaaag 420

gagaatccga agggaaagga ataagatggc tgcagccaaa tgccgcaacc ggaggaggga 480

gctgactgat acactccaag cggagacaga ccaactagaa gatgagaagt ctgctttgca 540

gaccgagatt gccaacctgc tgaaggagaa ggaaaaacta gagttcatcc tggcagctca 600

ccgacctgcc tgcaagatcc ctgatgacct gggcttccca gaagagatgt ctgtggcttc 660

ccttgatctg actgggggcc tgccagaggt tgccaccccg gagtctgagg aggccttcac 720

cctgcctctc ctcaatgacc ctgagcccaa gccctcagtg gaacctgtca agagcatcag 780

cagcatggag ctgaagaccg agccctttga tgacttcctg ttcccagcat catccaggcc 840

cagtggctct gagacagccc gctccgtgcc agacatggac ctatctgggt ccttctatgc 900

agcagactgg gagcctctgc acagtggctc cctggggatg gggcccatgg ccacagagct 960

ggagcccctg tgcactccgg tggtcacctg tactcccagc tgcactgctt acacgtcttc 1020

cttcgtcttc acctaccccg aggctgactc cttccccagc tgtgcagctg cccaccgcaa 1080

gggcagcagc agcaatgagc cttcctctga ctcgctcagc tcacccacgc tgctggccct 1140

gtga 1144

<210> 5

<211> 1140

<212> DNA

<213> 野生型cFOS基因序列(人工序列)

<400> 5

atgatgttct cgggcttcaa cgcagactac gaggcgtcat cctcccgctg cagcagcgcg 60

tccccggccg gggatagcct ctcttactac cactcacccg cagactcctt ctccagcatg 120

ggctcgcctg tcaacgcgca ggacttctgc acggacctgg ccgtctccag tgccaacttc 180

attcccacgg tcactgccat ctcgaccagt ccggacctgc agtggctggt gcagcccgcc 240

ctcgtctcct ccgtggcccc atcgcagacc agagcccctc accctttcgg agtccccgcc 300

ccctccgctg gggcttactc cagggctggc gttgtgaaga ccatgacagg aggccgagcg 360

cagagcattg gcaggagggg caaggtggaa cagttatctc cagaagaaga agagaaaagg 420

agaatccgaa gggaaaggaa taagatggct gcagccaaat gccgcaaccg gaggagggag 480

ctgactgata cactccaagc ggagacagac caactagaag atgagaagtc tgctttgcag 540

accgagattg ccaacctgct gaaggagaag gaaaaactag agttcatcct ggcagctcac 600

cgacctgcct gcaagatccc tgatgacctg ggcttcccag aagagatgtc tgtggcttcc 660

cttgatctga ctgggggcct gccagaggtt gccaccccgg agtctgagga ggccttcacc 720

ctgcctctcc tcaatgaccc tgagcccaag ccctcagtgg aacctgtcaa gagcatcagc 780

agcatggagc tgaagaccga gccctttgat gacttcctgt tcccagcatc atccaggccc 840

agtggctctg agacagcccg ctccgtgcca gacatggacc tatctgggtc cttctatgca 900

gcagactggg agcctctgca cagtggctcc ctggggatgg ggcccatggc cacagagctg 960

gagcccctgt gcactccggt ggtcacctgt actcccagct gcactgctta cacgtcttcc 1020

ttcgtcttca cctaccccga ggctgactcc ttccccagct gtgcagctgc ccaccgcaag 1080

ggcagcagca gcaatgagcc ttcctctgac tcgctcagct cacccacgct gctggccctg 1140