一种转入外源基因来提高三角褐指藻藻种高温抗性的方法

摘要

本发明公开了一种光信号与温度信号偶联的COP9复合体亚基基因的过表达获得耐高温经济硅藻(三角褐指藻)的方法，所述方法包括以下步骤：1)构建接合转移的过表达COP9复合体的CSN5和CSN6亚基基因的质粒；2)进行大肠杆菌介导的接合转移，将外源表达质粒转化到三角褐指藻藻株中；3)通过博来霉素抗性压力获得单克隆的过表达藻株；4)最后通过荧光定量和八通道(水浴)检验过表达藻株的基因表达和耐高温特性。本发明的方法将常见的经济硅藻三角褐指藻的耐受温度上限从25℃提高到了30℃，并且能够在32℃下维持生物量的温度。

说明书

技术领域

本发明涉及一种藻种培育的方法，具体涉及一种转入外源基因来提高藻种高温抗性和生长速度的方法。

背景技术

硅藻富含岩藻黄素、EPA/DHA等副产品，也可以作为饲料直接投喂海洋动物，尤其是作为贝类和虾类幼体开口和发育饵料。许多常见的应用成熟的饵料硅藻，如菱形藻，三角褐指藻均不耐高温，在养殖过程中一旦遇到高温环境，藻细胞大量发白，下沉凝集，死亡。通常认为三角褐指藻在28～30℃或更高温度下难以维持生长。因此，提高经济硅藻的高温适应性及生长速度都至关重要。

高温会改变硅藻的蛋白含量和化学组成。高温还会破坏植物蛋白质稳定性，抑制翻译，引起蛋白质的变性甚至凝聚。增强高温下错误折叠或者损伤的蛋白的清除，减弱高温对藻类蛋白含量，组成和活性的抑制，这很有可能是突破上述难题的关键。众所周知，依赖泛素化的蛋白酶体降解途径是光合生物对环境响应最敏感的生理过程，也对维持蛋白质稳态，蛋白更新，清除错误蛋白和蛋白调控至关重要。有待降解的靶蛋白在E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶的共同作用下，被进行泛素化修饰，继而被26S蛋白酶体识别降解。Cullin-RING E3 ubiquitin ligases(CRL)是E3连接酶中最大的超家族，介导超过20％的泛素化蛋白酶体降解过程。研究发现含cullin的SCF复合体和APC/C(类似cullin，是介导细胞周期蛋白降解的一种E3连接酶)在三角褐指藻细胞周期中也发挥重要的作用。COP9复合体(CSN)最初在拟南芥中被发现，在光形态建成调控中起抑制作用，其帮助CRL去NEDD化而终止其对底物的反应。

我们推测在硅藻中COP1等关键高温响应蛋白的缺失的情况下，COP9复合体极有可能发挥了重要作用。我们在敲除和敲降突变体库中，发现相比于潜在响应温度的光受体蛋白，敲降COP9复合体的亚基对10℃，20℃和25℃下三角褐指藻的生长均有显著的抑制作用，因此我们通过一系列生理实验发现COP9复合体在三角褐指藻高温响应中具有重要作用，推测在三角褐指藻中过表达COP9复合体的关键催化亚基可以提高其高温耐受性和生长速度。

三角褐指藻因其高质量的全基因组序列和成熟高效的转化手段，成为硅藻和光合生物研究的良好模型。接合转移的转化方法特异地适用于硅藻，成本低廉而高效。

发明内容

为解决上述生产问题，本发明的目的在于提供一种提高三角褐指藻高温抗性和生长速度的方法，从而扩大三角褐指藻的培养范围和时间，避免生产中高温大量死亡的问题。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种转基因获得耐高温的三角褐指藻藻种的方法，向三角褐指藻藻株内转移包含COP9信号复合体的关键催化亚基csn5或csn6基因、或包含csn5和/或csn6基因质粒载体、或包含csn5和/或csn6基因的菌株、或包含csn5和/或csn6基因质粒载体的菌株中的一种或二种；

所述csn5基因具有序列表SEDIQ No.1中所示的碱基序列；

所述csn6基因具有序列表SEDIQ No.2中所示的碱基序列。

所述方法包括以下步骤：

1)构建包含COP9信号复合体的关键催化亚基csn5或csn6基因与fcpA启动子和终止子的p0521s质粒；

2)将构建好的CSN5/CSN6-p0521s过表达质粒通过含Mob质粒的大肠杆菌转移到三角褐指藻藻株；

3)通过博来霉素(50～100μg/mL，优选80-100μg/mL)抗性压力得到csn5或csn6基因过表达的单克隆藻株。

所述fcpA启动子具有序列表SEDIQ No.3中所示的碱基序列；

所述终止子具有序列表SEDIQ No.4中所示的碱基序列。

在步骤2)中，采用低成本的、不具有持续基因污染危害的接合转移的基因编辑手段。

将步骤3)获得的单克隆藻株扩大培养并进行高温胁迫验证；最后通过荧光定量PCR和高温验证，得到耐高温的三角褐指藻转基因藻株；选取三角褐指藻耐受的上限温度(25℃)、热带生态型的耐受温度(28℃)及野生三角褐指藻的致死温度(30℃-32℃)。

本发明为一种光信号与温度信号偶联的COP9复合体亚基基因的过表达获得耐高温经济硅藻(三角褐指藻)的方法，所述方法包括以下步骤：1)构建接合转移的过表达COP9复合体的CSN5和CSN6亚基基因的质粒；2)进行大肠杆菌介导的接合转移，将外源表达质粒转化到三角褐指藻藻株中；3)通过博来霉素抗性压力获得单克隆的过表达藻株；4)最后通过荧光定量和八通道(水浴)检验过表达藻株的基因表达和耐高温特性。

本发明在三角褐指藻中过表达COP9复合体的关键催化亚基CSN5或CSN6,使其在高温下生长加快，耐受温度上限也提高，对突破经济硅藻高温抗性具有重要的指导意义。

本发明的方法将常见的经济硅藻三角褐指藻的耐受温度上限从25℃提高到了30℃，并且能够在32℃下维持生物量的温度。本发明具有如下优点：

1.通过结合转移的方法使得转化的目的基因游离在基因组外，可以在无抗性培养基中传代数周至数月，长期无抗压力可以使外源转入基因丢失，从而不会因藻种泄露而造成环境的基因污染。

2.通过八通道光反应器验证，可以同时符合水浴精准控温和多通道生长曲线同时测量的优点。

附图说明

图1为本发明中过表达质粒图谱；

图2为本发明中利用荧光定量PCR测定的CNS5(CSN5-1,CSN5-2)和CSN6(CSN6-1,CSN6-2)过表达藻株各选取两株进行RNA转录水平的验证；

图3为CSN5和CSN6过表达藻株在20℃、25℃、28℃、30℃和32℃的生长曲线，本发明中以野生型为对照，CNS5和CSN6过表达藻株在高温下的生长速度。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均可从正规渠道商购获得。

本发明提供一种转入外源基因来提高藻种高温抗性和生长速度的方法，所述方法包括以下步骤：

1)按照Guillard and Ryther(1962)(文献：Guillard RRL,Ryther JH.Studiesof marine planktonic diatoms:I.Cyclotella nana Hustedt,and Detonulaconfervacea(Cleve)Gran[J].Canadian Journal of Microbiology,1962,8(2):229-239.)的研究报道配置含f/2的人工海水培养基，在20℃下培养三角褐指藻，初始接种密度控制在730nm处的吸光度为0.05，光强为200μmol m

2)分别将构建好的CSN5-p0521s过表达质粒和CSN6-p0521s过表达质粒转化到含Mob质粒的感受态大肠杆菌中(Strand等.,2014)(文献：Strand TA等.A New and ImprovedHost-Independent Plasmid System for RK2-Based Conjugal Transfer[J].PLoS ONE,2014,9(3):e90372.)，通过氨苄青霉素和庆大霉素双抗平板培养得到双质粒(p0521s和Mob)的单克隆菌，挑单克隆菌在1.5毫升管中37℃下摇动5小时左右，再加到50mL氨苄青霉素(100μg/mL)和庆大霉素(40μg/mL)双抗LB培养基中摇动5小时左右，菌在630nm处的吸收度在0.8-1.0之间时(在此为0.9)，进行接合转移转化实验(Karas等.,2015)。三角褐指藻提前三天涂在含f/2培养基的海水固体培养基(15g琼脂/L，琼脂购买于Sigma公司，A7002-250G)上。3000×g离心菌液10分钟，倒掉上清重悬在200微升SOC培养基中，同时刮取平板上生长3天的三角褐指藻浓缩至高浓度(约5×10

3)恢复(即光照培养)两天后将上述固体培养基上的藻转移到含博来霉素(100μg/mL)抗性的含f/2培养基海水固体培养基(含15g琼脂/L)上培养，两周后可见单克隆藻株，为转化进p0521s质粒(含博来霉素抗性基因)的过表达藻株，进行连续扩大培养后，分别用PCR验证(前引物：GACACTTTCAGTGAGGACAAGAAG；后引物：CACCCGCTCGCGGGTGGGCCTACT；退火温度：60℃；延伸时间：30秒)发现单克隆藻株csn5或csn6基因全部成功转化；

4)分别按照荧光定量试剂盒(Roche 06924204001，Roche，瑞士)用荧光定量测定csn5或csn6基因的过表达水平(csn6前引物：

TACAAGGCGAAGCAATGGGT；csn6后引物：GCAGCGCTTTCGCTGAATTA；csn5前引物：TGGTGTGCAAAAAGGCATCG；csn5后引物：TTTGCGTGTTCGCTCCAAAG；退火温度：56℃；延伸时间：30秒)，采用csn6引物对过表达csn6的藻株进行测定，采用csn5引物对过表达csn5的藻株进行测定，采用csn6引物和csn5引物对野生型三角褐指藻的藻株进行测定发现过表达后RNA转录水平(按照Pfaffl(2001)(文献：Pfaffl MW.A new mathematical model forrelative quantification in real-time RT-PCR[J].Nucleic acids research,2001,29(9):e45-e45.)报道的方法计算2

优选地，在步骤1)中，选取蛋白降解过程中的关键蛋白CSN5和CSN6进行过表达。

优选地，在步骤2)中，采用低成本的、不具有持续基因污染危害的接合转移的基因编辑手段。

优选地，在步骤4)中，选取三角褐指藻耐受的上限温度、热带生态型的耐受温度及野生三角褐指藻的致死温度。

三角褐指藻CSN5基因测序结果(正向引物：TTGTCTGCCGTTTCGAGAATTCATGGTTTCAAAAGAGGACGACGAC；反向引物：CGATAGCACGCTTCTGAAGCTTTTAAGCAAAGACTTGCTCTTTGGT；退火温度：57℃；延伸时间：10秒)：

Csn5基因序列表SEDIQ No.1中的碱基序列

序列表

SEQ ID No.1的信息

(a)序列特征

长度：1113核苷酸

类型：核苷酸

链型：单链

(b)分子类型：DNA

序列描述：SEQ ID NO.1

ATGGTTTCAAAAGAGGACGACGACTTTCAAGATGCGGGACAGAACGATGGAATGGATGAGAAGAAAGACACCACCTTGTCATCCACTCCCGCAGCCGACGCTCGCTACCGCTTTGACGCGGATCGCTTCCAGCCGCTCCAATCCCCCGCTCCCTGGATGAAAGATCCCAGATATTTTCAAAAGGTCACGCTCTCTCCTTCAGCAATCATGAAAATCATGATGCATTGTCAGTCTGGTGTGCAAAAAGGCATCGCGGAAAGAAGCAATCCCATCGAAGTCATGGGGATGTTGCTTGGACGTCCCGACCCGGACACTCCACGCACGTTAGTCATTACGGACGCGTTTCCTTTGCCAATTGAAGGATTTGAAACTCGGGTGATTGCGGACGACGAGAACGTCGTCAACCACATGATTGCATTGGGGGAATCTTTGGAGCGAACACGCAAAGAGAAATTCATGGGCTGGTATCATTCGCATCCGTTTGATCTTGGCGATCATTCGCACTGTTTTTTGTCCCAGACAGATCTTAGTACACAGTTGCAATGGCAGCGAGCAGAAGATCCGCACGGCAACCCGTTCGTCGCCATCGTGGTAGATCCTCTGAGATCGCACAACTTGGAAACGCCCGAACTCAAAGCGTTTCGGGCCTACCCACCAGAGTATGTTTCACCAGCCTTGAACGAATGCCCGGATGGATCGGTAGAGTCGTCGGAACAAACACGGCTGGAGCATTGGGGCTCGTGTTGGAACCGGTACTACGAGCTATCTGTCGAGTATTACATGTCCTCGACCTCACGCAACGTTTTACAACAGCTGACGCAAGATTATTTGTGGATCCGCACACTATCTCGGAAATCAGAAAGCTCAGTCACACAGAGACTGTGCGGCTGCGTGAAGCCTTTCCAAAGTGCATCTTTAACTGCGGCGTCCGTTGTGTCCGGAGGACGGGGAACCGGCTTAGGTCCTGGAGGTTCGACATCCGCTTCCGTTTCGTCGGGGATTGATGCGCAGACGAAAGAATGGCAGAAGGCCGTTTCAAACTTGGCTGATATTGCGTCGGAAGATATGGGTGAGCAAGCTTTGCAGTCCACCAAAGAGCAAGTCTTTGCTTAA

三角褐指藻CSN6基因测序结果(正向引物：TTGTCTGCCGTTTCGAGAATTCGTCATTGTGCATCCAGTTGTTTTG；反向引物：CGATAGCACGCTTCTGAAGCTTCTACACGCCCAGGCTCGCGTTGAG；退火温度：60℃；延伸时间：10秒)：

Csn6基因序列表SEDIQ No.2中的碱基序列

序列表

SEQ ID No.2的信息

(a)序列特征

长度：843核苷酸

类型：核苷酸

链型：单链

(b)分子类型：DNA

序列描述：SEQ ID NO.2

GTCATTGTGCATCCAGTTGTTTTGCTCCATGTTCTGGACCATCACACACGACGACAGGAAGAATCCGGCCGCGTGATTGGGACCTTATTAGGACGTCAAAACGGCAATGTCGTGGAAGTAACCAACTGCTTTTCTGTACCGCATGCGGAGCGTGGCGAAGAAGTCGCAATTGGTAAAGATTTCAACAAAACCATGCTAGGTTTGCATTTGCGAGCGAATCGGAAAGAAACTGTGGTGGGTTGGTACGCGTCGGCAGCGAATGGTGATAGTGAATCCAATGGGGATTTGATCACAGATACATCGTCGTTGATTCACGATTTTTATGCGGGAGAAGCAGACGAAGGAGACCCAGTCCATTTGGTAGTCGACACACGACTGAAGGAAGACAGTTTGTCGATGCGAGCATTCAAGTCTTCTCAAATTGTTGTACAAGGTGAAGCAATGGGTAACTTGTTTCACGAGTTGAAGCTTTCGCTCAAGAGCAACGAGCCAGAAGCCATTTGTCTGAACCAAATGATTCGCACCGGCGGTGAATTGGTTGCAAGCAAGGACGAATCTAATTCAGCGAAAGCGCTGCAGATTTCTATGGAAAAGCTTTACGCTCTTCTCGAAAAAACTCTAGCATACGTAGACTCGGTAGTCGATGGGAAAACTCCTCCGGATGCCGAAGCCGGACGTCAGATTGCTGACACGTTGGCGACTGTTGCACGCGTTCGCCCTGAAGTATTTGACCGGCTTTTCCATGATAGCCTGCAAGACTTGCTCATGGTTTCGTACTTGTCCAACATTACTCGAACTCAAATGACCATTGCTGATAAGCTCAACGCGAGCCTGGGCGTGTAG

pPha-T1目的基因前面的启动区序列(439bp)如序列表SEDIQ No.3中的碱基序列：

序列表

SEQ ID No.3的信息

(a)序列特征

长度：439核苷酸

类型：核苷酸

链型：单链

(b)分子类型：DNA

序列描述：SEQ ID NO.3

CTGCAGGACGCAATGGAGGATTATCACCGCAAAAATGAACTTCGAAAAAAACTTTCGAGCGACCATGGAAAAGGAGGATCAGATTCAGATTACAACAGTGGATTGCTCTGGTAGCAAATATCTTCTGCTAGATTGGCTCATGGTCGGTTTTGGACGTTCGAAGCTCACCGTCAAAAGAAACAAAAGAGAAGAATGACGTCTTCGTGACGTAGAATCTACGACTGTACTCGGATCTGGGAAATGAATTGACTCACGGTCTTCTTCGAGTCCTGTTACAGGCCCTTGGTCCGAACCCCCACACGATTTTTGCACCAAAGATTTGCTTCAATTTGCTGGATGTTTTGACTGCAAGATCAGCTGGCCTAGCAAGAGTGCTCGTGTTGCTTCGTCGGGAATCCCTACGAATTTCAGTTCTGCACAAATTTGTCTGCCGTTTCGA

pPha-T1目的基因后面的终止区(324bp)如序列表SEDIQ No.4中的碱基序列：

序列表

SEQ ID No.4的信息

(a)序列特征

长度：324核苷酸

类型：核苷酸

链型：单链

(b)分子类型：DNA

序列描述：SEQ ID NO.4

CAGAAGCGTGCTATCGAACTCAACCAGGGACGTGCGGCACAAATGGGCATCCTTGCTCTCATGGTGCACGAACAGTTGGGAGTCTCTATCCTTCCTTAAAAATTTAATTTTCATTAGTTGCAGTCACTCCGCTTTGGTTTCACAGTCAGGAATAACACTAGCTCGTCTTCACCATGGATGCCAATCTCGCCTATTCATGGTGTATAAAAGTTCAACATCCAAAGCTAGAACTTTTGGAAAGAGAAAGAATATCCGAATAGGGCACGGCGTGCCGTATTGTTGGAGTGGACTAGCAGAAAGTGAGGAAGGCACAGGATGAGTTTT

实施例1：

具体操作方法如下：

1.从本发明中保种的平板中将本发明中的耐高温硅藻藻株挑取进行扩大培养。

2.在25～30℃的海水中，以低浓度(OD

实施例2：

具体操作方法如下：

1.从本发明中保种的平板中将本发明中的耐高温硅藻藻株进行扩大培养。

2.在光生物反应器中分别培养过表达csn5和csn6的藻株，于32℃下以OD

对比实施例1

具体制备方法如下：

1.从保种的平板或培养瓶中分别将野生型藻株与本发明中的耐高温的过表达csn6藻株分别进行扩大培养。

2.在25℃的水温中，以低浓度(OD

序列表

<110> 中国科学院海洋研究所

<120> 一种转入外源基因来提高三角褐指藻藻种高温抗性的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1113

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtttcaa aagaggacga cgactttcaa gatgcgggac agaacgatgg aatggatgag 60

aagaaagaca ccaccttgtc atccactccc gcagccgacg ctcgctaccg ctttgacgcg 120

gatcgcttcc agccgctcca atcccccgct ccctggatga aagatcccag atattttcaa 180

aaggtcacgc tctctccttc agcaatcatg aaaatcatga tgcattgtca gtctggtgtg 240

caaaaaggca tcgcggaaag aagcaatccc atcgaagtca tggggatgtt gcttggacgt 300

cccgacccgg acactccacg cacgttagtc attacggacg cgtttccttt gccaattgaa 360

ggatttgaaa ctcgggtgat tgcggacgac gagaacgtcg tcaaccacat gattgcattg 420

ggggaatctt tggagcgaac acgcaaagag aaattcatgg gctggtatca ttcgcatccg 480

tttgatcttg gcgatcattc gcactgtttt ttgtcccaga cagatcttag tacacagttg 540

caatggcagc gagcagaaga tccgcacggc aacccgttcg tcgccatcgt ggtagatcct 600

ctgagatcgc acaacttgga aacgcccgaa ctcaaagcgt ttcgggccta cccaccagag 660

tatgtttcac cagccttgaa cgaatgcccg gatggatcgg tagagtcgtc ggaacaaaca 720

cggctggagc attggggctc gtgttggaac cggtactacg agctatctgt cgagtattac 780

atgtcctcga cctcacgcaa cgttttacaa cagctgacgc aagattattt gtggatccgc 840

acactatctc ggaaatcaga aagctcagtc acacagagac tgtgcggctg cgtgaagcct 900

ttccaaagtg catctttaac tgcggcgtcc gttgtgtccg gaggacgggg aaccggctta 960

ggtcctggag gttcgacatc cgcttccgtt tcgtcgggga ttgatgcgca gacgaaagaa 1020

tggcagaagg ccgtttcaaa cttggctgat attgcgtcgg aagatatggg tgagcaagct 1080

ttgcagtcca ccaaagagca agtctttgct taa 1113

<210> 2

<211> 843

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtcattgtgc atccagttgt tttgctccat gttctggacc atcacacacg acgacaggaa 60

gaatccggcc gcgtgattgg gaccttatta ggacgtcaaa acggcaatgt cgtggaagta 120

accaactgct tttctgtacc gcatgcggag cgtggcgaag aagtcgcaat tggtaaagat 180

ttcaacaaaa ccatgctagg tttgcatttg cgagcgaatc ggaaagaaac tgtggtgggt 240

tggtacgcgt cggcagcgaa tggtgatagt gaatccaatg gggatttgat cacagataca 300

tcgtcgttga ttcacgattt ttatgcggga gaagcagacg aaggagaccc agtccatttg 360

gtagtcgaca cacgactgaa ggaagacagt ttgtcgatgc gagcattcaa gtcttctcaa 420

attgttgtac aaggtgaagc aatgggtaac ttgtttcacg agttgaagct ttcgctcaag 480

agcaacgagc cagaagccat ttgtctgaac caaatgattc gcaccggcgg tgaattggtt 540

gcaagcaagg acgaatctaa ttcagcgaaa gcgctgcaga tttctatgga aaagctttac 600

gctcttctcg aaaaaactct agcatacgta gactcggtag tcgatgggaa aactcctccg 660

gatgccgaag ccggacgtca gattgctgac acgttggcga ctgttgcacg cgttcgccct 720

gaagtatttg accggctttt ccatgatagc ctgcaagact tgctcatggt ttcgtacttg 780

tccaacatta ctcgaactca aatgaccatt gctgataagc tcaacgcgag cctgggcgtg 840

tag 843

<210> 3

<211> 439

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgcaggacg caatggagga ttatcaccgc aaaaatgaac ttcgaaaaaa actttcgagc 60

gaccatggaa aaggaggatc agattcagat tacaacagtg gattgctctg gtagcaaata 120

tcttctgcta gattggctca tggtcggttt tggacgttcg aagctcaccg tcaaaagaaa 180

caaaagagaa gaatgacgtc ttcgtgacgt agaatctacg actgtactcg gatctgggaa 240

atgaattgac tcacggtctt cttcgagtcc tgttacaggc ccttggtccg aacccccaca 300

cgatttttgc accaaagatt tgcttcaatt tgctggatgt tttgactgca agatcagctg 360

gcctagcaag agtgctcgtg ttgcttcgtc gggaatccct acgaatttca gttctgcaca 420

aatttgtctg ccgtttcga 439

<210> 4

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagaagcgtg ctatcgaact caaccaggga cgtgcggcac aaatgggcat ccttgctctc 60

atggtgcacg aacagttggg agtctctatc cttccttaaa aatttaattt tcattagttg 120

cagtcactcc gctttggttt cacagtcagg aataacacta gctcgtcttc accatggatg 180

ccaatctcgc ctattcatgg tgtataaaag ttcaacatcc aaagctagaa cttttggaaa 240

gagaaagaat atccgaatag ggcacggcgt gccgtattgt tggagtggac tagcagaaag 300

tgaggaaggc acaggatgag tttt 324