多重PCR技术检测同时多种病原体耐药基因临床应用

摘要

本发明涉及病原体检测技术领域，具体涉及多重PCR技术检测同时多种病原体耐药基因临床应用；本发明通过将样本打碎、离心，并进行裂解，由全自动核酸提取仪器提取核酸，所提取的核酸溶解于DEPC水中，并加入耐药基因，再用Takara逆转录酶进行逆转录，通过对逆转录产物进行PC R扩增、测序以及分析，能够有效的提升对于多种病原体的检测性能，与传统直接免疫荧光法相比，更具有优异性，能够应用在多种病原体耐药基因临床上。

说明书

技术领域

本发明涉及病原体检测技术领域，具体涉及多重PCR技术检测同时多种病原体耐药基因临床应用。

背景技术

下呼吸道感染是最常见的呼吸系统疾病，严重危害公共卫生和人民身体健康，包括一系列疾病，其中以社区获得性肺炎(CAP)和慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)最具代表性。美国一项研究数据显示：无论是CAP还是AECOPD年花费均超过100亿美元，根据单病种死因分析显示CAP和AECOPD的致死率分别排第六位和第四位，每年有150多万成年人因CAP住院治疗，是医疗卫生的主要负担之一。

目前临床普遍采用直接免疫荧光法检测抗原，但是该方法难以满足复杂呼吸道感染的诊断需求，无法满足对于多种病原体检测的需求，开展病原体精准快速检测可为临床精准诊疗提供支持。

综上所述，研发多重PCR技术检测同时多种病原体耐药基因临床应用，仍是病原体检测领域中亟需解决的关键问题。

发明内容

针对现有技术所存在的上述缺点，本发明能够有效的提升对于多种病原体的检测性能，与传统直接免疫荧光法相比，更具有优异性，能够应用在多种病原体耐药基因临床上。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了多重PCR技术检测同时多种病原体耐药基因临床应用，包括以下步骤：

(1)收集样本，将样本置于冻存管内，并向冻存管内加入冻存液，于-80℃下保存；

(2)取保存的样本，用漩涡混合器将样本打碎，再用离心机离心后，将沉淀物用缓冲液PBS冲洗2-3次，再用缓冲液PBS将其调成悬液，加入裂解液，用全自动核酸提取仪器提取核酸；

(3)将所提取的核酸溶解于DEPC水中，并加入耐药基因，再用Takara逆转录酶进行逆转录；

(4)对逆转录产物进行PC R扩增，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将扩增产物用Applied Biosystems3730进行测序，并将正/反向测序结果在NCBI上做BLAST分析。

本发明进一步设置为：在步骤(2)中，所述的漩涡混合器的转速为600-1100r/min，时间为20-30min。

本发明进一步设置为：在步骤(2)中，所述的离心机转速为 1500-1600r/min，离心时间为10min。

本发明进一步设置为：在步骤(2)中，所述的缓冲液PBS的 Ph值为7.2。

本发明进一步设置为：在步骤(3)中，所述的逆转录的条件为 48℃20min，然后95℃5min。

本发明进一步设置为：在步骤(4)中，所述的PC R扩增的条件为95℃2min预变性，之后95℃20s，60℃40s进行20个循环扩增。

本发明进一步设置为：在步骤(4)中，所述的电泳检测PCR产物是将PC R扩增产物在1％琼脂糖凝胶中点样，并且加入50bpDNA Ladder作为分子量的标准，然后在120V电压下电泳35min。

本发明进一步设置为：在步骤(4)中，若电泳检测PCR产物中某病原体没有相应大小的扩增产物，直接判读该病原体阴性，若有相应大小的扩增产物，则将扩增产物用Applied Biosystems3730进行测序。

本发明进一步设置为：在步骤(4)中，若正/反向测序结果有 1个与该病原体相符，则判读该病原体阳性，若正反向测序结果均与该病原体不符，则判读该病原体阴性。

有益效果

采用本发明提供的技术方案，与已知的公有技术相比，具有如下有益效果：

本发明通过将样本打碎、离心，并进行裂解，由全自动核酸提取仪器提取核酸，所提取的核酸溶解于DEPC水中，并加入耐药基因，再用Takara逆转录酶进行逆转录，通过对逆转录产物进行PC R 扩增、测序以及分析，能够有效的提升对于多种病原体的检测性能，与传统直接免疫荧光法相比，更具有优异性，能够应用在多种病原体耐药基因临床上。

附图说明

图1为本发明多重PCR技术检测同时多种病原体耐药基因临床应用的流程图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1：

多重PCR技术检测同时多种病原体耐药基因临床应用，包括以下步骤：

(1)收集样本，将样本置于冻存管内，并向冻存管内加入冻存液，于-80℃下保存。

(2)取保存的样本，用漩涡混合器将样本打碎，再用离心机离心后，将沉淀物用缓冲液PBS冲洗2次，再用缓冲液PBS将其调成悬液，加入裂解液，用全自动核酸提取仪器提取核酸。

进一步的，漩涡混合器的转速为600r/min，时间为20min。

进一步的，离心机转速为1500r/min，离心时间为10min。

进一步的，缓冲液PBS的Ph值为7.2。

(3)将所提取的核酸溶解于DEPC水中，并加入耐药基因，再用Takara逆转录酶进行逆转录。

进一步的，逆转录的条件为48℃20min，然后95℃5min。

(4)对逆转录产物进行PC R扩增，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将扩增产物用Applied Biosystems3730进行测序，并将正/反向测序结果在NCBI上做BLAST分析。

进一步的，PC R扩增的条件为95℃2min预变性，之后95℃ 20s，60℃40s进行20个循环扩增。

进一步的，电泳检测PCR产物是将PC R扩增产物在1％琼脂糖凝胶中点样，并且加入50bpDNA Ladder作为分子量的标准，然后在 120V电压下电泳35min。

进一步的，若电泳检测PCR产物中某病原体没有相应大小的扩增产物，直接判读该病原体阴性，若有相应大小的扩增产物，则将扩增产物用Applied Biosystems3730进行测序。

进一步的，若正/反向测序结果有1个与该病原体相符，则判读该病原体阳性，若正反向测序结果均与该病原体不符，则判读该病原体阴性。

在本实施例中，本实施例中所加入的耐药基因的一种形式为β- 内酰胺类耐药基因。

此外，对逆转录产物进行PCR扩增，所使用的扩展引物的一种形式为SEQ ID No.1：

5'-GTCGGAATCGCTAGTAATCG-3'

5'-GGGTTCCCCACTTCGGA-3'。

实施例2：

多重PCR技术检测同时多种病原体耐药基因临床应用，包括以下步骤：

(1)收集样本，将样本置于冻存管内，并向冻存管内加入冻存液，于-80℃下保存。

(2)取保存的样本，用漩涡混合器将样本打碎，再用离心机离心后，将沉淀物用缓冲液PBS冲洗3次，再用缓冲液PBS将其调成悬液，加入裂解液，用全自动核酸提取仪器提取核酸。

进一步的，漩涡混合器的转速为850r/min，时间为25min。

进一步的，离心机转速为1550r/min，离心时间为10min。

进一步的，缓冲液PBS的Ph值为7.2。

(3)将所提取的核酸溶解于DEPC水中，并加入耐药基因，再用Takara逆转录酶进行逆转录。

进一步的，逆转录的条件为48℃20min，然后95℃5min。

(4)对逆转录产物进行PC R扩增，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将扩增产物用Applied Biosystems3730进行测序，并将正/反向测序结果在NCBI上做BLAST分析。

进一步的，PC R扩增的条件为95℃2min预变性，之后95℃ 20s，60℃40s进行20个循环扩增。

进一步的，电泳检测PCR产物是将PC R扩增产物在1％琼脂糖凝胶中点样，并且加入50bpDNA Ladder作为分子量的标准，然后在 120V电压下电泳35min。

进一步的，若电泳检测PCR产物中某病原体没有相应大小的扩增产物，直接判读该病原体阴性，若有相应大小的扩增产物，则将扩增产物用Applied Biosystems3730进行测序。

进一步的，若正/反向测序结果有1个与该病原体相符，则判读该病原体阳性，若正反向测序结果均与该病原体不符，则判读该病原体阴性。

在本实施例中，本实施例中所加入的耐药基因的一种形式为β- 内酰胺类耐药基因。

此外，对逆转录产物进行PCR扩增，所使用的扩展引物的一种形式为SEQ ID No.1：

5'-GTCGGAATCGCTAGTAATCG-3'

5'-GGGTTCCCCACTTCGGA-3'。

实施例3：

多重PCR技术检测同时多种病原体耐药基因临床应用，包括以下步骤：

(1)收集样本，将样本置于冻存管内，并向冻存管内加入冻存液，于-80℃下保存。

(2)取保存的样本，用漩涡混合器将样本打碎，再用离心机离心后，将沉淀物用缓冲液PBS冲洗3次，再用缓冲液PBS将其调成悬液，加入裂解液，用全自动核酸提取仪器提取核酸。

进一步的，漩涡混合器的转速为1100r/min，时间为30min。

进一步的，离心机转速为1600r/min，离心时间为10min。

进一步的，缓冲液PBS的Ph值为7.2。

(3)将所提取的核酸溶解于DEPC水中，并加入耐药基因，再用Takara逆转录酶进行逆转录。

进一步的，逆转录的条件为48℃20min，然后95℃5min。

(4)对逆转录产物进行PC R扩增，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将扩增产物用Applied Biosystems3730进行测序，并将正/反向测序结果在NCBI上做BLAST分析。

进一步的，PC R扩增的条件为95℃2min预变性，之后95℃ 20s，60℃40s进行20个循环扩增。

进一步的，电泳检测PCR产物是将PC R扩增产物在1％琼脂糖凝胶中点样，并且加入50bpDNA Ladder作为分子量的标准，然后在 120V电压下电泳35min。

进一步的，若电泳检测PCR产物中某病原体没有相应大小的扩增产物，直接判读该病原体阴性，若有相应大小的扩增产物，则将扩增产物用Applied Biosystems3730进行测序。

进一步的，若正/反向测序结果有1个与该病原体相符，则判读该病原体阳性，若正反向测序结果均与该病原体不符，则判读该病原体阴性。

在本实施例中，本实施例中所加入的耐药基因的一种形式为β- 内酰胺类耐药基因。

此外，对逆转录产物进行PCR扩增，所使用的扩展引物的一种形式为SEQ ID No.1：

5'-GTCGGAATCGCTAGTAATCG-3'

5'-GGGTTCCCCACTTCGGA-3'。

性能检测：

采用实施例1、实施例2、实施例3以及直接免疫荧光法(对比例)，检测FluA、RSV、PIV、ADV病原体，相关数据记录于表1。

表1：检测结果比较记录表

由表1可知，本发明所采用的多重PCR技术对于病原体的灵敏度和正确率均高于直接免疫荧光法(p＜0.05)，对病原体的特异度与直接免疫荧光法差异并不明显(p＞0.05)，且实施例1、实施例 2和实施例3对于病原体的灵敏度、特异度和正确率差异并不具有统计学意义。本发明所提供的多重PCR技术，具有优异的检测性能，能够应用在耐药基因临床检测上。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不会使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。