快速筛选茉莉酸甲酯缓解玉米幼苗盐胁迫最佳浓度的方法

摘要

快速筛选外源油菜素甾醇缓解玉米幼苗盐胁迫最佳浓度的方法，涉及玉米对盐碱地开发利用及生产保障领域。内容包括对材料收集，配制EBR溶液、种子预处理、幼苗胁迫实验、性状采集方法及最佳浓度应用和结果分析。本发明采用隶属函数法，综合评价不同浓度外源MeJA对玉米盐胁迫的缓解效果，为玉米快速筛选MeJA浓度和高效应用MeJA缓解盐胁迫提供技术参考，具有很高的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及农业技术技术领域，具体为快速筛选茉莉酸甲酯缓解玉米幼苗盐胁迫最佳浓度的方法。

背景技术

玉米作为我国主要的能源、经济和粮饲作物，其生产安全对我国粮食稳产有着极其重要的作用。同时，玉米也是一种盐敏感作物，整个生育期对盐胁迫的耐受性较差。有研究表明，当土壤的含盐量为全盐含量的30％时，玉米整个生育期将受到轻微胁迫，表现出生长缓慢的现象；当土壤含量为全盐含量的40％时，玉米植株的生长将受到严重抑制，光抑制和PSΠ修复抑制现象产生，致使光合作用严重下降，而且严重盐渍胁迫还会造成玉米绝收。近年来，为了提高玉米品种对土壤盐渍的耐受性，不同学者从不同的研究方向展开一系列相关研究，但主要集中在两个方面，一方面是在不同盐胁迫条件下筛选现有的种质资源，以期筛选出一些耐盐性较好的玉米自交系，为今后田间组配和分子标记辅助育种提供优良材料；另一方面是通过添加一些外源调节物质来缓解玉米所受到的盐害胁迫。而通过耐盐自交系培育玉米耐盐新品种不仅所需时间较长，而且仅利用耐盐材料组配新品种的耐盐性还有待研究。近年来的一些研究指出，茉莉酸甲酯(MeJA)在缓解植物抗逆方面有着重要的作用。

茉莉酸甲酯是作为一种新型的生长调节物质，广泛存在于高等植物体内，参与植物体内许多重要的反应过程。近年来，利用茉莉酸甲酯缓解植物对盐胁迫耐受性的研究相继被报道。Yoon等研究指出，施加外源MeJA可有效改善盐胁迫下大豆体内叶绿素含量，促进光合作用。同时，施加外源MeJA还会促使大豆体内其他内源激素发生改变。Wang等研究指出，施加外源MeJA可改变草莓体内SOD、CAT、POD活性以及体内氨基酸水平，从而提高其耐旱性。AMOR等通过对青花菜的研究指出，叶面喷施MeJA可提高青花菜耐盐性。此外，Liu和SALIMI等通过对矮沙冬青和洋甘菊植株研究发现，适宜浓度MeJA处理，可促进植物植株生长，减轻盐胁迫的危害。虽然不同研究者在不同作物上都表明外源MeJA在植物缓解盐胁迫方面的作用，但在缓解玉米盐胁迫方面的研究还相对较少，且筛选方法也有待完善。因此，本发明通过研究不同浓度的MeJA对盐胁迫下玉米幼苗的缓解作用，从而提供一个快速筛选茉莉酸甲酯缓解玉米幼苗盐胁迫最佳浓度的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种快速筛选外源茉莉酸甲酯缓解玉米幼苗盐胁迫最佳浓度的方法。本方法能有效提高玉米苗期耐盐性，为开发利用我国盐碱地，扩大玉米种植面积提高能够一定的参考。

为解决现有技术存在的问题，本发明提供了快速筛选茉莉酸甲酯缓解玉米幼苗盐胁迫最佳浓度的方法，包括材料收集、配制MeJA处理液、种子精选及消毒、浸种、盐胁迫试验、测定项目与测定方法、结果分析等步骤，具体步骤如下：

(1)材料收集：选取一份盐敏感自交系N192；

(2)配置MeJA溶液和处理液；

(3)种子预处理；

(4)激素浓度筛选试验；

(5)测定幼苗形态；

(6)结果分析。

优选的，所述步骤(2)中配置MeJA溶液的具体方法为吸取22.92ul的茉莉酸甲酯原液少量(5-10ml)95％的乙醇溶解，然后用双蒸水定容至1L，配制为100umol/L MeJA母液。

优选的，所述步骤(2)中共需要配置5种不同浓度的处理液，具体为CK+：蒸馏水；CK-：180Mmol/LNaCl溶液；M1:180Mmol/LNaCl+0.1umol/L MeJA；M2:180Mmol/L NaCl+1.0umol/L；M3:180Mmol/L NaCl+5.0umol/L；M4:180Mmol/LNaCl+10.0umol/L；M5:180Mmol/LNaCl+20.0umol/L。

优选的，所述步骤(3)具体操作步骤为：挑选大小均匀、籽粒饱满和无破损的玉米种子，种子先采用70％乙醇浸泡1Min30s，用双蒸水冲洗2-3次后用0.5％的NaClO溶液消毒5-10min，然后双蒸水冲洗种子3次，再用灭菌滤纸吸干附着水，蒸馏水浸种12h，备用。

优选的，所述步骤(4)具体操作步骤为用相应处理液与蛭石均匀搅拌后，将浸种后的种子分别种植在小花盆中，每个处理3次重复，种植后置于人光照培养箱中培养，昼/夜温度为(27±1)/(25±1)℃，光周期设置为光照14h，黑暗10h。每隔1d补浇50mL相应去盐处理液，每3d补加50mL对应处理溶液；处理约12d后，用蒸馏水快速冲洗掉幼苗根部蛭石，并用灭菌滤纸吸干附着水，进行指标测定。

优选的，所述步骤(5)中每个材料的每个处理选取5株，每个处理设3个重复，根系生理指标测定具体为：处理约12d后，测定玉米幼苗根系超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性和丙二醛含量，每个材料每处理分别测3次重复，取均值。

优选的，所述步骤(5)中幼苗形态包括苗长、根长、地上部鲜重、地下部鲜重、根系投影面积、根系表面积和根系体积等数据指标。

优选的，通过HPLC串联质谱测定玉米叶片中生长素(IAA)，赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和2，4-表油菜素内酯(EBR)的相对含量。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明以1份盐敏感玉米自交系为试材，添加5种不同浓度外源MeJA后，研究了不同浓度的MeJA处理对盐胁迫下玉米幼苗形态指标和生理指标的影响；在此基础上，采用隶属函数法客观、综合评价了不同外源MeJA缓解盐胁迫的效果，本发明提供的方法操作简便易行，重复性好，可为今后了解外源MeJA对不同作物盐胁迫的缓解效果提供参考，并为玉米快速筛选MeJA浓度和高效应用MeJA缓解盐胁迫提供技术参考，具有很高的应用价值。

附图说明

图1为盐胁迫下，不同浓度MeJA处理对玉米自交系的苗长、根长、地上部鲜重和地下部鲜重影响示意图；

图2为盐胁迫下，不同浓度MeJA处理对玉米自交系的根系总长、表面面积、投影面积和根系体积影响示意图；

图3为盐胁迫下，不同浓度MeJA处理对玉米自交系的POD活性、SOD活性和MDA含量影响示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

快速筛选茉莉酸甲酯缓解玉米幼苗盐胁迫最佳浓度的方法，包括材料收集、配制MeJA处理液、种子精选及消毒、浸种、盐胁迫试验、测定项目与测定方法、结果分析等步骤，具体步骤如下：

(1)材料收集：选取一份盐敏感自交系N192；

(2)配置MeJA溶液和处理液；

(3)种子预处理；

(4)激素浓度筛选试验；

(5)测定幼苗形态；

(6)结果分析。

步骤(2)中配置MeJA溶液的具体方法为吸取22.92ul的茉莉酸甲酯原液少量(5-10ml)95％的乙醇溶解，然后用双蒸水定容至1L，配制为100umol/L MeJA母液。

步骤(2)中共需要配置5种不同浓度的处理液，具体为CK+：蒸馏水；CK-：180Mmol/LNaCl溶液；M1:180Mmol/L NaCl+0.1umol/L MeJA；M2:180Mmol/L NaCl+1.0umol/L；M3:180Mmol/LNaCl+5.0umol/L；M4:180Mmol/L NaCl+10.0umol/L；M5:180Mmol/LNaCl+20.0umol/L。

步骤(3)具体操作步骤为：挑选大小均匀、籽粒饱满和无破损的玉米种子，种子先采用70％乙醇浸泡1Min30s，用双蒸水冲洗2-3次后用0.5％的NaClO溶液消毒5-10min，然后双蒸水冲洗种子3次，再用灭菌滤纸吸干附着水，蒸馏水浸种12h，备用。

步骤(4)具体操作步骤为用相应处理液与蛭石均匀搅拌后，将浸种后的种子分别种植在小花盆中，每个处理3次重复，种植后置于人光照培养箱中培养，昼/夜温度为(27±1)/(25±1)℃，光周期设置为光照14h，黑暗10h。每隔1d补浇50mL相应去盐处理液，每3d补加50mL对应处理溶液；处理约12d后，用蒸馏水快速冲洗掉幼苗根部蛭石，并用灭菌滤纸吸干附着水，进行指标测定。

步骤(5)中每个材料的每个处理选取5株，每个处理设3个重复，根系生理指标测定具体为：处理约12d后，测定玉米幼苗根系超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性和丙二醛含量，每个材料每处理分别测3次重复，取均值。

步骤(5)中幼苗形态包括苗长、根长、地上部鲜重、地下部鲜重、根系投影面积、根系表面积和根系体积等数据指标。

通过HPLC串联质谱测定玉米叶片中生长素(IAA)，赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和2，4-表油菜素内酯(EBR)的相对含量。

实验时采用步骤(2)中配置的浓度为180Mmol/LNaCl+0.1umol/L的MeJA处理液。

实施例二

快速筛选茉莉酸甲酯缓解玉米幼苗盐胁迫最佳浓度的方法，包括材料收集、配制MeJA处理液、种子精选及消毒、浸种、盐胁迫试验、测定项目与测定方法、结果分析等步骤，具体步骤如下：

(1)材料收集：选取一份盐敏感自交系N192；

(2)配置MeJA溶液和处理液；

(3)种子预处理；

(4)激素浓度筛选试验；

(5)测定幼苗形态；

(6)结果分析。

步骤(2)中配置MeJA溶液的具体方法为吸取22.92ul的茉莉酸甲酯原液少量(5-10ml)95％的乙醇溶解，然后用双蒸水定容至1L，配制为100umol/L MeJA母液。

步骤(2)中共需要配置5种不同浓度的处理液，具体为CK+：蒸馏水；CK-：180Mmol/LNaCl溶液；M1:180Mmol/L NaCl+0.1umol/L MeJA；M2:180Mmol/L NaCl+1.0umol/L；M3:180Mmol/LNaCl+5.0umol/L；M4:180Mmol/L NaCl+10.0umol/L；M5:180Mmol/LNaCl+20.0umol/L。

步骤(3)具体操作步骤为：挑选大小均匀、籽粒饱满和无破损的玉米种子，种子先采用70％乙醇浸泡1Min30s，用双蒸水冲洗2-3次后用0.5％的NaClO溶液消毒5-10min，然后双蒸水冲洗种子3次，再用灭菌滤纸吸干附着水，蒸馏水浸种12h，备用。

步骤(4)具体操作步骤为用相应处理液与蛭石均匀搅拌后，将浸种后的种子分别种植在小花盆中，每个处理3次重复，种植后置于人光照培养箱中培养，昼/夜温度为(27±1)/(25±1)℃，光周期设置为光照14h，黑暗10h。每隔1d补浇50mL相应去盐处理液，每3d补加50mL对应处理溶液；处理约12d后，用蒸馏水快速冲洗掉幼苗根部蛭石，并用灭菌滤纸吸干附着水，进行指标测定。

步骤(5)中每个材料的每个处理选取5株，每个处理设3个重复，根系生理指标测定具体为：处理约12d后，测定玉米幼苗根系超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性和丙二醛含量，每个材料每处理分别测3次重复，取均值。

步骤(5)中幼苗形态包括苗长、根长、地上部鲜重、地下部鲜重、根系投影面积、根系表面积和根系体积等数据指标。

通过HPLC串联质谱测定玉米叶片中生长素(IAA)，赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和2，4-表油菜素内酯(EBR)的相对含量。

实验时采用步骤二中配置的浓度为180Mmol/L NaCl+1.0umol/L的MeJA处理液。

实施例三

快速筛选茉莉酸甲酯缓解玉米幼苗盐胁迫最佳浓度的方法，包括材料收集、配制MeJA处理液、种子精选及消毒、浸种、盐胁迫试验、测定项目与测定方法、结果分析等步骤，具体步骤如下：

(1)材料收集：选取一份盐敏感自交系N192；

(2)配置MeJA溶液和处理液；

(3)种子预处理；

(4)激素浓度筛选试验；

(5)测定幼苗形态；

(6)结果分析。

步骤(2)中配置MeJA溶液的具体方法为吸取22.92ul的茉莉酸甲酯原液少量(5-10ml)95％的乙醇溶解，然后用双蒸水定容至1L，配制为100umol/L MeJA母液。

步骤(2)中共需要配置5种不同浓度的处理液，具体为CK+：蒸馏水；CK-：180Mmol/LNaCl溶液；M1:180Mmol/L NaCl+0.1umol/L MeJA；M2:180Mmol/L NaCl+1.0umol/L；M3:180Mmol/LNaCl+5.0umol/L；M4:180Mmol/L NaCl+10.0umol/L；M5:180Mmol/LNaCl+20.0umol/L。

步骤(3)具体操作步骤为：挑选大小均匀、籽粒饱满和无破损的玉米种子，种子先采用70％乙醇浸泡1Min30s，用双蒸水冲洗2-3次后用0.5％的NaClO溶液消毒5-10min，然后双蒸水冲洗种子3次，再用灭菌滤纸吸干附着水，蒸馏水浸种12h，备用。

步骤(4)具体操作步骤为用相应处理液与蛭石均匀搅拌后，将浸种后的种子分别种植在小花盆中，每个处理3次重复，种植后置于人光照培养箱中培养，昼/夜温度为(27±1)/(25±1)℃，光周期设置为光照14h，黑暗10h。每隔1d补浇50mL相应去盐处理液，每3d补加50mL对应处理溶液；处理约12d后，用蒸馏水快速冲洗掉幼苗根部蛭石，并用灭菌滤纸吸干附着水，进行指标测定。

步骤(5)中每个材料的每个处理选取5株，每个处理设3个重复，根系生理指标测定具体为：处理约12d后，测定玉米幼苗根系超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性和丙二醛含量，每个材料每处理分别测3次重复，取均值。

步骤(5)中幼苗形态包括苗长、根长、地上部鲜重、地下部鲜重、根系投影面积、根系表面积和根系体积等数据指标。

通过HPLC串联质谱测定玉米叶片中生长素(IAA)，赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和2，4-表油菜素内酯(EBR)的相对含量。

实验时采用步骤二中配置的浓度为180Mmol/LNaCl+5.0umol/L处理液。

实施例四

快速筛选茉莉酸甲酯缓解玉米幼苗盐胁迫最佳浓度的方法，包括材料收集、配制MeJA处理液、种子精选及消毒、浸种、盐胁迫试验、测定项目与测定方法、结果分析等步骤，具体步骤如下：

(1)材料收集：选取一份盐敏感自交系N192；

(2)配置MeJA溶液和处理液；

(3)种子预处理；

(4)激素浓度筛选试验；

(5)测定幼苗形态；

(6)结果分析。

步骤(2)中配置MeJA溶液的具体方法为吸取22.92ul的茉莉酸甲酯原液少量(5-10ml)95％的乙醇溶解，然后用双蒸水定容至1L，配制为100umol/L MeJA母液。

步骤(2)中共需要配置5种不同浓度的处理液，具体为CK+：蒸馏水；CK-：180Mmol/LNaCl溶液；M1:180Mmol/L NaCl+0.1umol/L MeJA；M2:180Mmol/L NaCl+1.0umol/L；M3:180Mmol/LNaCl+5.0umol/L；M4:180Mmol/L NaCl+10.0umol/L；M5:180Mmol/LNaCl+20.0umol/L。

步骤(3)具体操作步骤为：挑选大小均匀、籽粒饱满和无破损的玉米种子，种子先采用70％乙醇浸泡1Min30s，用双蒸水冲洗2-3次后用0.5％的NaClO溶液消毒5-10min，然后双蒸水冲洗种子3次，再用灭菌滤纸吸干附着水，蒸馏水浸种12h，备用。

步骤(4)具体操作步骤为用相应处理液与蛭石均匀搅拌后，将浸种后的种子分别种植在小花盆中，每个处理3次重复，种植后置于人光照培养箱中培养，昼/夜温度为(27±1)/(25±1)℃，光周期设置为光照14h，黑暗10h。每隔1d补浇50mL相应去盐处理液，每3d补加50mL对应处理溶液；处理约12d后，用蒸馏水快速冲洗掉幼苗根部蛭石，并用灭菌滤纸吸干附着水，进行指标测定。

步骤(5)中每个材料的每个处理选取5株，每个处理设3个重复，根系生理指标测定具体为：处理约12d后，测定玉米幼苗根系超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性和丙二醛含量，每个材料每处理分别测3次重复，取均值。

步骤(5)中幼苗形态包括苗长、根长、地上部鲜重、地下部鲜重、根系投影面积、根系表面积和根系体积等数据指标。

通过HPLC串联质谱测定玉米叶片中生长素(IAA)，赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和2，4-表油菜素内酯(EBR)的相对含量。

实验时采用步骤二中配置的浓度为180Mmol/LNaCl+10.0umol/L。

实施例五

快速筛选茉莉酸甲酯缓解玉米幼苗盐胁迫最佳浓度的方法，包括材料收集、配制MeJA处理液、种子精选及消毒、浸种、盐胁迫试验、测定项目与测定方法、结果分析等步骤，具体步骤如下：

(1)材料收集：选取一份盐敏感自交系N192；

(2)配置MeJA溶液和处理液；

(3)种子预处理；

(4)激素浓度筛选试验；

(5)测定幼苗形态；

(6)结果分析。

步骤(2)中配置MeJA溶液的具体方法为吸取22.92ul的茉莉酸甲酯原液少量(5-10ml)95％的乙醇溶解，然后用双蒸水定容至1L，配制为100umol/L MeJA母液。

步骤(2)中共需要配置5种不同浓度的处理液，具体为CK+：蒸馏水；CK-：180Mmol/LNaCl溶液；M1:180Mmol/L NaCl+0.1umol/L MeJA；M2:180Mmol/L NaCl+1.0umol/L；M3:180Mmol/LNaCl+5.0umol/L；M4:180Mmol/L NaCl+10.0umol/L；M5:180Mmol/LNaCl+20.0umol/L。

步骤(3)具体操作步骤为：挑选大小均匀、籽粒饱满和无破损的玉米种子，种子先采用70％乙醇浸泡1Min30s，用双蒸水冲洗2-3次后用0.5％的NaClO溶液消毒5-10min，然后双蒸水冲洗种子3次，再用灭菌滤纸吸干附着水，蒸馏水浸种12h，备用。

步骤(4)具体操作步骤为用相应处理液与蛭石均匀搅拌后，将浸种后的种子分别种植在小花盆中，每个处理3次重复，种植后置于人光照培养箱中培养，昼/夜温度为(27±1)/(25±1)℃，光周期设置为光照14h，黑暗10h。每隔1d补浇50mL相应去盐处理液，每3d补加50mL对应处理溶液；处理约12d后，用蒸馏水快速冲洗掉幼苗根部蛭石，并用灭菌滤纸吸干附着水，进行指标测定。

步骤(5)中每个材料的每个处理选取5株，每个处理设3个重复，根系生理指标测定具体为：处理约12d后，测定玉米幼苗根系超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性和丙二醛含量，每个材料每处理分别测3次重复，取均值。

步骤(5)中幼苗形态包括苗长、根长、地上部鲜重、地下部鲜重、根系投影面积、根系表面积和根系体积等数据指标。

通过HPLC串联质谱测定玉米叶片中生长素(IAA)，赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和2，4-表油菜素内酯(EBR)的相对含量。

实验时采用步骤二中配置的浓度为180Mmol/LNaCl+20.0umol/L处理液。

分析数据后对比可知，施加0.1umol·L

以上实验皆采用隶属函数法对不同激素处理下各指标进行隶属函数值计算，并对各处理进行综合评价，隶属函数计算公式如下所示：

Uij＝(Xij-Xijmin)/(Xijmax-Xijmin)

式中，Uij表示i处理下第j指标的隶属值，Xij表示第i处理下第j指标的测定值，Xijmin与Xijmax表示所有处理下第j指标的最小值与最大值。分别累计各性状在相应处理下的隶属函数值，并求其算数平均数进行比较，其值越大则表示外源MeJA缓解盐胁迫的效果越好，所有试验数据均采用Microsoft Excel2019软件对数据进行处理和绘图，采用SPSS22.0软件对数据进行Duncan多重比较方差分析与相关性分析。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。