作为有效成分包含利用熔岩海水栽培的积雪草的皮肤微生物组平衡以及痤疮改善用组合物

摘要

本发明涉及一种作为有效成分包含利用熔岩海水栽培的积雪草(Centella asiatica)提取物的皮肤微生物组平衡以及痤疮改善用组合物及其用途。适用本发明的积雪草提取物可以通过利用脱盐熔岩海水进行栽培而避免呈现出细胞毒性，而且还可以对细胞内的NO生成进行抑制并呈现出抗炎症活性，还具有痤疮皮肤改善乃至于皮肤微生物组平衡改善效果，因此可以有效地作为皮肤微生物组平衡改善用组合物进行使用。尤其是，上述组合物可以通过追加包含芍药提取物而进一步增强皮肤微生物组平衡改善效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种作为有效成分包含利用熔岩海水栽培的积雪草(Centellaasiatica)提取物的皮肤微生物组平衡以及痤疮改善用组合物及其用途。

背景技术

最近，因为如遗传因素、环境因素、皮肤屏障异常、免疫学异常或饮食生活变化等诸多复杂因素，皮肤疾病的患病率正在急剧增加。在诸多皮肤疾病中，痤疮是因为如毛囊壁的角化过度、皮质分泌的增加或发炎等复合因素而导致的疾病。

导致痤疮的主要原因之一在于皮肤常在菌。诱发皮肤炎症的皮肤常在菌，包括术语革兰氏阳性菌的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)和属于格兰仕阴性菌的大肠杆菌(Escherichia coli)或绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等。其中，痤疮诱发菌即痤疮丙酸杆菌(P.acnes)主要在有大量的毛囊以及皮脂腺分布的脸部以及胸部等处生长，当皮脂滞留在毛囊的皮脂腺内部时毛囊的入口将被堵塞，从而在毛囊内部因为痤疮菌的作用而引起痤疮。

可以被称之为皮肤常在菌的皮肤微生物组，是一种同时包括存在于皮肤表面的有益菌以及有害菌的概念。为了皮肤的健康，维护皮肤微生物组的平衡至关重要，而上述平衡很可能会因为如老化、紫外线、微细粉尘、荷尔蒙、膳食结构等各种生活习惯乃至环境因素而遭到破坏。当平衡变得不稳定时，可能会导致皮肤干燥并因为营养不良而造成皮肤的浮肿，而且可能会因为皮肤免疫力的下降而造成从外部入侵的有害微生物的增殖乃至于如痤疮等皮肤问题。

积雪草(Centella asiatica)是一种主要分布在南亚地区的多年生匍匐性药用植物，在韩国则主要分布在济州岛以及中南部地区的低湿区域。主干向侧向延伸且在每个生根的节上都会生长出2个退化的鳞状叶片，叶片为肾形且集中生长在节上，直径约为2至5cm，表面有光泽，边缘部分有钝锯齿，叶茎长度为4至20cm。积雪草长久以来用于对慢性溃疡等进行治疗，而且还有报告指出对类风湿性关节炎等也有治疗效果。

大韩民国注册专利第10-2119825号涉及一种包含糙米、绿茶以及蒲公英发酵提取物的皮肤内微生物组平衡维持用化妆品组合物及其制造方法，公开了一种可以通过包含糙米、绿茶以及蒲公英发酵提取物而促生皮肤内的有益菌并抑制有害菌的化妆品组合物。

但是，目前为止并没有公开是否可以利用积雪草提取物维持皮肤微生物组的均衡而不是单纯地抑制皮肤内的有害菌并促生有益菌的相关研究乃至文献记载。

发明内容

本申请人为了开发出可以在包含天然提取物的同时改善皮肤微生物组的组合物，通过不断的努力发现当包含积雪草提取物时，可以通过对皮肤内微生物组的均衡进行调节而有效地改善皮肤微生物组乃至痤疮皮肤，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的在于提供一种作为有效成分包含利用脱盐熔岩海水栽培的积雪草(Centella asiatica)提取物的皮肤微生物组平衡以及痤疮改善用组合物及其用途。

本发明提供一种痤疮改善用化妆品组合物，其特征在于：作为有效成分包含利用脱盐熔岩海水栽培的积雪草(Centella asiatica)提取物，通过减少皮肤有害菌群的分布度而维持皮肤微生物组的平衡，其中上述皮肤有害菌为痤疮丙酸杆菌属(Cutibacteriumacnes group)以及金黃葡萄球菌属(Staphylococcus aureus group)。

在适用本发明的较佳一实施例中，上述积雪草提取物可以利用水、有机溶剂或上述之混合物作为溶剂进行提取。

在适用本发明的较佳一实施例中，上述组合物可以追加包含芍药(Paeonialactiflora)提取物。

在适用本发明的较佳一实施例中，上述组合物可以通过对因为皮肤有害菌而导致的炎症性刺激进行缓解而呈现出抗炎症效果。

在适用本发明的较佳一实施例中，上述对炎症性刺激的缓解，可以是通过从由NO生成抑制活性、细胞因子白细胞介素-8(IL-8)生成抑制活性以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生成抑制活性构成的组中选择的任一种以上的抑制活性实现。

在适用本发明的较佳一实施例中，上述组合物可以在通过从由

(a)研究者总体评分(Investigator's Global Assessment，IGA)；在根据病变(粉刺、丘疹、脓疱、结节)数量评级之后进行肉眼评估；

(b)麦克尔森氏痤疮严重程度指数(Michaelson's Acne Severity Index，ASI)；对病变(粉刺、丘疹、脓疱、结节)的数量进行测定并以体现痤疮严重程度的方式进行计算的指标；

(c)炎症性以及非炎症性病变相对于基值的比例；

构成的组中选择的任一种以上进行评估时呈现出统计学意义上的痤疮改善效果。

在适用本发明的较佳一实施例中，上述评估可以是对使用上述组合物之前以及使用上述组合物之后的2周后至8周后进行比较。

本发明还可以提供一种痤疮改善用健康功能食品组合物，其特征在于：作为有效成分包含利用脱盐熔岩海水栽培的积雪草(Centella asiatica)提取物，通过减少皮肤有害菌群的分布度而维持皮肤微生物组的平衡，其中上述皮肤有害菌为痤疮丙酸杆菌属(Cutibacterium acnes group)以及金黃葡萄球菌属(Staphylococcus aureus group)。

本发明还可以提供一种痤疮改善用宠物用品组合物，其特征在于：作为有效成分包含利用脱盐熔岩海水栽培的积雪草(Centella asiatica)提取物，通过减少皮肤有害菌群的分布度而维持皮肤微生物组的平衡，其中上述皮肤有害菌为痤疮丙酸杆菌属(Cutibacterium acnes group)以及金黃葡萄球菌属(Staphylococcus aureus group)。

适用本发明的积雪草提取物可以通过利用脱盐熔岩海水进行栽培而避免呈现出细胞毒性，而且还可以对细胞内的NO生成进行抑制并呈现出抗炎症活性，还具有痤疮皮肤改善乃至于皮肤微生物组平衡改善效果，因此可以有效地作为皮肤微生物组平衡以及痤疮改善用组合物进行使用。尤其是，上述组合物可以通过追加包含芍药提取物而进一步增强皮肤微生物组平衡以及痤疮改善效果。

附图说明

图1是适用本发明的芍药提取物对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(Raw264.7)的细胞毒性评估结果。

图2是适用本发明的积雪草提取物对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(Raw264.7)的细胞毒性评估结果。

图3是适用本发明的芍药提取物对人永生化角质形成细胞(HaCaT)的细胞毒性评估结果。

图4是适用本发明的积雪草提取物人永生化角质形成细胞(HaCaT)的细胞毒性评估结果。

图5对适用本发明的积雪草提取物的NO生成抑制活性进行了图示。

图6对适用本发明的芍药提取物的NO生成抑制活性进行了图示。

图7对适用本发明的芍药提取物在脂多糖(LPS)刺激下的白细胞介素-8(IL-8)生成抑制活性进行了图示。

图8对适用本发明的积雪草提取物在脂多糖(LPS)刺激下的白细胞介素-8(IL-8)生成抑制活性进行了图示。

图9对适用本发明的芍药提取物在痤疮丙酸杆菌(P.acne)刺激下的白细胞介素-8(IL-8)生成抑制活性进行了图示。

图10对适用本发明的积雪草提取物在痤疮丙酸杆菌(P.acne)刺激下的白细胞介素-8(IL-8)生成抑制活性进行了图示。

图11对适用本发明的芍药提取物在脂多糖(LPS)刺激下的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生成抑制活性进行了图示。

图12对适用本发明的积雪草提取物在脂多糖(LPS)刺激下的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生成抑制活性进行了图示。

图13对适用本发明的芍药提取物在痤疮丙酸杆菌(P.acne)刺激下的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生成抑制活性进行了图示。

图14对适用本发明的积雪草提取物在痤疮丙酸杆菌(P.acne)刺激下的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生成抑制活性进行了图示。

图15对在使用适用本发明的包含积雪草提取物的化妆品组合物(泡沫洁面乳)之前(第0周)的试验对象皮肤试料的微生物菌群分析结果进行了图示。

图16对在使用适用本发明的包含积雪草提取物的化妆品组合物(泡沫洁面乳)之后第8周的试验对象皮肤试料的微生物菌群分析结果进行了图示。

具体实施方式

如上所述，为了改善痤疮等皮肤疾病，维持皮肤微生物组的平衡至关重要。已经确认在包含适用本发明的利用脱盐熔岩海水栽培的积雪草提取物的情况下可以通过对皮肤内微生物菌群的均衡进行调节而有效地改善皮肤微生物组，从而完成了本发明。本申请人已经通过试验确认，适用本发明的利用脱盐熔岩海水栽培的积雪草提取物与利用一般水(淡水)栽培的积雪草提取物相比不会呈现出细胞毒性(试验例1)，可以对细胞内NO生成进行抑制(试验例2)并呈现出抗炎症活性(试验例3)，还具有痤疮皮肤改善(试验例4)乃至于皮肤微生物组平衡改善效果(试验例5)。上述结果表明，适用本发明的组合物不只是单纯地减少皮肤有害菌并增加皮肤有益菌，还可以进一步改善存在于皮肤上的微生物菌群的平衡并改善痤疮。此外，上述皮肤微生物组改善效果可以在追加包含适用本发明的利用脱盐熔岩海水栽培的芍药提取物时得到进一步增强。

接下来，将对本发明进行更为详细的说明。

在本发明中，“利用脱盐熔岩海水栽培的积雪草”是指在栽培的过程中供应脱盐熔岩海水并通过露地栽培而收获的积雪草。脱盐熔岩海水的供应周期可以是1天至5天，较佳地可以是1天至3天，此外其栽培期间可以是以播种时期为基准或以在播种后生长1～2天之后的幼苗的移植时期为基准的15天至30天，较佳地可以是20天至30天。作为脱盐熔岩海水的供应方式，可以以洒水方式或喷雾方式进行供应。在栽培时，可以将适当的肥料与脱盐熔岩海水一起进行供应。

在本发明中，“利用脱盐熔岩海水栽培的芍药”与上述利用脱盐熔岩海水栽培的积雪草相同，是指在栽培的过程中供应脱盐熔岩海水并通过露地栽培而收获的芍药。脱盐熔岩海水的供应周期、栽培期间以及脱盐熔岩海水的供应方式与上述利用脱盐熔岩海水栽培的积雪草的相关说明相同。

在本发明中，“熔岩海水”是与在发明的名称为“矿物质组合物的制造方法以及利用上述方法获得的矿物质组合物”的韩国专利第0853244号(申请编号：第10-2008-0027861号)中做出定义以及说明的“存在于济州岛东部地区的含盐地下水”相同的含义。具体来讲，“济州岛东部地区”是指行政区划上的济州岛旧左邑、城山邑以及表善面，“含盐地下水”是指含有一定量以上的盐分的地下水，具体来讲，可以理解为是同时包含按照在Go-GiWon等的论文(Go-GiWon等，对济州岛东部地区水文地质的研究(Ⅱ2003，暻园大学；被视为本说明书的一部分))中所使用的基于盐分浓度的济州岛地下水分类标准分类的低盐地下水(电导度为1,700μs/cm～17,350μs/cm)以及盐水地下水(电导度为17,350μs/cm以上)的含义，较佳地可以是电导度为17,350μs/cm以上或盐浓度为30‰以上(一般海水的盐分浓度为32至35‰)的盐水地下水。

在本发明中，“脱盐熔岩海水”是指通过对熔岩海水进行脱盐而获得的结果物。脱盐熔岩海水可以理解为是去除盐分之后的矿物质水。熔岩海水的脱盐可以通过适用本行业所公知的任意技术执行，而作为如上所述的技术，可以以反渗透法、离子交换树脂法以及电渗析法等为例。

在本发明中，“微生物组(microbiome)”是微生物菌群(microbiota)与基因组(genome)的复合词，是指在人类、动植物、土壤、大海、湖泊、岩壁以及大气等中共存的所有微生物菌群以及基因组。其中，皮肤内微生物组是指存在于皮肤内部的微生物与微生物之间、宿主与微生物之间的复杂的相互关系的微生物组，是人类微生物组的一部分。

上述“皮肤微生物组平衡改善”是指通过促进皮肤内有益菌的增殖并抑制皮肤内有害菌的增殖，进而通过维持皮肤内微生物菌群的平衡并改善其皮肤环境而避免发生如痤疮等皮肤疾病。

在本发明中，“促生皮肤有益菌”是指在每2cm2的皮肤中有约1000种类型的200万个以上的微生物存在，而通过促进其中的皮肤内有益菌的繁殖以及活性而维持皮肤内微生物的平衡。

在本发明中，“抑制皮肤有害菌”是指通过对皮肤内有害菌的增殖进行抑制或将有害菌灭活而维持皮肤内微生物的平衡。

本发明可以提供一种痤疮改善用化妆品组合物，其特征在于：作为有效成分包含利用脱盐熔岩海水栽培的积雪草(Centella asiatica)提取物，通过减少皮肤有害菌群的分布度而维持皮肤微生物组的平衡，其中上述皮肤有害菌为痤疮丙酸杆菌属(Cutibacterium acnes group)以及金黃葡萄球菌属(Staphylococcus aureus group)。

上述积雪草提取物可以利用从由积雪草的叶、茎、花、果实、根茎以及整株构成的组中选择的任一个以上的部位进行提取。较佳地，上述积雪草提取物可以利用积雪草的整株进行提取。

在适用本发明的较佳一实施例中，上述积雪草提取物可以利用水、有机溶剂或上述之混合物作为溶剂进行提取。较佳地，使用水、C1至C4的低级醇或上述之混合物为宜，更较佳地，使用水、甲醇、乙醇、丙醇或上述之混合物为宜，最较佳地，使用1～100％的乙醇作为溶剂为宜。

上述“改善”，是指通过适用本发明的积雪草提取物使得与皮肤微生物组平衡乃至痤疮相关的参量，例如平衡乃至痤疮得到好转或症状得到缓解或或向有利的方向发展。

在适用本发明的较佳一实施例中，上述组合物可以追加包含芍药(Paeonialactiflora)提取物。

在适用本发明的较佳一实施例中，上述芍药提取物可以利用从由芍药的叶、茎、花、果实、根茎以及整株构成的组中选择的任一个以上的部位进行提取。较佳地，上述芍药提取物可以利用芍药的整株进行提取。

在适用本发明的较佳一实施例中，上述芍药提取物可以利用水、有机溶剂或上述之混合物作为溶剂进行提取。较佳地，使用水、C1至C4的低级醇或上述之混合物为宜，更较佳地，使用水、甲醇、乙醇、丙醇或上述之混合物为宜，最较佳地，使用1～100％的乙醇作为溶剂为宜。

在适用本发明的较佳一实施例中，上述组合物可以通过对因为皮肤有害菌而导致的炎症性刺激进行缓解而呈现出抗炎症效果。

在适用本发明的较佳一实施例中，上述对炎症性刺激的缓解，可以是通过从由NO生成抑制活性、细胞因子白细胞介素-8(IL-8)生成抑制活性以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生成抑制活性构成的组中选择的任一种以上的抑制活性实现。

在适用本发明的较佳一实施例中，上述组合物可以在通过从由

(a)研究者总体评分(Investigator's Global Assessment，IGA)；在根据病变(粉刺、丘疹、脓疱、结节)数量评级之后进行肉眼评估；

(b)麦克尔森氏痤疮严重程度指数(Michaelson's Acne Severity Index，ASI)；对病变(粉刺、丘疹、脓疱、结节)的数量进行测定并以体现痤疮严重程度的方式进行计算的指标；

(c)炎症性以及非炎症性病变相对于基值的比例；

构成的组中选择的任一种以上进行评估时呈现出统计学意义上的痤疮改善效果。

在适用本发明的较佳一实施例中，上述评估可以是通过对使用上述组合物之前以及使用上述组合物之后的2周后至8周后进行比较的方式执行。

适用本发明的化妆品组合物作为有效成分包含积雪草提取物，可以与皮肤学上可容许的赋形剂一起制造成如基础化妆品组合物(化妆水、皮肤保护剂、乳霜、精华、如泡沫洁面乳以及洁肤水等洁面乳、面膜、身体油、全身沐浴露)、彩妆组合物(粉底、口红、睫毛膏、妆前底霜)、护发品组合物(洗发水、护发素、头皮清洁剂、护发乳、发胶)以及香皂等形态。

上述赋形剂并不受到特殊的限定，例如可以包含皮肤软化剂、皮肤渗透增强剂、着色剂、芳香剂、乳化剂、浓稠剂以及溶剂。此外，还可以追加包含如香料、色素、杀菌剂、防氧化剂、防腐剂以及保湿剂等，还可以包含用于改善物性的如增稠剂、无机盐类以及合成高分子物质等。例如，在利用适用本发明的化妆品组合物制造洁面乳以及香皂时，可以通过在一般的洁面乳以及香皂基质中添加上述积雪草提取物的方式轻易地进行制造。而在制造乳霜时，可以通过在一般的水包油型(O/W)乳霜基质中添加积雪草提取物的方式进行制造。其中，还可以添加香料、螯合剂、色素、防氧化剂和防腐剂等以及用于改善物性的如蛋白质、矿物质以及维生素等合成或天然材料。

适用本发明的化妆品组合物中所包含的积雪草提取物的含量并不受到特殊的限定，较佳地可以相对于整体组合物的总重量包含0.001至10重量％，更较佳地可以包含0.01至5重量％。在上述含量不足0.001重量％的情况下，可能无法达成所需要的皮肤微生物组平衡改善效果，而在超过10重量％的情况下，可能会导致稳定性较差或剂型制造困难的问题。

本发明还可以提供一种痤疮改善用健康功能食品组合物，其特征在于：作为有效成分包含利用脱盐熔岩海水栽培的积雪草(Centella asiatica)提取物，通过减少皮肤有害菌群的分布度而维持皮肤微生物组的平衡，其中上述皮肤有害菌为痤疮丙酸杆菌属(Cutibacterium acnes group)以及金黃葡萄球菌属(Staphylococcus aureus group)。

适用本发明的健康功能食品组合物可以通过本行业所公知的一般的方法制造成多种形态。作为一般食品并不受到特殊的限定，可以通过向饮料(包括酒精类饮料)、果实及其加工食品(例如：水果罐头、瓶装罐头、果酱以及橘子酱等)、鱼类和肉类及其加工食品(例如：火腿肠、腌制牛肉等)、面包类以及面类(例如：乌冬面、荞麦面、拉面、意大利面以及通心粉等)、果汁、各种饮料、饼干、饴糖、乳制品(例如：黄油、奶酪等)、食用植物油脂、人造黄油、植物性蛋白、蒸煮食品、冷冻食品、各种调味料(例如：大酱、酱油以及沙司等)等中添加适用本发明的积雪草提取物的方式进行制造。此外，作为营养辅助剂并不受到特殊的限定，可以通过向胶囊、片剂以及丸剂等中添加适用本发明的积雪草提取物的方式进行制造。此外，作为健康功能食品并不受到特殊的限定，例如，可以为了将适用本发明的积雪草提取物本身制造成茶、果汁以及饮料的形态进行饮用(健康饮料)而对其进行液态化、颗粒化、胶囊化以及粉末化之后进行摄取。此外，可以为了将适用本发明的积雪草提取物以食品添加的形态使用而制造成粉末或浓缩液的形态进行使用。此外，可以通过将适用本发明的积雪草提取物与目前已公知的具有皮肤微生物组平衡乃至痤疮改善效果的活性成分一起进行混合而制造成组合物的形态。

在将适用本发明的积雪草提取物作为健康饮料使用时，上述健康饮料组合物与一般的饮料相同，可以作为追加成分包含各种香味剂以及天然碳水化合物等。上述的天然碳水化合物，可以是如葡萄糖以及果糖等单糖；如麦芽糖以及这趟等二糖；如糊精以及环糊精等聚糖；如木糖醇、山梨糖醇以及赤藓糖醇等糖醇。作为甜味剂，可以使用如索马甜以及甜叶菊提取物等天然甜味剂；如糖精以及阿斯巴甜等合成甜味剂等。作为上述天然碳水化合物的比例，在每100mL的适用本发明的组合物中通常可以包含约0.01～0.04g，较佳地可以包含约0.02～0.03g。

此外，适用本发明的积雪草提取物可以作为皮肤微生物组平衡乃至痤疮改善用健康功能食品组合物的有效成分进行使用，其含量并不受到特殊的限定，可以是达成皮肤微生物组平衡乃至痤疮改善作用所需的有效含量，相对于整体组合物的总重量包含0.01至100重量％为宜。适用本发明的健康功能食品组合物可以通过将积雪草提取物与目前已知的具有皮肤微生物组平衡乃至痤疮改善效果的其他活性成分一起混合的方式进行制造。

除了如上所述的成分之外，适用本发明的健康功能食品还可以包含多种营养剂、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸、果胶盐、海藻酸、海藻酸盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定化剂、防腐剂、甘油、乙醇或碳酸化剂等。此外，适用本发明的健康功能食品还可以包含用于制造天然果汁、果汁饮料或蔬菜饮料的果肉。如上所述的成分可以独立或混合使用。如上所述的添加剂的比例并不特别重要，通常是在每100重量份的适用本发明的组合物包含0.01～0.1重量份的范围之内进行选择。

本发明还可以提供一种痤疮改善用宠物用品组合物，其特征在于：作为有效成分包含利用脱盐熔岩海水栽培的积雪草(Centella asiatica)提取物，通过减少皮肤有害菌群的分布度而维持皮肤微生物组的平衡，其中上述皮肤有害菌为痤疮丙酸杆菌属(Cutibacterium acnes group)以及金黃葡萄球菌属(Staphylococcus aureus group)。

适用本发明的宠物用品是包含宠物所需要的所有用品的含义，较佳地可以是以宠物为对象的化妆品组合物或健康功能食品组合物的含义。与上述化妆品组合物或健康功能食品组合物相关的说明，请参阅上述的内容。

接下来，将参阅实施例对本发明进行更为详细的说明。下述实施例只是用于对本发明进行例示，具有相关技术领域之一般知识的人员应该可以理解，本发明的范围并不因为下述实施例而受到限定。

【实施例1】

积雪草提取物以及芍药提取物的制造

在将积雪草(Centella asiatica)幼苗(JOYPLANT，幼苗长度为100～120mm)或芍药(Paeonia lactiflora)幼苗(锦山苗木农业园，幼苗长度为70～90mm)移植到铺设有混合床土(农业企业法人(株)NONGWOOBIO)的栽培架中之后为了促进生长而覆盖塑料膜并安装遮阳棚，接下来每2天喷洒一次包含淡水(自来水)或脱盐熔岩海水(硬度为100)的液态肥料，共计栽培了2周、4周或6周。在向所栽培出的积雪草(整株)或芍药(整株)的干燥粉末添加20倍重量的70％乙醇进行24小时代额提取之后利用滤纸进行过滤，接下来对过滤液进行减压浓缩以及冻结干燥，从而分别获取到了积雪草或芍药的淡水栽培(栽培2周)70％乙醇提取物粉末或脱盐熔岩海水栽培(栽培2周、4周或6周)70％乙醇提取物粉末。

【试验例1】

积雪草提取物或芍药提取物的细胞毒性确认

在96孔板(well plate)中分别分株人永生化角质形成细胞(HaCaT)(1.5×104细胞/孔)或小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(Raw264.7)(6×104细胞/孔)之后，在各个细胞的培养条件下进行了24小时的培养。在完成培养之后丢弃培养基，接下来在利用磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行洗涤之后利用不包含胎牛血清(FBS)的改良伊格尔培养基(DMEM)使细胞进入饥饿状态。在次日利用3.125、6.25、12.5、25、50、100或200μg/ml浓度的积雪草提取物或芍药提取物试料进行处理并进行了24小时的培养。向各个孔(well)的培养基投入10倍稀释的WST-1试剂并进行了2小时的培养。利用酶联免疫吸附检测仪(ELISA reader)对450nm下的吸光度进行了测定并利用下述【公式1】计算出了细胞生存率。

【公式1】

细胞生存率(Cell viability)(％)＝(试料处理组/对照组)×100

通过结果可以确认，在小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(Raw264.7)中芍药提取物在10μg/ml以下(图1)，积雪草提取物在50μg/ml以下(图2)没有呈现出细胞毒性。此外还可以确认，在人永生化角质形成细胞(HaCaT)中芍药提取物在15μg/ml以下(图3)，积雪草提取物在200μg/ml以下(图4)没有呈现出细胞毒性。因此，下述的追加试验都是在不呈现出细胞毒性的浓度下执行。

【试验例2】

积雪草提取物或芍药提取物的抗炎活性确认-NO生成抑制活性

在96孔板(well plate)中分别分株小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(Raw264.7)(6×104细胞/孔)之后，在细胞的培养条件下进行了24小时的培养。在次日利用脂多糖(LPS，lipopolysaccharide)(1μg/ml)以及3.125、6.25、12.5、25或50μg/ml浓度的积雪草提取物或芍药提取物试料对细胞进行处理并进行了24小时的培养。在将细胞培养液与格里斯试剂(Griess reagent)1:1混合并进行10分钟的反应之后，利用酶联免疫吸附检测仪(ELISAreader)对540nm下的吸光度进行了测定。NO的浓度是利用亚硝酸钠(Sodium nitrite)标准曲线进行确定，而最终的NO量是在换算成特定蛋白质的NO量之后与阴性对照组进行了比较。作为阳性对照组，使用了吲哚美辛(INDO，Indomethacin)。

通过结果可以确认，与利用一般水进行栽培的情况相比，利用脱盐熔岩海水栽培的积雪草或芍药的NO生成抑制活性更加优秀，尤其是利用熔岩海水栽培4周的积雪草(图5)以及利用熔岩海水栽培4周的芍药(图6)的NO生成抑制活性最高。

【试验例3】

积雪草提取物或芍药提取物的抗炎活性确认-白细胞介素-8(IL-8)以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抑制活性

在96孔板(well plate)中分别分株人永生化角质形成细胞(HaCaT)(1.5×104细胞/孔)之后，在细胞的培养条件下进行了24小时的培养。在24小时之后丢弃培养基，接下来在利用磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行洗涤之后利用不包含胎牛血清(FBS)的改良伊格尔培养基(DMEM)(无血清(serum free)培养基)使细胞进入饥饿状态。在次日利用痤疮丙酸杆菌(P.acne)(在对OD(600nm)值为2～2.5的疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)破碎液进行离心分离之后使用上清液)或脂多糖(LPS)(1μg/ml)以及积雪草提取物(12.5、25、50、100或200μg/ml)或芍药提取物(0.9375、1.875、3.75、7.5或15μg/ml)对细胞进行处理并进行了24小时的培养。在分别利用白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-a)酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA kit)执行试验之后，利用酶联免疫吸附检测仪(ELISA reader)对450nm下的吸光度进行了测定。最终的白细胞介素-8(IL-8)以及肿瘤坏死因子-α(TNF-a)量是在换算成特定蛋白质的白细胞介素-8(IL-8)以及肿瘤坏死因子-α(TNF-a)量之后与阴性对照组进行了比较。

通过结果可以确认，在脂多糖(LPS)刺激下的白细胞介素-8(IL-8)生成抑制活性在利用熔岩海水栽培的作物尤其是在利用熔岩海水栽培2周的芍药(图7)以及利用熔岩海水栽培4周的积雪草(图8)中与利用淡水(一般水)栽培的作物相比其白细胞介素(UL-8)生成抑制活性有所增加。此外，在痤疮丙酸杆菌(P.acne)刺激下的白细胞介素-8(IL-8)生成抑制活性在利用熔岩海水栽培的作物尤其是在利用熔岩海水栽培4周的作物(图9)以及积雪草(图10)中与利用淡水(一般水)早培的作物相比其白细胞介素(IL-8)生成抑制活性有所增加。

在脂多糖(LPS)刺激下的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生成抑制活性在利用熔岩海水栽培的作物尤其是在利用熔岩海水栽培6周的芍药(图11)以及利用熔岩海水栽培4周的积雪草(图12)中与利用淡水(一般水)栽培的作物相比其肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生成抑制活性有所增加。此外，在痤疮丙酸杆菌(P.acne)刺激下的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生成抑制活性在利用熔岩海水栽培的作物尤其是在利用熔岩海水栽培2周的芍药(图13)以及利用熔岩海水栽培4周的积雪草(图14)中与利用淡水(一般水)栽培的作物相比其肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生成抑制活性有所增加。

【试验例4】

积雪草提取物的痤疮性皮肤缓解效果确认

通过执行人体适用试验，对在将包含在上述<实施例1>中制造出的积雪草提取物(栽培4周)以及芍药提取物(栽培4周)的化妆品组合物(泡沫洁面乳)适用于人体时，是否可以实际上通过改善皮肤微生物组平衡的而对痤疮性皮肤进行缓解。上述试验是委托世明大学化妆品临床研究支援中心并按照世明大学化妆品临床研究支援中心标准操作程序(SOP：Standard Operating Procedure)执行(研究管理编号：GCC-JR-0544-A，报告书管理编号：GCC-200904-E05-1105)。

具体来讲，选择60名(满19～40岁的成年男女)作为对象并要求其使用包含适用本发明的积雪草提取物的化妆品组合物(泡沫洁面乳，试验组)连续8周每天2次(早/晚)清洗脸部，然后对痤疮性皮肤的缓解效果进行了评估。作为对照组，要求其使用不包含适用本发明的积雪草提取物的泡沫洁面乳按照与上述相同的方式清洗脸部。上述评估是通过对研究者总体评分(IGA，Investigator's Global Assessment)、麦克尔森氏痤疮严重程度指数(ASI，Michaelson's Acne Severity Index)以及炎症性以及非炎症性病变相对于基值的比例进行确认的方式执行。作为上述试验对象，选择了如下述【表2】所示的研究者总体评分(IGA)等级为2(轻度)～3(中等)的痤疮患者。

【表2】

研究者总体评分(IGA)是通过2名专家的肉眼评估对使用试验产品之前的试验对象脸部的病变类型及其数量进行测定并决定其等级，接下来以2周为间隔对试验对象脸部的各种病变数量进行测定并对其等级进行了记录。对使用试验产品之前以及之后的等级进行了比较评估，评估时使用了重复测量方差分析(Repeated Measure ANOVA)法，为了对在各个组之间进行比较的事后验证而执行正规性验证之后，通过非参数性方法即曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)法以5％(p＜0.05)的假设均值差异对试验组与对照组之间的显著性与否进行了确认。

麦克尔森氏痤疮严重程度指数(ASI)是通过在使用试验产品之前对试验对象脸部的病变(粉刺、丘疹、脓疱、结节)的数量进行测定而计算出了麦克尔森氏痤疮严重程度指数(ASI)数值。接下来以2周为间隔对来访的试验对象脸部的病变数量进行了测定，并通过对8周之后的病变数量进行测定而计算出了麦克尔森氏痤疮严重程度指数(ASI)数值。对使用试验产品之前以及使用8周之后的麦克尔森氏痤疮严重程度指数(ASI)数值变化进行了评估，评估时使用了重复测量方差分析(Repeated Measure ANOVA)法，为了对在各个组之间进行比较的事后验证而执行正规性验证之后，通过参数性方法即独立样本t-检验(Independent t-test)以及非参数性方法即曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)法以5％(p＜0.05)的假设均值差异对试验组与对照组之间的显著性与否进行了确认。

炎症性以及非炎症性病变相对于基值的比例，是指“在使用试验产品之后进行测定时的病变数量/使用试验产品之前的病变数量”。在使用试验产品之前的试验对象脸部的炎症性病变以及非炎症性病变的数量进行测定和记录，并以2周为间隔对试验对象脸部的炎症性以及非炎症性病变数量进行了测定。对使用试验产品之前的病变数量与使用8周之后的病变数量的比例进行了评估，评估时使用了重复测量方差分析(Repeated MeasureANOVA)法，为了对在各个组之间进行比较的事后验证而执行正规性验证之后，通过非参数性方法即曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)法以5％(p＜0.05)的假设均值差异对试验组与对照组之间的显著性与否进行了确认。

通过结果可以确认，在研究者总体评分(IGA)评估中试验组与对照组相比在使用试验产品8周之后呈现出了统计学上的显著差异(p＜0.05)。在麦克尔森氏痤疮严重程度指数(ASI)评估中试验组与对照组相比在使用试验产品6周之后以及使用试验产品8周之后呈现出了统计学上的显著差异(p＜0.05)。炎症性以及非炎症性病变相对于基值的比例有所减少，而且在试验期间内并没有出现特殊的皮肤异常反应的试验对象。

【试验例5】

积雪草提取物的皮肤微生物组平衡改善效果确认

通过从上述【试验例4】的试验组中随机选择20名并将其皮肤试料作为对象分析微生物菌群而对适用本发明的积雪草提取物的皮肤微生物组平衡改善效果进行了确认。上述分析是委托韩国医药科学研究员微生物组中心按照微生物的种(Species)、属(Genus)、科(Family)、目(Order)、纲(Class)以及门(Phylum)系列基准通过下一代测序技术(NGS)分析方式执行(管理编号：KRIBS-DF11-REV.C，报告书编号：2020KRIBS0404.001)。处理前试料是指使用适用本发明的包含积雪草提取物以及芍药提取物的化妆品组合物(泡沫洁面乳)之前(第0周)的皮肤表皮试料，而处理后试料是指使用适用本发明的包含积雪草提取物以及芍药提取物的化妆品组合物(泡沫洁面乳)8周之后的皮肤表皮试料。

【表3】

通过结果可以确认，各个系列的微生物菌群均发生了较大的变化。具体来讲，在门(Phylum)系列的所有试料中放线菌(Actinobacteria)门为优势种，在处理后组中观察到了比处理前组更高的比例。在属(Genus)系列的丙酸杆菌(Cutibacterium)属中，与处理前组(69.59％)相比处理后组(60.08％)的菌群比例相对较低，但是仍然为优势种，而且在葡萄球菌(Staphylococcus)属中，与处理前组相比在处理后组中以更高的比例形成了菌群。在种(Species)系列的优势种即有害菌痤疮丙酸杆菌属(Cutibacterium acnes group)以及金黄葡萄球菌属(Staphylococcus aureus group)中，与处理前组相比在处理后组中减少了约14.18％(表3，图15以及图16)。