一种人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉的制备方法

摘要

本发明公开一种人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉的制备方法，包括其以下步骤：先将35~75份重的脂质体膜成分溶于有机溶剂，旋蒸去除所有有机溶剂得到脂质体薄膜，再将含有10~40份重的冻干保护剂的缓冲液加入到该薄膜中进行水化，超声整粒得空白脂质体悬液。再将1~10份重的人间充质干细胞分泌因子和1~10份重的抗氧化剂加入空白脂质体悬液进行包封反应，对产物进行过膜整粒，并依次经冻融、冷冻干燥后即得。本发明的脂质体冻干粉保质期长，应用范围广。

说明书

技术领域

本发明属于活性生物制品技术领域，具体涉及一种人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉的制备方法。

背景技术

人间充质干细胞( mesenchymal stem cell，MSC )在培养中分泌碱性成纤维细胞生长因子( bFGF )、人表皮生长因子( EGF )、血管内皮生长因子( VEGF )、胰岛素样生长因子-1( IGF-1 )和肝细胞生长因子( HGF )在内的多种促进皮肤细胞再生的生长因子。这些具有生物活性的生长因子能够有效的促进皮肤细胞的新陈代谢；促进细胞外透明质酸、糖蛋白等大分子的合成和分泌；促进表皮细胞的生长、分化和修复，使衰老死亡的细胞得以及时补充；同时能够加速角质层修复，加速基底新老细胞更替。

目前人间充质干细胞的应用在培养扩增过程中会引入外源性的蛋白(胎牛血清)，容易引起免疫反应；而且液态培养上清在常温保存时间很短，即使是通过冷冻干燥技术除去水分，其稳定性也不理想，必须现配现用。同时很难直接适应不同剂型的添加要求。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉的制备方法，解决了现有应用人间充质干细胞培养上清液易引起免疫排斥反应、保存期限短以及配伍性差的问题。

本发明所采用的一个技术方案是，一种人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉的制备方法，包括以下步骤：

步骤（1），制备空白脂质体悬液；

首先将脂质体膜成分溶于有机溶剂，得到原料溶液；再将该原料溶液减压旋转蒸发去除有机溶剂，得到脂质体薄膜，然后将含有冻干保护剂的磷酸盐缓冲液，缓慢加入，进行水化，得到乳浊液；最后对乳浊液进行超声整粒，得到空白脂质体悬液；

步骤（2），制备人间充质干细胞分泌因子；

取3~15代的传代间充质干细胞培养液上清，中空纤维膜过滤浓缩；

步骤（3），制备人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉；

将人间充质干细胞分泌因子和抗氧化剂加入空白脂质体悬液，在水浴和超声的条件下进行包封反应，包封反应结束后对产物进行过膜整粒，收集过膜后的产物，将产物依次经离心、洗涤、反复冻融、冷冻干燥后，得到人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉。

优选地，步骤（1）中脂质体膜成分为大豆卵磷脂、胆固醇；抗氧化剂为维生素E；冻干粉保护剂为甘露醇；有机溶剂为无水乙醇。。

优选地，步骤（1）中脂质体膜成分和有机溶剂的质量百分比为：脂质体膜成分15~50%，有机溶剂50～85％。

优选地，步骤（1）中冻干保护剂的磷酸盐缓冲液中冻干保护剂的含量6％。

优选地，步骤（2）中间充质干细胞培养用培养基为添加2%血清替代物，不含胎牛血清的DMEM/F12培养基。

优选地，步骤（2）中中空纤维膜的截留分子量为1KD。

优选地，步骤（3）中空白脂质体悬液的质量浓度为5～10％，所述包封反应具体为在25℃水浴中超声10min，超声功率300W。

优选地，步骤（3）中的冻融为-80℃冷冻2h，37℃水浴解冻，一共冻融6次；冷冻干燥中预冻温度为-60℃±5℃，预冻时间6h以上，冷阱温度为-50～-56℃，真空度≤80mT，冻干时间36h。

本发明的有益效果是：( 1 )本发明所用的干细胞培养基用血清替代物代替胎牛血清，不用培养过程中逐步降低血清含量，操作简便，且提取的干细胞分泌因子不含动物血清成分，减小了应用中存在的免疫排斥反应；( 2 )采用脂质体工艺保证了多种分泌因子活性，冻干即可常温保存，解决了干细胞分泌因子保存期短的问题；( 3 )经脂质体包覆后的干细胞分泌因子可直接添加于多种剂型的化妆品或医用敷料中，拓宽了其应用。

附图说明

图1，为本发明的具体工艺流程。

图2，为本发明的人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉在加速稳定性试验条件下随储存时间渗漏率的变化及对L929小鼠成纤维细胞的增殖能力影响的变化。

图3，为本发明的人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉（样品组）、对照组和空白组对L929小鼠成纤维细胞培养5天的细胞形态对比。

具体实施方式

下面对发明内容做详细说明，以更好地理解本发明的原理和优点。

有关定义：

包封率：包封率=（脂质体中包封的药物/脂质体中药物总量）×100%；

渗漏率：渗漏率=（放置前介质中药物量－放置后介质中的药量）/制剂中药量x100%；

细胞的增值能力：MTT法考察人间充质干细胞分泌因子脂质体对细胞的增值能力。采用小鼠成纤维细胞L929为靶细胞，基础培养基培养，对比空白组（PBS缓冲液），对照组（人间充质干细胞分泌因子），样品组（人间充质干细胞分泌因子脂质体）在培养5天，对L929细胞增殖活力的影响；

细胞活力：指总细胞群中活细胞所占的百分比，活细胞越多，光密度值(OD )就越高。通过酶标仪测定活细胞的数量，OD值越高表示活细胞数量越多。

实施例1

制备一种人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉，其方法如下。

步骤(1 )，制备人间充质干细胞分泌因子

人脐带间充质干细胞提取：无菌条件下，取新生儿脐带5～10cm，用生理盐水冲洗直至血管内无血迹。去除血管，剥离华通氏胶，将华通氏胶组织剪碎至约1mm

收集分泌因子：细胞融合度80％时，胰蛋白酶消化细胞传代培养3~ 6代。收集每代细胞的上清培养液；

超滤浓缩：将收集的培养液上清通过1KD截留分子量的中空纤维膜过滤浓缩，得到蛋白含量0.08mg/ml左右的人间充质干细胞分泌因子。

步骤( 2 )，制备空白脂质体悬液

称取以下原料组分，大豆卵磷脂3 .6g ，胆固醇1 .2g ，将其溶于7 .5mL无水乙醇，得到原料溶液。再将6 .5g甘露醇加入150mL磷酸盐缓冲液中充分混合。然后将原料溶液转移到洁净的圆底烧瓶中，30℃水浴中以100rpm旋转蒸发除去有机溶剂，得到脂质体薄膜；再将加了冻干保护剂的缓冲液加入圆底烧瓶进行水化，水化时间30min，水化温度35℃，得到乳浊液。最后对乳浊液进行超声整粒，超声功率为300W，超声时间为10min，得到空白脂质体悬液。

步骤( 3 )，制备人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉

取步骤( 2 )的空白脂质体悬液置于摇床中，在振荡条件下将步骤( 1 )的人间充质干细胞分泌因子和维生素E0.12g加入悬液中，其中，空白脂质体悬液和人间充质干细胞培养液的体积比为20:1。在30℃水浴和300W超声功率的条件下超声5min，完成包封反应。包封反应结束后使反应物依次经过0 .8μm滤膜、0 .45μm滤膜和0 .22μm滤膜，进行整粒，收集通过0 .22μm滤膜的产物，得到粒径均匀的包封人间充质干细胞分泌因子的脂质体悬液。该脂质体悬液在-80℃冷冻1h，并在37℃水浴中解冻，如此反复冻融5次。最后将冻融产物放入冷冻干燥机中冷冻，预冻温度为-60℃±2℃，预冻时间6h，冷阱温度为-50～-56℃，真空度≤80mT，冻干时间24h。得到最终的包封人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉。

本实施例得到的包封人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉，其中，人间充质干细胞分泌因子1 .5％，包封率为72.2%，水分2 .4％，放置12个月渗漏率为2.7%。

实施例2

制备一种人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉，其方法如下。

步骤(1 )，制备人胎盘间充质干细胞分泌因子

人胎盘间充质干细胞提取：无菌条件下，取胎盘绒毛膜面1～2cm厚组织，用生理盐水冲洗直至无血迹。将胎盘组织剪碎至约1mm

收集分泌因子：细胞融合度80％时，胰蛋白酶消化细胞传代培养3~10代。收集每代细胞的上清培养液；

超滤浓缩：将收集的培养液上清通过3KD截留分子量的中空纤维膜过滤浓缩，得到蛋白含量0.08mg/ml左右的人间充质干细胞分泌因子。

步骤( 2 )，制备空白脂质体悬液

称取以下原料组分，大豆卵磷脂10.5g ，胆固醇1 .5g，将其溶于15mL无水乙醇，得到原料溶液。再将2.0g甘露醇加入150mL磷酸盐缓冲液中充分混合。然后将原料溶液转移到洁净的圆底烧瓶中，30℃水浴中以200rpm旋转蒸发除去有机溶剂，得到脂质体薄膜；再将加了冻干保护剂的缓冲液加入圆底烧瓶进行水化，水化时间30min，水化温度35℃，得到乳浊液。最后对乳浊液进行超声整粒，超声功率为300W，超声时间为20min，得到空白脂质体悬液。

步骤( 3 )，制备人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉

取步骤( 2 )的空白脂质体悬液置于摇床中，在振荡条件下将步骤( 1 )的人间充质干细胞分泌因子和维生素E0.12g加入悬液中，其中，空白脂质体悬液和人间充质干细胞培养液的体积比为18:1。在30℃水浴和300W超声功率的条件下超声10min，完成包封反应。包封反应结束后使反应物依次经过0 .8μm滤膜、0 .45μm滤膜和0 .22μm滤膜，进行整粒，收集通过0 .22μm滤膜的产物，得到粒径均匀的包封人间充质干细胞分泌因子的脂质体悬液。该脂质体悬液在-80℃冷冻1h，并在25℃水浴中解冻，如此反复冻融5次。最后将冻融产物放入冷冻干燥机中冷冻，预冻温度为-60℃±2℃，预冻时间8h，冷阱温度为-50～-56℃，真空度≤80mT，冻干时间36h。得到最终的包封人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉。

本实施例得到的包封人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉，其中，人间充质干细胞分泌因子2.2％，包封率为84.6%，水分1.1％，放置12个月渗漏率为1.9%。

实施例3

制备一种人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉，其方法如下。

步骤(1 )，制备人脂肪间充质干细胞分泌因子

人脂肪间充质干细胞提取：无菌条件下，取脂肪组织生理盐水冲洗直至无血迹，剔除筋膜。将脂肪组织剪碎至约1mm

收集分泌因子：细胞融合度80％时，胰蛋白酶消化细胞传代培养3~ 15代。收集每代细胞的上清培养液；

超滤浓缩：将收集的培养液上清通过5KD截留分子量的中空纤维膜过滤浓缩，得到蛋白含量0.08mg/ml左右的人间充质干细胞分泌因子。

步骤( 2 )，制备空白脂质体悬液

称取以下原料组分，大豆卵磷脂12.5g ，胆固醇0.5g，将其溶于15mL无水乙醇，得到原料溶液。再将2 .5g甘露醇加入150mL磷酸盐缓冲液中充分混合。然后将原料溶液转移到洁净的圆底烧瓶中，35℃水浴中以200rpm旋转蒸发除去有机溶剂，得到脂质体薄膜；再将加了冻干保护剂的缓冲液加入圆底烧瓶进行水化，水化时间40min，水化温度35℃，得到乳浊液。最后对乳浊液进行超声整粒，超声功率为200W，超声时间为20min，得到空白脂质体悬液。

步骤( 3 )，制备人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉

取步骤( 2 )的空白脂质体悬液置于摇床中，在振荡条件下将步骤( 1 )的人间充质干细胞分泌因子和维生素E0. 2g加入悬液中，其中，空白脂质体悬液和人间充质干细胞培养液的体积比为20:1。在30℃水浴和300W超声功率的条件下超声15min，完成包封反应。包封反应结束后使反应物依次经过0 .8μm滤膜、0 .45μm滤膜和0 .22μm滤膜，进行整粒，收集通过0 .22μm滤膜的产物，得到粒径均匀的包封人间充质干细胞分泌因子的脂质体悬液。该脂质体悬液在-80℃冷冻2h，并在20℃水浴中解冻，如此反复冻融5次。最后将冻融产物放入冷冻干燥机中冷冻，预冻温度为-60℃±2℃，预冻时间8h，冷阱温度为-50～-56℃，真空度≤80mT，冻干时间36h。得到最终的包封人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉。

本实施例得到的包封人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉，其中，人脐带间充质干细胞分泌因子1 .8％，包封率为80.9%，水分1.9％，放置12个月渗漏率为3.1%。

对本发明的人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉的质量特性进行试验，在加速稳定性试验条件下放置6个月其渗漏率不超过2%，同时对L929小鼠成纤维细胞的增殖能力基本保持不变（图2），说明本发明的人间充质干细胞分泌因子脂质体冻干粉具有至少三年的保质期限。

本发明以上描述只是部分实施例，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式。上述的具体实施方式是示意性的，并不是限制性的。凡是采用本发明的材料和方法，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，所有具体拓展均属本发明的保护范围之内。