一种低皮肤光毒性的声动力治疗的纳米复合物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种低皮肤光毒性的声动力治疗的纳米复合物，所述纳米复合物是使用含有二硫键的咪唑衍生物为有机配体，金属离子为螯合金属，二者形成纳米金属有机骨架，并包载声敏剂，金属有机骨架外层再进一步涂覆泊洛沙姆，所制备得到的。本发明纳米复合物可降低声敏剂在正常组织器官中的光毒性，可通过肿瘤细胞内外GSH的巨大浓度差异来实现细胞内快速释放，并兼具分子靶向作用和声动力疗效。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其是一种低皮肤光毒性的声动力治疗的纳米复合物及其制备方法和应用。

背景技术

皮肤暴露于日光照射和光反应性外源生物可能会引起异常的皮肤反应，产生光毒性。光毒性是一种急性的光诱导反应，当光反应性化学物质被太阳光激活并转化为对皮肤细胞具有毒性的物质时，就会发生光毒性。紫外区是产生光毒性的主要吸收区间，光活性分子吸收能量产生活性氧引发光毒性。大多数的声敏剂同时也是光敏剂，所以它们的光毒性和癌症治疗后的皮肤敏感性对人体有副作用，声敏剂TiO

声动力学疗法(Sonodynamic therapy，SDT)是利用超声波对生物组织有较强的穿透能力，尤其是聚焦超声能无创伤地将声能聚焦于深部组织，超声可触发声敏剂产生活性氧，并引起细胞毒性，达到治疗目的。声敏剂是一类可预留在病灶部位，被超声激活，可使肿瘤部位产生一系列声化反应和生物学效应，从而达到抑制和杀伤肿瘤细胞的目的的化合物。此外，大多数声敏剂也具有光敏剂特性，因此在癌症治疗后存在光毒性等问题。声敏剂在正常组织器官中，经过光照射会产生活性氧等毒性物质，这些物质会引起炎症反应，从而具有光毒性。

一个良好的纳米载体对提高治疗效果和减少副作用起着至关重要的作用。金属有机骨架(Metal Organic Framework，MOF)是一类由有机配体和金属离子配位形成的多孔材料。MOF作为纳米多孔材料，具有比表面积大、载药量高、表面可修饰、负载物可控释放、可包载不同类型药物等优点。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种低皮肤光毒性的声动力治疗的纳米复合物及其制备方法和应用。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一种低皮肤光毒性的声动力治疗的纳米复合物，所述纳米复合物是使用含有二硫键的咪唑衍生物为有机配体，金属离子为螯合金属，二者形成纳米金属有机骨架，并包载声敏剂，金属有机骨架外层再进一步涂覆泊洛沙姆，所制备得到的。

进一步地，所述含有二硫键的咪唑衍生物的结构如(I)所示：

其中，n＝2-4。

进一步地，所述含有二硫键的咪唑衍生物的制备方法，包括如下步骤：

将二硫键双端羧基的结构(II)与N,N’-羰基二咪唑(III)溶解于有机溶剂三中，30℃搅拌反应4小时；纯化，向其中加入0.1M碳酸钠溶液洗涤2-5次，再加入超纯水洗涤2-5次，干燥，得到含有二硫键双端咪唑的有机单体(I)；

反应式:

其中，n＝2-4；

所述有机溶剂三为N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或二氯甲烷。

进一步地，所述声敏剂为二氧化钛，其制备步骤如下：

①将无水乙醇、油酸和钛酸四丁酯混合后，在室温下搅拌5min；其中，无水乙醇：油酸：钛酸四丁酯的比例mL：mL：g为15：5：0.57；

②将①所述混合液转移至高压反应釜并放入油浴锅中，在180℃-200℃下反应4h；

③反应后，将高压反应釜取出，放入通风处冷却后，离心后洗涤得到二氧化钛纳米粒；

或者，所述金属离子为锌离子、锰离子或镍离子。

如上所述的低皮肤光毒性的声动力治疗的纳米复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)A液的配制：按比例，将含有二硫键的咪唑衍生物放入有机溶剂一中，搅拌至溶解，加入三乙胺搅拌均匀，加入被包载物，使含有二硫键的咪唑衍生物的终浓度为10-20mM，使三乙胺的终浓度为10-20mM，使被包载物的终浓度为0.2-0.4mM；

(2)B液的配制：将金属离子加入到有机溶剂二中，配成浓度为20-40mM的溶液；

(3)将1体积份B液倒入2体积份的A液中，搅拌，反应，有沉淀生成，10000g，离心10min，用有机溶剂二洗涤，10000g，离心10min，得到沉淀；

(4)将步骤(3)获得的沉淀分散于有机溶剂二中，配成浓度为1-5mg/mL的分散液；

(5)取步骤(4)获得的分散液，加入泊洛沙姆，分散液：泊洛沙姆的比例mL：mg为1-5：25-50，超声10-30min，超滤，取沉淀，加超纯水分散，冻干，得到纳米复合物。

进一步地，所述被包载物为分散在四氢呋喃中的二氧化钛。

进一步地，所述有机溶剂一为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇或乙醇。

进一步地，所述有机溶剂二为N,N-二甲基甲酰胺，甲醇或者乙醇。

如上所述的纳米复合物在制备声动力治疗药物方面中的应用。

如上所述的纳米复合物在制备调控肿瘤细胞内氧化还原稳态药物方面中的应用。

本发明取得的有益效果是：

1、本发明纳米复合物通过使用含有二硫键的咪唑衍生物为有机配体，锌离子为螯合金属，二者形成纳米MOF，并包载声敏剂二氧化钛，MOF外层进一步涂覆泊洛沙姆，形成纳米复合物。本发明纳米复合物可降低声敏剂在正常组织器官中的光毒性，可通过肿瘤细胞内外GSH的巨大浓度差异来实现细胞内快速释放，并兼具分子靶向作用和声动力疗效。

2、本发明复合物以二硫键连接的咪唑衍生物为载体，有机配体中的咪唑环可以与

3、本发明复合物通过含有二硫键双端咪唑的有机单体(MOF Monomer)与锌离子等离子结合构建多功能性应答型纳米复合物，使其成为具有pH敏感、单线态氧敏感与氧化还原敏感的三重敏感的全活性纳米粒子。

4、本发明复合物将声敏剂包载于纳米MOF中，通过材料内大量的二硫键与癌细胞内的谷胱甘肽(GSH)作用，瞬态降低细胞内谷胱甘肽的含量，从而调整癌细胞内氧化还原稳态，降低体内谷胱甘肽的防御能力，从而提高声动力学效率。

5、本发明复合物的MOF单体中的咪唑环响应于肿瘤细胞外低pH环境，增加肿瘤细胞对纳米粒子的摄取，咪唑基团还具有溶酶体逃逸的特性，有助于增强纳米复合物的体内外抗肿瘤疗效，通过纳米粒的加速解散，提高药物在胞浆中的释放效率。

6、本发明复合物通过两亲性高分子材料泊洛沙姆F127“涂层”于MOF表层，既可增加载体的稳定性与生物相容性，又可增加纳米粒子在血液中的循环时间，提高声敏剂的摄取率，实现协同治疗。

7、皮肤光毒性主要是由于化学物质在紫外线照射下产生活性氧，对皮肤造成损伤。一些无机声敏剂如二氧化钛在紫外线照射下产生单线态氧(

附图说明

图1为实施例1制备的含有二硫键双端咪唑的有机单体(n＝3)的

图2为实施例1制备的含有二硫键双端咪唑的有机单体(n＝3)的质谱图谱与用单线态氧处理的刺激响应型RMOFss配体的质谱；其中，左图为含有二硫键双端咪唑的有机单体，右图为纳米复合物中的TiO

图3为本发明中超声与未超声的纳米复合物TiO

图4为本发明中纳米复合物TiO

图5为本发明中纳米复合物产生的

图6为本发明中TCEP对TiO2@RMOFss纳米载体和超声对TiO2@RMOFss粒径的影响图；

图7为本发明中纳米复合物TiO

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。

本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。

一种低皮肤光毒性的声动力治疗的纳米复合物，所述纳米复合物是使用含有二硫键的咪唑衍生物为有机配体，金属离子为螯合金属，二者形成纳米金属有机骨架，并包载声敏剂，金属有机骨架外层再进一步涂覆泊洛沙姆，所制备得到的。

较优地，所述含有二硫键的咪唑衍生物的结构如(I)所示：

其中，n＝2-4。

较优地，所述含有二硫键的咪唑衍生物的制备方法，包括如下步骤：

将二硫键双端羧基的结构(II)与N,N’-羰基二咪唑(III)溶解于有机溶剂三中，30℃搅拌反应4小时；纯化，向其中加入0.1M碳酸钠溶液洗涤2-5次，再加入超纯水洗涤2-5次，干燥，得到含有二硫键双端咪唑的有机单体(I)；

反应式:

其中，n＝2-4；

所述有机溶剂三为N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或二氯甲烷。

较优地，所述声敏剂为二氧化钛，其制备步骤如下：

①将无水乙醇、油酸和钛酸四丁酯混合后，在室温下搅拌5min；其中，无水乙醇：油酸：钛酸四丁酯的比例mL：mL：g为15：5：0.57；

②将①所述混合液转移至高压反应釜并放入油浴锅中，在180℃-200℃下反应4h；

③反应后，将高压反应釜取出，放入通风处冷却后，离心后洗涤得到二氧化钛纳米粒；

或者，所述金属离子为锌离子、锰离子或镍离子。

如上所述的低皮肤光毒性的声动力治疗的纳米复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)A液的配制：按比例，将含有二硫键的咪唑衍生物放入有机溶剂一中，搅拌至溶解，加入三乙胺搅拌均匀，加入被包载物，使含有二硫键的咪唑衍生物的终浓度为10-20mM，使三乙胺的终浓度为10-20mM，使被包载物的终浓度为0.2-0.4mM；

(2)B液的配制：将金属离子加入到有机溶剂二中，配成浓度为20-40mM的溶液；

(3)将1体积份B液倒入2体积份的A液中，搅拌，反应，有沉淀生成，10000g，离心10min，用有机溶剂二洗涤，10000g，离心10min，得到沉淀；

(4)将步骤(3)获得的沉淀分散于有机溶剂二中，配成浓度为1-5mg/mL的分散液；

(5)取步骤(4)获得的分散液，加入泊洛沙姆，分散液：泊洛沙姆的比例mL：mg为1-5：25-50，超声10-30min，超滤，取沉淀，加超纯水分散，冻干，得到纳米复合物。

较优地，所述被包载物为分散在四氢呋喃中的二氧化钛。

较优地，所述有机溶剂一为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇或乙醇。

较优地，所述有机溶剂二为N,N-二甲基甲酰胺，甲醇或者乙醇。

如上所述的纳米复合物在制备声动力治疗药物方面中的应用。

如上所述的纳米复合物在制备调控肿瘤细胞内氧化还原稳态药物方面中的应用。

具体地，相关的制备及检测如下：

实施例1

含有二硫键双端咪唑的有机单体(I-a)的制备方法，包括如下步骤:

准确称取4,4’-二硫代二丁酸0.3778g(1.585mmol)(II-a)，N,N’-羰基二咪唑(CDI)0.6333g(3.906mmol)(III)置于100mL圆底烧瓶中，将体系密封后抽真空、充氮气，使用针管注射器加入40mL无水二氯甲烷(DCM)后再次抽真空、充氮气，30℃搅拌反应4小时。反应结束后，使用旋转蒸发仪除去二氯甲烷及反应产生的CO

含有二硫键双端咪唑的有机单体(MOF Monomer)(I-a)，称重0.0.4906g(1.449mmol)，产率为91.46％。

使用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或者四氢呋喃(THF)代替本实施例的二氯甲烷(DCM)分别得到含有二硫键双端咪唑的有机单体(MOF Monomer)(I-a)。

采用二硫键双端羧基的结构(II，其中n＝2，或n＝4)替代本实施例的4,4’-二硫代二丁酸，其它同本实施例，可以制备出相应的含有二硫键双端咪唑的有机单体。

如图1所示，氢谱数据如下：

1HNMR(CDCl3-d6)δ(ppm)：8.19(s,2H)，7.47(d,2H),7.26(d,2H),3.06(t,4H),2.82(t,4H)，2.23(q,4H)。

实施例2

一种声敏剂二氧化钛的制备方法，包括如下步骤：

分别取15mL无水乙醇，5mL油酸和0.57g钛酸四丁酯加入至干燥的50mL锥形瓶中并在室温下搅拌5min。然后将此混合液转移至50mL高压反应釜并放入油浴锅中，在180℃下反应4h。4h后，将高压反应釜取出放入通风处冷却2h后，将深黄色液体平均置于4个EP管离心(10000r，10min)，随后将沉淀用无水乙醇洗两次去除多余油酸得到油酸修饰的二氧化钛(OA-TiO

实施例3

单线态氧(

称取5mg实施例1中制备的RMOF

其中，RMOF

准确称取4,4’-二硫代二丁酸0.3778g(1.585mmol)(II-a)，N,N’-羰基二咪唑(CDI)0.6333g(3.906mmol)(III)置于100mL圆底烧瓶中，将体系密封后抽真空、充氮气，使用针管注射器加入40mL无水二氯甲烷(DCM)后再次抽真空、充氮气，30℃搅拌反应4小时。反应结束后，使用旋转蒸发仪除去二氯甲烷及反应产生的CO

检测结果如图2所示，咪唑基可被氧化成醛和其他最终产物，从而可能与胺类化合物交联。化合物经Agilent6230TOF LC/MS质谱分析证实，化合物M1339.09(M1+H)的质荷比为340(如图2右图所示)。造成这种现象的原因可能是在酸性环境中加入了少量的乙酸，使峰的形状更加清晰，而咪唑则吸引了H原子。

实施例4

一种低皮肤光毒性的声动力学治疗的纳米复合物TiO

(1)A液的配制：称取MOF Monomer(I-a)50mg(0.148mmol)于20mL棕色玻璃小瓶中，加入10mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)搅拌至全部溶解后，加入20μL(0.148mmol)三乙胺搅拌均匀，加入3mL分散在四氢呋喃的二氧化钛溶液。

(2)B液的配制：将Zn(NO

(3)将B液倒入A液中，搅拌，反应，有沉淀生成，离心(10,000g,10min)，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤，离心，得到沉淀；

(4)将步骤(3)获得的沉淀(使用细胞破碎仪超声5min分散)分散于乙醇中，配成浓度为1mg/mL的分散液；

(5)取步骤(4)获得的分散液5mL，加入25mg泊洛沙姆F127，超声20min，用30,000Da的超滤离心管离心(4000g,5min)超滤，取沉淀，加3mL超纯水分散，冻干，得到低皮肤光毒性的声动力学治疗的纳米复合物。

实验证明，用四水合氯化锰或者六水合氯化镍代替本实施例的六水合硝酸锌，其它同本实施例，分别均可以获得具有稳定结构的纳米复合物。

实施例5

紫外光谱验证：

分别将尿素和纳米载体TiO

用紫外-可见(UV-Vis)分光光度计进一步证实了单线态氧在含尿素结构化合物生成中的作用，尿素和TiO

对照例1

一种无咪唑环的纳米复合物TiO

(1)A液的配制：称取4,4'-二硫代二丁酸(35.2mg,0.148mmol)于20mL棕色玻璃小瓶中，加入10mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)搅拌至全部溶解后加入20μL(0.148mmol)三乙胺搅拌均匀，加入3mL分散在四氢呋喃的二氧化钛溶液。

(2)B液的配制：将Zn(NO

(3)将B液倒入A液中，搅拌，反应，有沉淀生成，离心(10,000g,10min)，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤，离心，得到沉淀；

(4)将步骤(3)获得的沉淀(使用细胞破碎仪超声5min分散)分散于乙醇中，配成浓度为1mg/mL的分散液；

(5)取步骤(4)获得的分散液5mL，加入25mg泊洛沙姆F127，超声20min，用30,000Da的超滤离心管离心(4000g,5min)超滤，取沉淀，加3mL超纯水分散，冻干，得到无咪唑环的纳米复合物TiO

实施例6

ROS含量测定：

分别称量1mg两份样品(RMOF

ROS含量如图4所示。TiO

实施例7

单线态氧(

分别称量1mg两份样品(RMOF

如图5所示，超声处理后的TiO

实施例8

TCEP和超声对纳米载体粒径的影响：

1)TCEP

将纳米载体TiO2@RMOFss溶解于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 7.4,0.1M)配制成浓度为1mg/mL的溶液，分成两份，一份加入TCEP(10mM),另外一份不加入TCEP，测其在60min的粒径变化。

2)超声

将纳米载体TiO2@RMOFss溶解于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 7.4,0.1M)配制成浓度为1mg/mL的溶液，分成两份，一份进行超声(1MHz,1.5W/cm2,2min)，另外一份不超声，测其在30min的粒径变化。

如图6所示，TCEP处理后，TiO2@RMOFssnanoccarer出现了明显的尺寸膨胀。纳米载体的二硫键被还原剂TCEP还原为硫醇基团，它破坏了化学键，导致了载体的解体。TiO2@RMOFssnanoccarer在超声处理后也经历了尺寸膨胀，然后尺寸趋于稳定，超声空化效应和声孔效应可以使载体解体，但未经超声处理的TiO2@RMOFssnanoccarer的尺寸变化趋势很小。

实施例9

纳米复合物(实施例3、对照例1制备)对正常细胞光毒性的影响的实验，包括如下步骤：

称取纳米复合物TiO

细胞光毒性结果如图7所示。含咪唑的TiO

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。