胆固醇转运抑制剂U18666A作为增敏剂在制备抗肿瘤产品中的应用

摘要

本发明涉及胆固醇转运抑制剂U18666A作为增敏剂在制备抗肿瘤产品中的应用。本发明公开了一种GPNA与U18666A联合用药在抗肿瘤中的应用，U18666A提高了GPNA对肿瘤细胞的杀伤作用，提供克服GPNA抗肿瘤药效降低的新方法。具体包括：1.GPNA与U18666A联合用药具有更优的抗肿瘤效果；2.U18666A增加肿瘤细胞对谷氨酰胺限制的敏感性；3.GPNA与U18666A联用，可增强GPNA对肿瘤细胞增殖的抑制效果；4.GPNA与U18666A联合使用显著促进肿瘤细胞死亡。本发明与现有技术手段相比，具有更加显著的抗肿瘤作用。

说明书

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物技术领域，具体涉及胆固醇转运抑制剂U18666A作为增敏剂在制备抗肿瘤产品中的应用，及U18666A与GPNA的药物组合物在抗肿瘤产品中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

恶性肿瘤是当前人类健康的主要杀手，是严重威胁人类生命的最主要的疾病之一。快速生长的肿瘤代谢重编程，以产生充足的结构分子和能量。在正常细胞中，谷氨酰胺(Gln)是非必需氨基酸。然而，肿瘤细胞需要通过Gln代谢为自身增殖提供营养物质和能量来源，并帮助清除肿瘤细胞中积累的ROS，维持肿瘤细胞氧化还原稳态。因此，Gln是肿瘤的“必需氨基酸”。限制Gln是肿瘤治疗的潜在策略，肿瘤细胞通过代谢重塑可以逃避或降低Gln缺乏对肿瘤细胞造成的损害。GPNA(L-γ-Glutamyl-p-nitroanilide)是一种有效的Gln转运蛋白ASCT2(SLC1A5)的选择性抑制剂，可以显著地降低Gln的摄入。目前研究发现，单独使用GPNA无法达到高效抑制肿瘤生长的效果。

胆固醇代谢重塑对于肿瘤的发生发展至关重要。众多研究表明，胆固醇合成基因在肿瘤中高表达，下调这些关键基因能够明显抑制肿瘤生长。同时，多种抑制胆固醇合成的药物也显示抑制肿瘤的生长。然而，目前细胞内胆固醇转运药物对肿瘤细胞影响鲜有报道。U18666A是一种胞内胆固醇转运的抑制剂，报道表明其对病毒的感染和传播具有显著的抑制效果，并且能够引起肿瘤细胞坏死。在此药物的基础上，联合其它抗肿瘤药物具有潜在的应用前景。

发明人认为，针对Gln转运蛋白抑制剂的肿瘤治疗效果不足，开发相应的增敏剂，提供一种包含Gln转运蛋白抑制剂的联合用药策略，有望实现肿瘤增殖的有效抑制。

发明内容

现有研究证实，U18666A可以抑制晚期内体和溶酶体释放胆固醇，对细胞内胆固醇转运途径具有显著的影响。基于U18666A对胆固醇转运的抑制作用，现有技术还模拟了功能性Niemann-Pick C型蛋白的丧失，提供了相应的疾病模型。U18666A随后成为评估在其他情况(如动脉粥样硬化，阿尔茨海默氏病和病毒感染)中通过溶酶体途径进行分子运输的重要性的工具。由于U18666A可以通过抑制胆固醇合成和细胞内转运来限制胆固醇在膜形成，广泛影响机体中多种过程的机制。但目前针对U18666A抗肿瘤的应用尚缺乏相关报道。本发明将U18666A在体外单独用于肿瘤细胞，发现其抑制肿瘤增殖的效果不明显。

GPNA是一种Gln转运蛋白抑制剂，现有研究证实GPNA能够促进胰腺癌细胞凋亡以及改善乳腺癌他莫昔芬耐药等。本发明尝试将U18666A与GPNA联合用于肿瘤细胞培养和体内小鼠肿瘤模型，研究表明上述两化合物联合后对肿瘤细胞的抑制作用显著提升，上述研究结果表明，U18666A有望作为一种增敏剂提升Gln转运蛋白抑制剂的抗肿瘤效果。

基于本发明的研究成果，本发明首先提供胆固醇转运抑制剂U18666A作为增敏剂在制备抗肿瘤产品中的应用。

其次，本发明还提供了一种GPNA与U18666A联合用药的治疗新策略，具体提供了一种药物组合物的形式，有效抑制肿瘤细胞增殖，并促进肿瘤细胞死亡。

基于上述药物组合物，本发明还相应的提供其抗肿瘤应用，特别是在抗肝癌方面的应用。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

本发明的一个实施方式中，提供U18666A作为增敏剂在抗肿瘤方面的应用，进一步提供了GPNA与U18666A组合物形式，该药物组合的肿瘤抑制效果具有显著提升，有望为临床用药提供一种成本简单、同时疗效显著的用药方式。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为GPNA与U18666A体外联合用药结晶紫染色图；

图2为GPNA与U18666A体外联合用药结晶紫染色统计图；

图3为GPNA与U18666A体外联合用药PI荧光图；

图4为GPNA与U18666A体外联合用药PI阳性统计图；

图5为GPNA与U18666A体内联合用药肿瘤体积变化图；

图6为GPNA与U18666A体内联合用药Ki67组化图；

图7为GPNA与U18666A体内联合用药Ki67组化统计图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，Gln转运蛋白ASCT2(SLC1A5)的选择性抑制剂可以通过降低细胞中Gln的摄入实现抑制肿瘤细胞生长的作用，但是上述抑制剂单独应用效果并不理想。为了解决如上的技术问题，本发明提供了U18666A作为GPNA增敏剂的应用，将其作为药物组合能够取得更好的抗肿瘤效果。

本发明第一方面，提供一种胆固醇转运抑制剂U18666A作为增敏剂在制备抗肿瘤产品中的应用。

上述第一方面所述U18666A结构式为C

本发明第二方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物中，至少包括一种胆固醇转运抑制剂及一种Gln转运蛋白抑制剂。

第二方面所述药物组合物的一种实施方式中，所述胆固醇转运抑制剂为U18666A，所述Gln转运蛋白抑制剂为GPNA。上述实施方式中，两种化合物的比例可依据本领域常规研究确定，可行的方式如MTT等。本发明提供的一种可行的方式中，所述GPNA与U18666A质量比为20：1～5；进一步的，所述质量为20：2～3；具体的质量比如20：2或20：2.5或20：3。

第二方面所述药物组合物的剂型没有特别限制，可行的制剂形式包括固体制剂(片剂，胶囊剂，颗粒剂，粉剂等)，液体制剂(糖浆剂，注射剂等)等；另外，本发明所述药物组合物中，还包括药学上可接受的载体，作为载体，可以使用通常用作药物材料的各种有机或无机载体物质。

上述固体制剂中可行的载体包括赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等；

在液体制剂中，所述载体包括增溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂、舒缓剂。适当地，还可能包括防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂和其他制剂添加剂。

本发明第三方面，提供第二方面所述药物组合物在制备抗肿瘤产品中的应用。

所述应用的方式为包括但不限于以下任意一种：

(1)将上述药物组合物应用于治疗预防/治疗肿瘤的药物、保健品或特殊医用食品等；

(2)上述药物组合物作为一种模型药剂，所述模型药剂用于制备肿瘤生长抑制模型等。

本发明第四方面，提供一种抗肿瘤药物，所述药物中，第一方面所述药物组合物作为活性成分。

上述第四方面所述抗肿瘤药物的一种实施方式中，所述药物组合物作为唯一活性成分，该实施方式中，所述抗肿瘤药物由药物组合物及药物载体组成。

另外的一种实施方式中，所述抗肿瘤药物中，除第二方面所述药物组合物外，还具有其他活性成分；所述其他活性成分为包括但不限于细胞毒类药物、核酸合成、转录抑制剂、激素类药物、单克隆抗体、干扰素或生物反应调节剂等。

所述肿瘤为包括但不限于脑肿瘤、口腔肿瘤、肺癌、胃癌、肝癌、肠道癌症、子宫肿瘤、骨肉瘤或胶质瘤中的一种；本发明验证的一种可行的实施方式中，所述抗肿瘤药物为一种抗肝癌的药物。

本发明第五方面，提供一种肿瘤治疗方法，所述肿瘤治疗方法包括向有需要的个体施用第二方面所述药物组合物、或第四方面所述抗肿瘤药物。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

以下实施例中涉及的细胞株及动物如下：

人肝癌细胞株HepG2购于上海中科院细胞所；小鼠肝癌细胞H22购于山东医学研究所；SPF级BALB/c-nu裸鼠，雌鼠，10只，6-8周龄，体重18-20g，北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证编码为SCXK(京)2016-0006，饲养于山东大学实验动物中心，小鼠适应环境一周后即进行成瘤实验，实验单位使用许可证编码为SYXK(鲁)2019 0005。

以下实施例中涉及药物及主要试剂如下：

GPNA：selleck公司

U18666A：MCE公司

优质胎牛血清(FBS)、DMEM培养基和胰酶：Thermo公司

Rabbit anti-Ki67 antibody：Abcam

Goat anti-Rabbit IgG(H+L)HRP：Abways

组化笔和DAB显色液：中杉金桥

苏木素：生工生物工程(上海)股份有限公司

结晶紫试剂：sigma公司

碘化丙啶Propidium iodide(PI)：碧云天

以下实施例中涉及的主要仪器如下：

移液器：Eppendorf公司

医用离心机，购于山东百欧医疗科技有限公司

二氧化碳细胞培养箱：Panasonic公司

生物安全柜：Thermo公司

倒置荧光显微镜：Olympus公司

恒温水浴锅：精宏公司

石蜡切片机：Thermo公司

实施例1

1、细胞培养

将人肝细胞癌HepG2细胞株培养在含有100U/mL链霉素、100U/mL青霉素和10％牛血清的DMEM培养基中，置于5％CO

2、细胞结晶紫染色实验

HepG2细胞按1ⅹ10

3、药物对细胞增殖的影响

从图1和图2可以看出，相比较于对照组，0.5mM GPNA处理具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，抑制效果为25％，1μM U18666A基本不影响肿瘤细胞的增殖过程，二者药物的联合使用显著抑制了肿瘤细胞的增殖，抑制效率约为0.5mM GPNA单独处理的2.7倍。

4、细胞PI染色实验

HepG2细胞按1ⅹ10

5、药物对细胞死亡的影响

从图3和图4可以看出，细胞总数的变化同图1和图2的结果一致。此外，0.5mM GPNA处理与对照组相比具有促进肿瘤细胞死亡的作用，GPNA处理组PI阳性率比对照组高出12倍；与此同时，1μM U18666A处理对肿瘤细胞的毒性较低，对细胞增殖和死亡无显著影响；当0.5mM GPNA与1μM U18666A联合使用时，肿瘤细胞死亡率为对照组的33倍，较0.5mM GPNA单独处理组高出近21倍，说明U18666A显著增强了GPNA的抑制肿瘤效果。因此，1μM U18666A与0.5mM GPNA联合用药是一项更优的抗肿瘤策略。

实施例2

1、动物模型建立及分组

H22细胞于小鼠腹水复苏，在无菌的条件下，分别取0.1mL/5x10

其中，不同给药组的给药方式及途径如表1所示，空白对照组给予等量的PBS。

表1不同实验组给药方式及途径

注：i.p.：intraperitoneal injection，腹腔注射；qd：quadue die,一天一次

2、肿瘤体积测定

用游标卡尺测量各组动物瘤结节的长径(L)和短径(W)，按椭圆形体积公式(V＝L*W2/2)计算肿瘤体积并求各组平均值，比较各组肿瘤体积相对增殖速率，相对增殖速率＝Day n/Day1。

3、药物对肿瘤体积的影响

制备H22皮下瘤模型之后，分别采取GPNA单独用药、U18666A单独用药和GPNA与U18666A联合用药测定肿瘤体积。如图5显示，U18666A单独处理与对照组相比肿瘤生长减缓，但并无统计学意义；GPNA单独处理与对照相比明显抑制肿瘤生长；GPNA与U18666A联合使用与对照或任意单独用药相比都能显著抑制肿瘤生长，特别强调的是U188666A的使用显著提高GPNA抑制肿瘤的效率。因此，上述结果表明U18666A提高肿瘤组织对谷氨酰胺限制的敏感性。

4、组织包埋与石蜡切片的准备

(1)将需要包埋的组织放入含有4％多聚甲醛的5mL离心管中，固定24h；

(2)取出组织放入包埋盒中，移至脱水机中，按表2所示程序进行脱水硬化；

表2脱水硬化程序

(3)完成以上步骤后，将组织放在包埋用的铁盒中并浸入融化的石蜡，上面覆盖包埋盒，放置冰上待其凝固。

(4)待组织蜡块凝固后，将其从铁盒中取下，固定在石蜡切片机上，安装刀片后以20μm的厚度修饰组织蜡块直至组织暴露，随后切下3μm厚度的带有组织的蜡片，置于45℃水中，待其舒展后用载玻片将其轻轻捞起，使其平整的覆盖在载玻片上，随后置于65℃烤架上烘烤2h后收于玻片盒中，以便后续实验使用。

5、石蜡切片的免疫组化染色

肿瘤组织切片放置于65℃烘箱中烘烤2h；

梯度脱蜡水化：

二甲苯(2次，15min/次)；100％乙醇(2次，5min/次)；90％乙醇(1次，5min/次)；70％乙醇(1次，5min/次)；蒸馏水(1次，5min/次)；

使用EDTA抗原修复液进行抗原修复(EDTA抗原修复液原液：蒸馏水＝1:50)；

取600mL抗原修复液于1000mL玻璃烧杯中，放入玻片架，置于微波炉，高火加热8min至液体沸腾，随后改为中高火持续加热10min，加热完毕后将烧杯取出于通风橱冷却至室温。

将切片放置湿盒中，用组化笔将组织圈出，滴加一定比例稀释好的一抗溶液，室温孵育2h。

在摇床上用1XPBST溶液(含有0.1％Tween 20)漂洗3次，每次5min。

滴加一定比例稀释好的二抗溶液，室温孵育30min。

1XPBST漂洗3次，每次5min。

按照B液：C液＝50:1的比例配置DAB显色液，滴加到组织上，在镜下发现阳性染色即可放入自来水中终止染色，同一组织切片的DAB染色时间保持一致。

苏木素染色2-5min，自来水终止染色。

1％盐酸酒精漂洗1s，自来水终止。

梯度酒精洗脱：70％乙醇(5min)，90％乙醇(5min)，100％乙醇(5min)，二甲苯(10min)。

将染好的切片晾干后，滴加中性树胶，盖玻片封片。

6、药物抑制肿瘤细胞的增殖

结合图6和图7，通过对肿瘤组织进行Ki67组化染色发现，未经药物处理组的肿瘤组织中Ki67阳性率较高，GPNA处理后Ki67阳性率降低，U18666A单独用药对肿瘤增殖的抑制作用效果不显著，但与GPNA联合用药可以显著减少Ki67阳性率，表明U18666A可以显著增强肿瘤对GPNA药物的敏感性，提示GPNA与U18666A联合用药是一项更优的体内抗肿瘤策略。

7、统计学分析

应用GraphPrism软件进行统计学处理，计量资料以mean±SD表示，两组以上数据比较采取单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间比较采用t检验，pvalue style为GP:0.1234(ns),0.0332(*),0.0021(**),0.0002(***),<0.0001(****)。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。