一种醋酸曲安奈德组合物喷雾剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种醋酸曲安奈德组合物喷雾剂及其制备方法，属于药物制剂领域。一种醋酸曲安奈德组合物喷雾剂由醋酸曲安奈德、生长抑素修饰物、DSPE‑PEG2000、磷脂、胆固醇、脂质体膜调节剂以及药学上可接受的载体组成；其中，所述喷雾剂包含传递体，所述传递体包含DSPE‑PEG2000、磷脂、胆固醇、脂质体膜调节剂，且粒径范围为40‑100 nm，至少80%的传递体粒径是均一的。本发明将醋酸曲安奈德和生长抑素联合用药，从不同的机制缓解关节疼痛、肿胀，具有协同作用，且起效快，持续治疗作用持久。此外，制备得到的传递体粒径小且均一，透皮效果好。

说明书

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，特别涉及一种醋酸曲安奈德组合物喷雾剂及其制备方法。

背景技术

曲安奈德（triamcinolone acetonide），也叫曲安缩松、去炎舒松等，是一种中效糖皮质激素，作用与曲安西龙、氢化可的松相似，具有抗炎、抗瘙痒和收缩血管等作用，水钠潴留作用微弱，其中抗炎作用较强而持久，效力比可的松大20～30倍。醋酸曲安奈德临床上一般分为注射液和软膏，适用于各种皮肤病、过敏性鼻炎、关节痛、支气管哮喘、肩周炎、腱鞘炎、滑膜炎、急性扭伤、类风湿性关节炎等。

生长抑素（somatostatin，SST），由中枢神经系统产生的一种14个氨基酸的环肽，氨基酸序列为：H-Ala

关节炎（arthritis）泛指发生在人体关节及其周围组织，由炎症、感染、退化、创伤或其他因素引起的炎性疾病，可分为数十种。我国的关节炎患者有1亿以上，且人数在不断增加。临床表现为关节的红、肿、热、痛、功能障碍及关节畸形，严重者导致关节残疾、影响患者生活质量。临床上通常在骨关节内注入10 mg/mL或40 mg/mL的曲安奈德来治疗急性痛风性关节炎或者类风湿性关节炎，曲安奈德封闭针反复多次注射后，会产生以下的并发症：1、肌腱的变性或溶解，多次注射以后会导致肌腱变性，从而容易发生自发性的断裂，并且还可以导致肌腱的萎缩。2、容易导致软骨的变性，比如软骨变薄、磨损和退化增加。3、在皮肤比较薄的部位进行反复的注射，导致皮肤的色素水平降低而出现局部的皮肤发白。4、反复多处或者多次的注射，容易引起局部的抵抗力降低，容易产生细菌性的感染。

曲安奈德和SST治疗关节炎时，均需注射给药，不仅增加了药物的毒副作用，使患者非常痛苦，而且很不方便，多次注射容易产生其他并发症。因此，开发一种安全有效、应用方便的透皮制剂意义重大。

皮肤角质层对大多数分子，尤其是大分子如多肽类药物有天然的屏障作用。传递体（transfersomes，TF），又称变形脂质体，柔性纳米脂质体或柔性脂质体，是一种自聚集泡囊，其主要组成成分为磷脂和表面活性剂（如胆酸钠，去氧胆酸钠等），通过其自身高度的变形性，在非闭合给药的情况下以皮肤自身存在的水和梯度为驱动力，能够高效的通过比其自身小数倍的孔径。水溶性、脂溶性的大分子和小分子以传递体作为载体能够顺利的穿过皮肤，可靶向深层皮肤组织，到达体内循环，发挥药效，现广泛用作大分子药物和水溶性、脂溶性药物透皮吸收的载体。

发明内容为解决上述问题，本发明提供了一种醋酸曲安奈德组合物喷雾剂，所述喷雾剂由醋酸曲安奈德、生长抑素修饰物、DSPE-PEG2000、磷脂、胆固醇、脂质体膜调节剂以及药学上可接受的载体组成；

其中，所述喷雾剂包含传递体，所述传递体包含DSPE-PEG2000、磷脂、胆固醇、脂质体膜调节剂，且粒径范围为40-100 nm，至少80%的传递体粒径是均一的。

具体地，所述药学上可接受的载体是常规的。在本发明的一些实例中，所述药学上可接受的载体包括溶剂和磷酸盐缓冲液等。

具体地，在本发明的一些实例中，所述溶剂为常规短链醇，包括乙醇、丙二醇。

优选地，所述喷雾剂中生长抑素修饰物为DSPE-PEG2000-SST，合成过程如下：在4℃条件下，将SST与DSPE-PEG2000-BTC（摩尔比为1:2）在50 mL DMSO中搅拌，三乙胺调节pH为7.0-7.5，反应结束后，透析24 h，冻干，得到DSPE-PEG2000-SST。将SST进行PEG修饰，可以提高SST在体内的生物活性，延长给药时间，改善传递体的稳定性和增强包封率。

优选地，所述喷雾剂中醋酸曲安奈德用量为5-500 mg/mL、生长抑素修饰物用量为0.2-20 mg/mL、DSPE-PEG2000用量为0.04-0.6 g/mL、磷脂用量为0.03-0.5 g/mL、胆固醇用量为0.005-0.2 g/mL、脂质体膜调节剂用量为0.004-0.15 g/mL。

优选地，所述喷雾剂中磷脂选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂。

优选地，所述喷雾剂中脂质体膜调节剂选自胆酸钠、去氧胆酸钠、Triton-100中的一种或多种。

更为优选地，所述喷雾剂中脂质体膜调节剂为胆酸钠。

优选地，所述喷雾剂中所述传递体粒径范围为40-100 nm，且至少90%的粒径均一。传递体粒径小且均一，有助于降低药物在体内的代谢、提高生物利用度。

本发明还提供了一种曲安奈德组合物喷雾剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）将SST与DSPE-PEG2000采用化学偶联的方法制备得到DSPE-PEG2000-SST；

（2）将步骤（1）得到的DSPE-PEG2000-SST与DSPE-PEG2000、磷脂、胆固醇、脂质体膜调节剂溶解于有机溶剂中，旋转蒸发有机溶剂，形成均匀薄膜A；

（3）将醋酸曲安奈德用水溶解，得到溶液B；

（4）将溶液B加入到薄膜A中，经超声雾化器在1.2-2.3 MHz频率，15-50 ℃温度下超声雾化后，通入正在搅拌的磷酸盐缓冲液中，过滤，除菌，得到所述喷雾剂；

其中，所述步骤（2）中DSPE-PEG2000-SST用量为0.2-20 mg/mL、DSPE-PEG2000用量为0.04-0.6 g/mL、磷脂用量为0.03-0.5 g/mL、胆固醇用量为0.005-0.2 g/mL、脂质体膜调节剂用量为0.004-0.15 g/mL；

所述步骤（3）中醋酸曲安奈德用量为5-500 mg/mL。

优选地，所述制备方法中所述步骤（4）中超声雾化的频率为1.5-1.7MHz，超声雾化的温度为20-40 ℃。超声雾化有助于传递体的粒径均一，超声强度过大时，所制备的传递体被部分破坏，包封率有所下降。超声强度过小时，传递体不能充分分散于缓冲液中，导致粒径有所增加。超声雾化温度过高，包封率下降；超声雾化温度过低，不利于传递体分散于缓冲液中。

SST治疗关节炎的作用机制：Kolasinski认为生长抑素通过直接作用于血管平滑肌及引起肥大细胞释放组胺、提高局部血管通透性的间接作用，使血管扩张，治疗类风湿性关节炎等关节炎性疾病（Kolasinski SL, Haines KA, Siegel EL, et al.Neuropeptides and inflammation: a somatostatin analog as selective antagonistof neutrophil activation by substance P. Arthritis Rheum, 1992,35:369～372）。Matucci认为生长抑素治疗关节炎的作用也可能与抑制P物质的生成以及抑制SP从所涉及的神经末梢(δ纤维和C纤维)释放有关，具有抑制关节滑膜细胞释放前列腺素，抑制巨噬细胞的活化和趋化的功能（Matucci-Cerinic M.Sensory neuropeptides and rheumaticdisease. Rheum Dis Clin N Am, 1993,19:975～976）。生长抑素在关节内作用于不同种类的细胞和组织，其主要作用点为感觉神经末梢，而Fioravant推测生长抑素的另一个作用点是滑膜细胞，抑制滑膜细胞的增殖，以及抑制淋巴细胞的增殖和单核细胞的趋化性(主要是淋巴细胞)（Fioravanti A, Govoni M, La Montagna G, et al. Somatostatin 14 andjoint inflammation: evidence for intraarticularefficacy of prolongedadministration in rhumatoid arthritis. Drugs Exptl Clin Res, 1995,21: 97～103）。曲安奈德治疗关节炎机制：曲安奈德能有效抑制骨关节炎的降解过程，可抑制金属蛋白酶的活动而改善骨关节炎症状。SST和曲安奈德联合用药可以从不同的机制治疗关节炎，具有协同作用。

Marco等人报道了生长抑素治疗后膝关节肿胀有统计学意义且与剂量相关，这种作用比曲安奈德短。但是，连续剂量的曲安奈德引起的抗炎活性在程度和持续时间上都有所下降，而生长抑素的作用在每次连续治疗中保持不变（Marco Matucci‐Cerinic MD,Francesco Borrelli MS, et al. Somatostatin-induced modulation of inflammationof inflammation in experimental arthritis, Arthritis & Rheumatology, Vol.38,No.11, November 1995）。此外，SST作用温和，需间歇多次注射后缓慢累积起效，且价格昂贵。SST和曲安奈德联合用药可以改善SST缓慢累积起效的缺点，解决曲安奈德抗炎活性持续时间下降的问题。SST进行PEG修饰，可以提高SST在体内的生物活性，延长给药时间，解决多肽体内代谢快的问题。

本发明创造性的将曲安奈德和生长抑素联合用药，提供了一种曲安奈德组合物喷雾剂，可以从不同的机制缓解关节疼痛、肿胀，具有协同作用，且起效快，持续治疗作用持久。此外，本发明还提供了曲安奈德组合物喷雾剂的制备方法，制备得到的传递体粒径小且均一，透皮效果好。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。

实施例1

（1）在4℃条件下，将SST与DSPE-PEG2000-BTC（摩尔比为1:2）在50 mLDMSO中搅拌，三乙胺调节pH为7.0-7.5，反应结束后，透析24 h，冻干，得到DSPE-PEG2000-SST；

（2）称取上述重量由步骤（1）制得的DSPE-PEG2000-SST，与上述重量DSPE-PEG2000、蛋黄卵磷脂、胆固醇、去氧胆酸钠溶解于500 mL丙二醇中，旋转蒸发丙二醇，形成均匀薄膜A；

（3）将上述重量醋酸曲安奈德用50mL超纯水溶解，得到溶液B；

（4）将溶液B加入到薄膜A中，经超声雾化器在1.7 MHz频率，25 ℃温度下超声雾化后，通入正在搅拌的磷酸盐缓冲液中，搅拌1h，药液经囊式过滤器粗滤后，经0.20μm微孔滤膜除菌，得到所述喷雾剂。

测定喷雾剂中包封药物载体传递体平均粒径50 nm，球状，均匀度95%，包封率92.5%，低温2-8 ℃保存180天，溶液均匀稳定无分层和变质现象。

实施例2

（1）在4℃条件下，将SST与DSPE-PEG2000-BTC（摩尔比为1:2）在50 mL DMSO中搅拌，三乙胺调节pH为7.0-7.5，反应结束后，透析24 h，冻干，得到DSPE-PEG2000-SST；

（2）称取上述重量由步骤（1）制得的DSPE-PEG2000-SST，与上述重量DSPE-PEG2000、大豆卵磷脂、胆固醇、胆酸钠溶解于500 mL乙醇中，旋转蒸发乙醇，形成均匀薄膜A；

（3）将上述重量醋酸曲安奈德用50 mL超纯水溶解，得到溶液B；

（4）将溶液B加入到薄膜A中，经超声雾化器在2.3 MHz频率，15 ℃温度下超声雾化后，通入正在搅拌的磷酸盐缓冲液中，搅拌1h，药液经囊式过滤器粗滤后，经0.20μm微孔滤膜除菌，得到所述喷雾剂。

测定喷雾剂中包封药物载体传递体平均粒径40 nm，球状，均匀度92%，包封率94.5%，低温2-8 ℃保存180天，溶液均匀稳定无分层和变质现象。

实施例3

（1）在4℃条件下，将SST与DSPE-PEG2000-BTC（摩尔比为1:2）在50 mL DMSO中搅拌，三乙胺调节pH为7.0-7.5，反应结束后，透析24 h，冻干，得到DSPE-PEG2000-SST；

（2）称取上述重量由步骤（1）制得的DSPE-PEG2000-SST，与上述重量DSPE-PEG2000、大豆卵磷脂、胆固醇、Triton-100溶解于500 mL乙醇中，旋转蒸发乙醇，形成均匀薄膜A；

（3）将上述重量醋酸曲安奈德用50 mL超纯水溶解，得到溶液B；

（4）将溶液B加入到薄膜A中，经超声雾化器在1.2 MHz频率，50 ℃温度下超声雾化后，通入正在搅拌的磷酸盐缓冲液中，搅拌1h，药液经囊式过滤器粗滤后，经0.20μm微孔滤膜除菌，得到所述喷雾剂。

测定喷雾剂中包封药物载体传递体平均粒径100 nm，球状，均匀度92%，包封率93.5%，低温2-8 ℃保存180天，溶液均匀稳定无分层和变质现象。

实施例4

（1）在4℃条件下，将SST与DSPE-PEG2000-BTC（摩尔比为1:2）在50 mL DMSO中搅拌，三乙胺调节pH为7.0-7.5，反应结束后，透析24 h，冻干，得到DSPE-PEG2000-SST；

（2）称取上述重量由步骤（1）制得的DSPE-PEG2000-SST，与上述重量DSPE-PEG2000、蛋黄卵磷脂、胆固醇、胆酸钠溶解于500 mL丙二醇中，旋转蒸发丙二醇，形成均匀薄膜A；

（3）将上述重量醋酸曲安奈德用50 mL超纯水溶解，得到溶液B；

（4）将溶液B加入到薄膜A中，经超声雾化器在1.6 MHz频率，20 ℃温度下超声雾化后，通入正在搅拌的磷酸盐缓冲液中，搅拌1h，药液经囊式过滤器粗滤后，经0.20μm微孔滤膜除菌，得到所述喷雾剂。

测定喷雾剂中包封药物载体传递体平均粒径70 nm，球状，均匀度99%，包封率94.5%，低温2-8 ℃保存180天，溶液均匀稳定无分层和变质现象。

实施例5

（1）在4℃条件下，将SST与DSPE-PEG2000-BTC（摩尔比为1:2）在50 mL DMSO中搅拌，三乙胺调节pH为7.0-7.5，反应结束后，透析24 h，冻干，得到DSPE-PEG2000-SST；

（2）称取上述重量由步骤（1）制得的DSPE-PEG2000-SST，与上述重量DSPE-PEG2000、蛋黄卵磷脂、胆固醇、去氧胆酸钠、胆酸钠、溶解于500 mL乙醇中，旋转蒸发乙醇，形成均匀薄膜A；

（3）将上述重量醋酸曲安奈德用50 mL超纯水溶解，得到溶液B；

（4）将溶液B加入到薄膜A中，经超声雾化器在1.5 MHz频率，40 ℃温度下超声雾化后，通入正在搅拌的磷酸盐缓冲液中，搅拌1h，药液经囊式过滤器粗滤后，经0.20μm微孔滤膜除菌，得到所述喷雾剂。

测定喷雾剂中包封药物载体传递体平均粒径80 nm，球状，均匀度99%，包封率94.5%，低温2-8 ℃保存180天，溶液均匀稳定无分层和变质现象。

实施例6体外透皮率试验

采用离体皮肤法：将大鼠皮肤自然固定在改良的Franz扩散池上（扩散面积S＝2.5cm

实施例7治疗类风湿性关节炎的效果

（1）动物模型及分组准备

清洁级雌、雄性Wistar大鼠110只，4～6周龄，体重（180±10）g。采用II型胶原诱导大鼠关节炎模型，将鸡II型胶原用5g/L的浓度溶于0.01mol/L的醋酸溶液中，与等体积弗氏完全佐剂混合，制成乳剂，加入卡介苗，在100只实验大鼠的尾部和背部进行皮内注射免疫；14d后足部皮下加强免疫1次。模型完成后随机分组：模型组，不给药；生长抑素给药组：生长抑素注射液关节内注射，每周1次；曲安奈德给药组：曲安奈德注射液关节内注射，每周1次；喷雾剂给药组：曲安奈德组合物喷雾剂喷于关节处，每天两次，每次给药量1 mL。治疗5周后，将大鼠麻醉后，抽血，分离血清，-70℃保存生化检测备用，其中一部分56℃灭活30min后，过滤除菌，作含药血清备用；同时打开关节腔，取出滑膜组织，70％酒精固定，备用组织切片。

（2）检测项目及检测方法

a. 关节肿胀指数采用0-4级关节评分法。0分：无关节炎；1分：趾关节轻度肿胀；2分：小趾关节和足跖肿胀；3分：踝关节以下的足爪肿胀；4分：包括踝关节在内全部关节肿胀；给药前为观察点1，以后每周1次，共5次。

b. 生化检测使用IL-1β（TPI Inc IR043）和TNF-α（TPI Inc IR0820）Elisa试剂盒和Wellscan MK II型酶标仪。

c. 含药血清对滑膜细胞增殖的测定用含10％小牛血清-DMEM培养液制备模型组大鼠原代滑膜细胞悬液（2×10

（3）结果

a. 关节肿胀指数

表1为关节肿胀指数测定的结果，从表中可以看出，生长抑素给药组：给药量偏低时，缓解关节肿胀的作用微弱且缓慢，随着给药量的增加，缓解关节肿胀的效果增强，且持续治疗作用时间增长。曲安奈德给药组：给药量偏低时，缓解关节肿胀的作用微弱，随着给药量的增加，缓解关节肿胀的效果增强，但持续治疗作用效果却下降了，如：给药量45.5mg、70 mg在给药1周后即可缓解关节肿胀，但在给药第4周后，持续治疗作用反而下降了。喷雾剂给药组：实施例1制得的喷雾剂每周累积给药量：生长抑素2.8 mg，曲安奈德0.7 mg；实施例3制得的喷雾剂每周累积给药量：生长抑素0.028 mg，曲安奈德70 mg；实施例5制得的喷雾剂每周累积给药量：生长抑素0.7 mg，曲安奈德45.5 mg。实施例1、3、5制得的喷雾剂缓解关节肿胀起效快，且持续治疗作用持久。这表明曲安奈德和生长抑素联合用药缓解关节疼痛、肿胀具有协同作用，且起效快，持续治疗作用持久。

表1关节肿胀指数测定（x±s）

b. 血清TNF-α、IL-1β

炎症分泌TNF-α和IL-1β是类风湿性炎发病机制中居中心地位的促炎细胞因子。表2为血清TNF-α、IL-1β测定的结果，从表中可以看出，与模型组相比，生长抑素给药组、曲安奈德给药组和喷雾剂给药组的TNF-α水平均有不同程度的降低，喷雾剂给药组的降低程度最高；此外，生长抑素给药组和喷雾剂给药组的IL-1β水平也降低了。这表明曲安奈德和生长抑素联合用药缓解关节疼痛、肿胀具有协同作用，且持续治疗作用持久，优于单独注射曲安奈德或者生长抑素。

表2 血清TNF-α、IL-1β测定（x±s）

c. 大鼠膝关节滑膜的组织学

正常大鼠滑膜及关节面未见病变，滑膜衬里层由1～2层滑膜细胞组成且部分不连续，滑膜衬里下层则为脂肪细胞核血管，未见炎症细胞侵润、成纤维细胞及胶原纤维。模型组动物膝关节内滑膜组织肿胀，滑膜上层增厚，滑膜细胞增大，数量增多，滑膜下明显炎症，滑膜组织内结缔组织中血管充血，毛细血管明显增多，纤维组织疏松，可见较多的慢性炎细胞侵润，关节软骨可见大小不等的片状坏死灶，边缘不整。生长抑素给药组、曲安奈德给药组和喷雾剂给药组上述病变程度与模型组相比，均有不同程度的减轻，主要表现在关节软组织内炎细胞数量减少；少见血管形成、关节软骨破坏、边缘不整。表3为含药血清对滑膜细胞增殖的影响的结果，喷雾剂给药组与空白组的OD值最接近，表明曲安奈德和生长抑素联合用药缓解关节疼痛、肿胀具有协同作用，且持续治疗作用持久，优于单独注射曲安奈德或者生长抑素。

表3 含药血清对滑膜细胞增殖的影响（x±s）