二色补血草基因Lb1G04202及其应用

摘要

本发明提供二色补血草基因Lb1G04202及其应用。本发明首次从二色补血草中克隆一个没有保守结构域的非特征基因Lb1G04202。基因Lb1G04202在NaCl处理下高表达。基因Lb1G04202编码一种功能未知的蛋白。原位杂交和亚细胞定位结果表明，它定位于盐腺，并在细胞核中表达。异源表达拟南芥显著提高了萌发期和幼苗期的抗盐性，通过等渗甘露醇及LiCl处理模拟NaCl的渗透胁迫和离子胁迫，发现过表达Lb1G04202增加了渗透调节基因AtP5CS1和AtP5CS2的表达从而大量积累脯氨酸，进而降低渗透势。本发明为揭示盐腺的发育机制奠定基础，为转化作物等非盐生植物和改良盐渍土提供有价值的基因。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及二色补血草基因Lb1G04202及其应用。

背景技术

世界上许多灌溉土壤都面临着土壤盐渍化问题(Hou,et al.2020；Zhao,etal.2010)。根据联合国粮食及农业组织协调世界土壤数据库，土壤盐渍化在一定程度上影响了三分之一的陆地河流流域(Perri,et al.2020)。目前，全球超过20％的灌溉面积受到土壤盐渍化的影响(Singh 2021)。据估计，由于土壤盐碱化，1200万公顷灌溉农业用地可能不能再使用(Litalien and Zeeb 2020)。盐碱化加剧导致耕地面积减少，严重影响粮食生产和粮食安全(Asano,et al.2012；Flowers and Colmer 2008；Munns and Tester 2008)。因此，开发、利用和改善盐碱地迫在眉睫(Song and Wang 2015)。然而，盐碱土改良的物理方法成本高昂且效率低下，因此使用生物方法改良盐碱土尤为重要(Ma,et al.2011)。

大多数植物对高浓度的盐很敏感，但有些植物可以在盐渍化土壤中(≥200mMNaCl)正常生长并完成生命周期，这种植物被称为盐生植物(Flowers and Colmer 2008)。盐生植物在这些环境中形成了耐盐性和生长机制。假盐生植物(拒盐盐生植物)通过质外体屏障将盐从根中排出，防止盐进入细胞，例如芦苇(Flowers and Colmer 2008；Yuan,etal.2018)。一些植物可以在中央液泡中分隔盐以避免对细胞器的损害，例如盐地碱蓬，它被归类为真盐生植物(稀盐盐生植物)(Flowers and Colmer 2008；Guo,et al.2020)。最后一种类型是泌盐盐生植物，它可以通过盐腺或盐囊泡排出盐，如二色补血草(Leng,etal.2018)或藜属(

在上述三种不同类型的盐生植物中，由于盐腺在叶表皮中是一种特殊的存在，因此盐腺在抗盐性中的新作用受到了广泛关注(Liang and Wang 2017)。与其他盐生植物不同，盐腺赋予了泌盐盐生植物特殊的形态和生理机制，以抵抗盐害(Yuan,et al.2015)。从形态上看，过量的Na

虽然盐分泌机制的研究取得了巨大进展，但如何解释盐腺的发育和分化机制仍然是一个挑战。补血草盐腺的发育可以追溯到Wiehe和Breckle(1990)(Wiehe and Breckle1990)，即盐腺是在原细胞周期分裂五次后形成的。Yuan,et al.(2015)阐述了二色补血草第一片真叶上的盐腺的发育可分为五个阶段：A：未分化阶段(播种后4-5天)，B：盐腺分化阶段(8-10天)，C：气孔分化阶段(8-10天)，D：表皮分化阶段(11-16天)和E：成熟阶段(超过17天)(Yuan,et al.2015b)。盐腺作为一种典型的表皮结构，被认为是最早分化的结构，比气孔早出现两天。由于泌盐盐生植物的转化体系和遗传背景困难，这限制了盐腺发育的研究进程。

二色补血草被认为在改善盐碱环境方面起着非常重要的作用，因为它是一种典型的盐生植物，茎和叶上均有盐腺，可以分泌过量的盐(Deng,et al.2015；Ding,etal.2010)。二色补血草的盐腺有四个自发的蓝色荧光发光点，在荧光显微镜下可以清楚地看到(Yuan,et al.2013)。稳定的转化体系(Yuan,et al.2014)和瞬时VIGS体系(Lu,etal.2020)均可用于功能验证，因此在二色补血草中定位与盐腺发育和耐盐性有关的重要基因是可能的。利用二色补血草的叶片发育转录组，提出了许多具有明确结构域的基因参与抗盐性，包括LbTTG1、LbSAD2和LbTRY(Leng,et al.2021；Xu,et al.2020；Yuan,etal.2019)。此外，通过对转录组数据的分析，我们还发现有许多基因在盐腺发育过程中高度表达，但这些基因与已发表的植物基因组序列同源性很低或没有同源性，例如促进耐盐性的LbHLH(Wang,et al.2021)。

通过分析二色补血草的叶片发育转录组(Yuan,et al.2015b)和NaCl处理的盐分泌转录组(Yuan,et al.2016b)，一系列非特征化基因似乎在叶和NaCl条件的早期发育阶段都有高表达。到目前为止，由于在这些具有盐腺的物种中没有基因组的报道可以参考，这些功能未知的新基因被认为参与了泌盐盐生植物盐腺的发育或耐盐性。

发明内容

本发明的目的是提供二色补血草基因Lb1G04202及其应用。

盐腺被认为是一种有效的能够排出Na

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供二色补血草基因Lb1G04202，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(b)SEQ ID NO:1所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

本发明从二色补血草中克隆得到基因Lb1G04202，其编码区包含522个碱基(SEQID NO:2)，编码173个氨基酸(SEQ ID NO:1)。

第二方面，本发明提供含有所述基因Lb1G04202或所述启动子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。

第三方面，本发明提供所述基因Lb1G04202、或含有所述基因Lb1G04202的生物材料在制备转基因植物中的应用。

第四方面，本发明提供所述基因Lb1G04202或含有基因Lb1G04202的生物材料的以下任一应用：

(1)用于提高植物耐盐性；

(2)用于植物品种改良；

(3)用于盐碱地改良。

本发明中，所述植物包括盐生植物(如二色补血草)或拟南芥。

第五方面，本发明提供一种提高植物耐盐性的方法，所述方法选自如下①或②：

①使植物表达所述基因Lb1G04202编码的蛋白；

②在植物中过表达所述基因Lb1G04202。

所述过表达的方式选自以下1)～5)，或任选的组合：

1)通过导入具有所述基因的质粒；

2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；

3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；

4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；

5)通过导入增强子。

第六方面，本发明提供所述基因Lb1G04202通过质粒导入拟南芥中或通过基因工程手段整合到拟南芥染色体上，基因Lb1G04202通过增加拟南芥中基因AtP5CS1和AtP5CS2的表达来提高拟南芥耐盐性。

所述基因AtP5CS1和AtP5CS2在NCBI上的参考序列编号为AT2G39800、AT3G55610。

第七方面，本发明提供按照上述方法获得的转基因植物的以下任一应用：

i.用于植物育种；

ii.用于盐碱地种植。

所述育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

本发明首次从二色补血草中克隆出一个没有保守结构域的非特征基因Lb1G04202，它在NaCl的处理下高度表达。基因Lb1G04202编码一种功能未知的蛋白质。原位杂交和亚细胞定位结果表明，它定位于盐腺，并在细胞核中表达。通过增加AtP5CS1和AtP5CS2的表达而积累脯氨酸，从而降低渗透势。本发明为进一步探究揭示盐腺的发育机制奠定基础，同时为转化作物等非盐生植物和改良盐渍土提供了有价值的基因。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中Lb1G04202的生物信息学分析。其中，(A)Lb1G04202翻译的蛋白质。Lb1G04202(包含522个碱基)编码173个编码氨基酸。(B)Lb1G04202的结构预测。Lb1G04202没有保守结构域或低复杂度区域。(C)二色补血草Lb1G04202与其他物种的同源性分析。

图2为本发明较佳实施例中Lb1G04202的定位和表达水平分析。其中，(A)洋葱表皮细胞中35S::Lb1G04202-GFP的亚细胞定位分析。GFP-Lb1G04202融合蛋白仅在细胞核中表达。35S::GFP用作空载体对照。Bar＝50μm。DAPI在细胞核中呈蓝色荧光，而FM4-64在质膜上呈红色荧光。(B)Lb1G04202在A～E发育阶段和不同组织部位的表达水平。A：A时期，未分化阶段，播种后4-5天；B时期，盐腺分化阶段，播种后6-7天；C：C时期，气孔分化阶段，播种后8-10天；D：D时期，表皮分化阶段，播种后11-16天；E：E时期，成熟阶段，播种后17天以上；成熟叶片：完全展开的叶片；根和茎是从成熟的植物中采集的。数据为三次重复的平均值±标准差；根据邓肯的多量程测试，不同的字母表示在P＝0.05时存在显著差异。(C)Lb1G04202在不同激素处理下的表达水平。NaCl：200mM NaCl处理24小时后，E期幼苗的成熟叶片；6-BA：在0.04mg/L 6-BA上生长的E期幼苗的成熟叶片；ABA：在0.1mg/L ABA上生长的E期幼苗的成熟叶片。(D)利用二色补血草的B～D发育阶段叶片进行Lb1G04202的原位杂交。阴性对照：探针未连接任何核酸序列，也未检测到任何转录本。Lb1G04202的阳性定位：使用地高辛标记的反义探针检测Lb1G04202转录本，该探针产生蓝紫色。

图3为本发明较佳实施例中Col-35S::Lb1G04202株系的分子鉴定和表达量分析。其中，(A)Col 35S::Lb1G04202株系基因组DNA的PCR；泳道1-6、7-10和11，不同的转基因系；泳道12，空白对照，以ddH

图4为本发明较佳实施例中Lb1G04202提高了拟南芥种子萌发期间的抗盐性。其中，(A)Col 35S::Lb1G04202种子在含有不同浓度NaCl(0、50、100和150mM)的培养基上生长5天。(B)使用ImageJ软件测定5天龄幼苗的根长。每株系分析30株幼苗。根长数据是30株植物的平均值±SD。(C)不同NaCl处理下种子萌发水平和子叶生长的分析。播种后48h和5d测定发芽率。每个处理每行播40粒种子，并进行三次重复。发芽率数据为40株植物的平均值±SD。在不同培养基上播种3天后，计算子叶生长率(以出现子叶的植株百分比表示)。每个处理每行播40粒种子，并进行三次重复。子叶生长率数据为40株植物的平均值±标准差。根据邓肯氏的多因素分析，不同的字母表示在P＝0.05时存在显著差异。

图5为本发明较佳实施例中Lb1G04202提高了拟南芥幼苗期的抗盐性。其中，(A)用含有不同浓度NaCl(0、50、100和150mM)的Hoagland溶液处理转基因幼苗的生长状况。(B)不同NaCl处理下全株幼苗的鲜重和干重。数据为四次重复的平均值±标准差；根据邓肯氏的多因素分析，不同的字母表示在P＝0.05时存在显著差异。

图6为本发明较佳实施例中对照和100mM NaCl生长条件下Col 35S::Lb1G04202品系的Na

图7为本发明较佳实施例中Col 35S::Lb1G04202株系中AtP5CS1和AtP5CS2的相对表达水平。每个基因的表达水平通过三个生物重复的qRT PCR进行测量(单独实验)；根据邓肯的多量程测试，不同的字母表示在P＝0.05时存在显著差异。其中，使用180mM甘露醇产生与100mM NaCl相同的渗透势，并使用10mM LiCl发挥与100mM NaCl相似的离子作用(A)，在等渗甘露醇处理下，过表达株系的生长趋势与100mM NaCl处理下的生长情况相同，OE1具有最长的根(B)和最高的发芽率(C)。

具体实施方式

本发明通过分析二色补血草的叶片发育转录组和NaCl处理的盐分泌转录组，一系列非特征化基因似乎在叶和NaCl条件的早期发育阶段都有高表达。在这些未知的基因中，Lb1G04202在NaCl处理下表现出较高的诱导率，被选为进一步分析其抗盐功能的候选基因。在拟南芥中异源表达后，由于渗透胁迫的显著缓解，转基因株系表现出较高的抗盐性。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明使用的引物见表1。

表1本发明使用的引物

实施例1基因Lb1G04202的克隆及生物信息学分析

1.材料和方法

1.1植物材料和生长条件

在黄河三角洲(中国山东省)的盐碱地上(N37°40’；E118°55’)采集野生的二色补血草种子。将种子完全干燥后用70％乙醇表面消5分钟，然后用6％(V/V)NaClO(sigma，USA)震荡消毒18分钟。然后，用无菌蒸馏水清洗种子5-7次，再在无菌水里浸泡20分钟。完成整个消毒过程后，将种子撒播在MS基本培养基上，获得无菌幼苗。而在营养土壤(土壤:蛭石:珍珠岩＝3:1:1，体积比)中的培养条件是28±3℃/23±3℃(昼夜)、600μmol/m2/s(15小时光周期)光照强度和70％相对湿度。

在1/2MS培养基上播种拟南芥生态型Col-0(Columbia-0)种子，播种之前分别用70％乙醇消毒两次(每次5分钟)和95％乙醇消毒三次(每次4分钟)。在4℃春化两天后，在22℃/18℃(白天/夜晚)下，在光照水平为150μmol/m2/s、相对湿度为70％的16小时/8小时的光照/黑暗周期下培养幼苗。幼苗在1/2MS培养基上培养一周，然后移栽到装满营养土壤的花盆(10cm高×10cm直径)中。生长出花序后，通过转化根瘤农杆菌后侵染拟南芥的花序。

1.2基因Lb1G04202的克隆及生物信息学分析

为了提取二色补血草的总RNA，我们收集了不同发育阶段的第一片真叶，包括未分化阶段(A时期，约5000片)、盐腺分化阶段(B时期，约4000片)、气孔分化阶段(C时期，约3000片)，表皮分化阶段(时期，约1000片)和成熟阶段(E时期，约1000片)(Yuan,et al.2015)。通过使用FastPure植物总RNA分离试剂盒(RC401-01；Vazyme Biotech Co.，Ltd.)，从这些叶片中提取总RNA。根据说明书，使用2×T5快速qPCR混合物(SYBR GreenI)(擎科生物技术公司)反向转录RNA得到cDNA。

其中，Lb1G04202-S和Lb1G04202-A(表1)为克隆该基因的全长引物。以二色补血草的cDNA为模板。使用在线工具EXPASY(http://www.bio-soft.net/sms/index.html)翻译该基因编码的蛋白质。使用在线工具SMART预测了Lb1G04202的结构和保守域(http://smart.embl-heidelberg.de/)，将编码蛋白序列应用于NCBIblast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)以分析同源性。

1.3Lb1G04202的定位分析

SalI酶切环状pCAMBIA1300载体，获得线性pCAMBIA1300载体。通过引物Lb1G04202-OE1-S和Lb1G04202-OE1-A扩增携带SalI酶切位点的Lb1G04202片段(表1)。根据ClonExpress II一步克隆试剂盒(Vazyme Biotech Co.，Ltd.)的说明，通过同源重组的方法，将携带SalI酶切位点的Lb1G04202片段与线性的pCAMBIA1300载体连接，形成重组的环状表达载体pCAMBIA1300-Lb1G04202。将重组表达载体pCAMBIA1300-Lb1G04202转化根癌农杆菌GV3101后，再侵染洋葱表皮细胞，以探索Lb1G04202的亚细胞定位。洋葱表皮在光照下培养两天后，在TCS S8 MP双光子激光扫描共聚焦显微镜(德国莱卡)下检测到标记为Lb1G04202的GFP的荧光信号。用DAPI对细胞核进行定位，并在358nm的激发下观察到。FM4-64用(N-(3-三乙基氨丙基)-4-(6-(4-(二乙氨基)苯基)六三烯基)吡啶二溴化铵(Invitrogen)特异定位质膜，并在559nm激发下观察。

为了确定Lb1G04202在二色补血草中的表达位置，从二色补血草中分离出发育中的叶片(萌发6-8天时的第一片真叶)进行原位杂交。简单地说，叶片固定在4％多聚甲醛中，包埋在石蜡中，并通过酒精系列脱水。组织薄片(8μm)用蛋白酶K处理，并在37℃下在6ng/μL杂交溶液中杂交过夜。地高辛标记的Lb1G04202探针(5'-DIG-GCCCUAUACAUCCUUUCAGCACCAUCUUCAU-3'，通过HPLC纯化)呈蓝紫色。同时，使用地高辛标记的信号链当做阴性对照。

1.4 Lb1G04202在二色补血草发育及不同处理过程中的表达模式分析

在含有不同添加物(100mM NaCl、0.04mg/L 6-BA和0.1mg/L ABA)的MS培养基上培养二色补血草，收集幼苗进行RNA的提取。此外，对MS培养基上生长的二色补血草的A-E期叶片、茎、根和老叶进行了取材，这些材料分别进行RNA的提取。将植物总RNA反转录获得cDNA，在20μl反应体系中进行定量RT-PCR。含有0.2μM引物(表1)和荧光热循环仪(Bio-RadCFX96

2.结果

2.1 Lb1G04202编码一种定位在盐腺的在盐处理后高表达的非特征性蛋白质

在引物Lb1G04202-S和Lb1G04202-A的引导下，以二色补血草的cDNA为模板克隆了Lb1G04202的全长编码序列。Lb1G04202包含522个碱基，编码173个编码氨基酸(图1A)。通过结构预测，发现Lb1G04202没有保守结构域或低复杂度区域(图1B)。通过NCBI-BLAST分析，未检测到与Lb1G04202的同源性超过35％的其他物种(图1C)。特别是，比对上的的基因都是未经鉴定的或表征的基因，因此证实Lb1G04202确实是二色补血草的一种独特的新基因。

2.2用原位杂交和亚细胞定位确定该基因的定位和功能(图2)。根据DAPI(位于细胞核)和FM4-64(位于膜上)的参考位置，用p35S::Lb1G04202-GFP表达载体转化洋葱表皮细胞后，阐明了Lb1G04202的亚细胞定位。如图2A所示，p35S::Lb1G04202-GFP仅位于细胞核内，而阳性GFP位于细胞核和质膜内。此外，利用原位杂交技术显示了Lb1G04202的表达位置，以确认其与盐腺的关系。如图2D所示，在盐腺中确实检测到杂交信号。

鉴于Lb1G04202是从NaCl处理的转录组中筛选出来的，原位杂交证据表明可能与盐腺有关，为进一步明确Lb1G04202在叶片发育和盐处理过程中的表达模式，我们将不同发育阶段的植物材料和二色补血草的不同组织部位作为样本来确定和分析表达水平(图2B)。同时，用不同条件(100mM NaCl、0.04mg/L 6-BA和0.1mg/L ABA)处理的二色补血草进行qRTPCR，以测定和分析Lb1G04202在不同处理条件下的表达水平。图2C显示，以茎组织的表达为对照(相对表达水平设置为1)，Lb1G04202的表达水平在100mM NaCl处理下最高，表明Lb1G04202与盐胁迫有关。

实施例2 Lb1G04202异源过表达拟南芥纯合株系的获得

1、用NcoI限制内切酶酶切环状的pCAMBIA3301载体，获得线性化pCAMBIA3301载体。同时，为了将Lb1G04202与线性pCAMBIA3301载体连接在一起，通过引物Lb1G04202-OE2-S和Lb1G04202-OE2-A(表1)扩增了携带NcoI酶切位点的Lb1G04202的全长编码序列(CDS)。质粒p35S::Lb1G04202是使用ClonExpress II一步克隆试剂盒(Vazyme Biotech Co.，Ltd.)通过同源重组产生的。在CaMV 35S启动子的牵引下，质粒p35S::Lb1G04202被转化到根癌农杆菌GV3101细胞中，在拟南芥中进行异源过表达。侵染得到的的拟南芥种子在营养土壤中培养。用Basta(0.1％，V/V)进行筛选，筛选三代后，获得了纯合的异源过表拟南芥种子。

从转基因株系的叶片中提取的DNA当作模板，使用引物pCAMBIA3301-S和pCAMBIA3301-A(表1)扩增Lb1G04202。采用琼脂糖凝胶电泳技术对阳性转基因植株在分子水平上进行鉴定。然后，根据说明书，使用FastPure植物总RNA分离试剂盒(Vazyme BiotechCo.，Ltd.)从不同的Col-35S::Lb1G04202株系中提取mRNA。使用引物Lb1G04202-RT-S和Lb1G04202-RT-A(表1)，通过qRTPCR分析Lb1G04202在不同Col-35S::Lb1G04202株系中的表达水平。以拟南芥的AtACTIN(引物AtACTIN-RT-S和AtACTIN-RT-A，表1)作为内部对照。由于二色补血草的新基因Lb1G04202在拟南芥中没有同源基因，因此以Lb1G04202表达水平最低的转基因株系(OE11)作为对照(相对表达水平设置为1)，计算Lb1G04202在其他Col-35S:Lb1G04202株系中的表达水平。每组进行三次生物学重复。根据Lb1G04202的表达水平(低、中、高)，选择了三个Col-35S::Lb1G04202株系进行生理特性的鉴定，分别是高(OE1)、中(OE2)和低表达(OE11)水平的三种株系。

2、萌发期耐盐指标的测定

将所有OE11、OE2和OE1的转基因株系以及野生型(WT)拟南芥种子在含有不同浓度NaCl(0、50、100和150mM)的1/2MS培养基(溶解在1％琼脂)上培养，以分析Col-35S::Lb1G04202过表达株系的耐盐性。每种类型的转基因株系播种40粒种子，并进行三次生物学重复。从第一天到第五天，每天统计发芽种子的数量。具体来说，从种皮上长出的胚根长度大于1毫米的种子被认为已经发芽。绿色子叶的出现被用作子叶生长的指标。发芽3天后，测定各品系的子叶生长率。子叶生长百分率(％)＝(有子叶的种子数/所有的种子数)×100％。在不同培养基上连续培养5天后，使用ImageJ软件测量不同品系的根长。对于根长指标测量，至少有30个种子用于重复实验。

3、幼苗期盐处理下生理指标的测定

将在1/2MS基本培养基上生长5天的幼苗(OE11、OE2、OE1和WT)分别移栽到营养土壤中。适应生长两周后，用不同浓度的NaCl(0、50、100和150mM NaCl溶解在Hoagland溶液中，pH 6.2)进行灌溉。为了测量生理指标，分别对在0或100mM NaCl条件下不同幼苗的叶组织(每重复0.5g鲜重)取材。Na

3、盐胁迫相关基因在转基因拟南芥中的表达水平分析

四种拟南芥株系(OE11、OE2、OE1和WT)在含有0或100mM NaCl的1/2MS培养基中培养10天。用FastPure植物总RNA分离试剂盒(RC401-01；Vazyme Biotech Co.，Ltd.)提取八个样本的RNA。RNA逆转录后获得的产物用于qRT PCR，以分析盐胁迫下相关标记基因的表达，包括AtP5CS1和AtP5CS2(表1)。进行了三次生物学重复。以AtACTIN作为内部对照。

4、转基因株系在离子和渗透胁迫下的表现

四种株系(OE11、OE2、OE1和WT)在1/2MS培养基中培养5天，该培养基溶解有10mMLiCl(与100mM NaCl具有相同的离子效应)和含有180mM甘露醇(与100mM NaCl具有相同的渗透压)。发芽率(％)、子叶生长率(％)和根长等耐盐指标的测定方法与上述方法相同。通过比较不同株系幼苗在离子胁迫和渗透胁迫下的生长情况，解释了Lb1G04202缓解盐胁迫、提高耐盐性的原因。

5、统计分析

使用SPSS确定P＝0.05时的统计显著性(Duncan多范围检验)。采用方差分析(ANOVA)结合正交对照和平均值比较程序来检测各处理之间的显著差异。

6、结果

6.1 Lb1G04202提高了拟南芥种子在萌发过程中的抗盐性

利用pCAMBIA3301载体转化拟南芥，通过Basta筛选获得14株存活植株。经DNA水平鉴定，得到了11株Col-35S::Lb1G04202阳性株系(图3A)。通过qRT PCR分别分析了Lb1G04202在11个转基因株系中的表达水平(图3B)，然后分别选择OE1、OE2和OE11分别作为Col-35S::Lb1G04202的高、中、低表达株系。

在NaCl处理下，Lb1G04202在二色补血草中被显著诱导，因此我们进一步研究了其在拟南芥耐盐性中的作用。将三种Col-35S::Lb1G04202和WT的种子接种在含有NaCl浓度梯度(0、50、100和150mM)的培养基上，研究每个转基因拟南芥系在萌发期间的耐盐性。如图4A所示，与野生型相比，转基因株系，尤其是高表达和中等表达水平的OE1和OE2，在NaCl处理下表现出更好地生长。

在播种后24小时和5天的测定发芽率，三个Col-35S::Lb1G04202品系的发芽率高于野生型(图4C)。在萌发24小时时，在50mM和100mM NaCl处理下，Col-35S::Lb1G04202株系的萌发率均高于WT。特别是在150mM NaCl处理下，所有Col-35S::Lb1G04202株系的种子都发芽了，而野生型种子都没有发芽。在0、50和100mmNaCl处理下，几个品系的总发芽率差异不大。然而，在150mM NaCl处理下，三个Col-35S::Lb1G04202株系的发芽率显著高于野生型，几乎是野生型的两倍。

子叶生长百分率比发芽率更明显(图4C)。在没有NaCl处理的情况下，四个品系的子叶生长速率几乎没有差异，但在50和100mM NaCl处理下，Col-35S::Lb1G04202品系的子叶生长明显优于WT。显然，当用150mM NaCl处理时，四个品系都没有子叶。随着NaCl浓度的增加，根系生长受到抑制，但在每个NaCl浓度下，Col-35S::Lb1G04202的根系长度始终比WT长(图4B)。

6.2 Lb1G04202缓解了高NaCl处理带来的伤害

Lb1G04202能提高拟南芥种子萌发期的耐盐性。为进一步研究幼苗期的耐盐性，我们探讨了不同品系幼苗期耐盐性的多样性。将萌发5天后的幼苗移植到营养土壤中。适应生长10天后，我们用含有不同浓度NaCl(0、50、100和150mM)的Hoagland溶液浇灌几种类型的幼苗。经过一周的NaCl处理后，很明显，随着NaCl浓度的增加，各品系的叶片都出现了不同程度的变黄、变形和萎蔫(图5A)。特别是在150mM NaCl处理下，WT的生长受到明显的抑制，整个植株比Col-35S::Lb1G04202小，黄变和萎蔫现象更严重。生物量数据证实了这一趋势，即转基因品系的鲜重和干重优于野生型(图5B)。

随后，我们测量了0和100mM NaCl处理下植物的各种生理指标，包括Na

我们检测了盐胁迫(100mM NaCl)下标记基因在这些品系中的表达，以探索Lb1G04202在分子水平上显著提高拟南芥耐盐性的原因。选择了参与脯氨酸合成的P5CS1和P5CS2。AtP5CS1和AtP5CS2在Col-35S::Lb1G04202株系中的表达水平远高于WT。标记基因表达水平的变化与这些植物的抗渗透胁迫水平和脯氨酸积累水平一致。

6.3 Lb1G04202通过缓解渗透胁迫提高耐盐性

考虑到Lb1G04202转化后可以提高拟南芥种子萌发期和幼苗期对NaCl的耐受性，我们希望进一步探索Lb1G04202提高植物耐盐性的可能机制。NaCl总是会产生渗透胁迫和离子胁迫(Zhao,et al.2010)，因此我们相应地设计了两种分别包含单一胁迫的条件，以区分Lb1G04202转化是否可以缓解渗透胁迫或离子胁迫。在100mM NaCl处理下，在萌发期和幼苗期都可以看到明显的差异，因此在这一部分中，使用180mM甘露醇产生与100mM NaCl相同的渗透势，并使用10mM LiCl发挥与100mM NaCl相似的离子作用(图7A)。在等渗甘露醇处理下，过表达株系的生长趋势与100mM NaCl处理下的生长情况相同，即OE1具有最高的发芽率(图7C)和最长的根(图7B)。在10mM氯化锂处理下，所有品系的生长均受到抑制，转基因品系中未检测到生长优势。这些结果表明，在NaCl处理下，野生型植物同时受到渗透胁迫和离子胁迫，而转基因株系Lb1G04202在萌发过程中通过提高对渗透胁迫的抗性表现出更好的耐盐性。

本发明提供的二色补血草Lb1G04202是一种功能未知的蛋白质。原位杂交和亚细胞定位研究表明，它定位于盐腺，并在细胞核中表达。通过增加AtP5CS1和AtP5CS2的表达而积累脯氨酸，从而降低渗透势，这与等渗甘露醇的耐受表型相对应。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献:

[1]Abea.,Satoko,et al.，2014，Carlactone is converted to carlactonoicacid by MAX1 in Arabidopsis and its methyl ester can directly interact withAtD14 in vitro.％J Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America.111(50):18084-18089.

[2]Arisz,W.,et al.，1955，The secretion of the salt glands of Limoniumlatifolium Ktze.

[3]Asano,T.,et al.，2012，A rice calcium-dependent protein kinaseOsCPK12 oppositely modulates salt-stress tolerance and blast diseaseresistance.Plant J 69(1):26-36.

[4]

[5]Deng,Y.,et al.，2015，Identification and functional analysis of theautofluorescent substance in Limonium bicolor salt glands.Plant PhysiolBiochem 97:20-7.

[6]Ding,F.,M.Chen,and N.Sui，2010，Ca2+ significantly enhanceddevelopment and salt-secretion rate of salt glands of Limonium bicolor underNaCl treatment.South African Journal of Botany.

[7]Dix,P.J.,et al.，1986，SALT STRESS:RESISTANCE MECHANISMS AND INVITRO SELECTION PROCEDURES.469-478.

[8]Dong,Y.,et al.，2014，A novel bHLH transcription factor PebHLH35from Populus euphratica confers drought tolerance through regulating stomataldevelopment,photosynthesis and growth in Arabidopsis.Biochem Biophys ResCommun 450(1):453-8.

[9]Fabro,G.,et al.，2004，Proline accumulation and AtP5CS2 geneactivation are induced by plant-pathogen incompatible interactions inArabidopsis.17(4):343.

[10]Feng,Z.,Q.Sun,and Y.Deng，2014，Study on pathway andcharacteristics of ion secretion of salt glands of Limonium bicolor.ActaPhysiol Plant.

[11]Flowers,T.J.,and T.D.Colmer，2008，Salinity tolerance inhalophytes.New Phytol 179(4):945-963.

[12]Guo,J.,et al.，2020，NaCl improves reproduction by enhancing starchaccumulation in the ovules of the euhalophyte Suaeda salsa.BMC Plant Biol 20(1):262.

[13]Han,G.,et al.，2020，Arabidopsis ZINC FINGER PROTEIN1 ActsDownstream of GL2 to Repress Root Hair Initiation and Elongation by DirectlySuppressing bHLH Genes.Plant Cell 32(1):206-225.

[14]Han,G.,et al.，2019，AtSIZ1 improves salt toleranceby maintainingionic homeostasis and osmotic balance in Arabidopsis.Plant Sci 285:55-67.

[15]Hou,D.,et al.，2020，Sustainable soil use and management:Aninterdisciplinary and systematic approach.Sci Total Environ 729:138961.

[16]Hu,Y.M.,et al.，2010，Coexpression of Genes Related to GlycineBetaine Biosynthesis from Salicornia europaea Increase Salt Tolerance ofTransgenic Tobacco.

[17]Imamura,T.,et al.，2020，A novel WD40-repeat protein involved information of epidermal bladder cells in the halophyte quinoa.Commun Biol 3(1):513.

[18]Ji,H.,et al.，2013，The Salt Overly Sensitive(SOS)pathway:established and emerging roles.Mol Plant 6(2):275-86.

[19]Leng,B Y,et al.，2018，Salt gland distribution in limonium bicolorat the individual level.

[20]Leng,B.,et al.，2021，Heterologous expression of the Limoniumbicolor MYB transcription factor LbTRY in Arabidopsis thaliana increases saltsensitivity by modifying root hair development and osmotic homeostasis.PlantSci 302:110704.

[21]Levering,C.A.,and W.W.Thomson，1971，The ultrastructure of the saltgland of Spartina foliosa.

[22]Liang,P.,and Z.Wang，2017，Effects of different types of halophyteson the concentration of cadmium in coastal saline soil.

[23]Litalien,A.,and B.Zeeb，2020，Curing the earth:A review ofanthropogenic soil salinization and plant-based strategies for sustainablemitigation.Sci Total Environ 698:134235.

[24]Liu,J.,and J.Zhu，1998，Arabidopsis thaliana calcium sensor homolog(SOS3)gene,complete cds.

[25]Liu,Y.,et al.，2014，Synergistic and antagonistic effects ofsalinity and pH on germination in switchgrass(Panicum virgatum L.).PLoS One 9(1):e85282.

[26]Lu,C.,Z.Feng,and F.Yuan，2020，The SNARE protein LbSYP61participates in salt secretion in Limonium bicolor.Environmental andExperimental Botany.

[27]Luo,D.,et al.，2019，Full-length transcript sequencing andcomparative transcriptomic analysis to evaluate the contribution of osmoticand ionic stress components towards salinity tolerance in the roots ofcultivated alfalfa(Medicago sativa L.).BMC Plant Biol 19(1):32.

[28]Lv,Z.,et al.，2022，The transcription factors TLR1 and TLR2negatively regulate trichome density and artemisinin levels in Artemisiaannua.J Integr Plant Biol.

[29]Ma,Xianfa.,J.％J Science Zhang,and Technology Review，2011，Research Advances in Physiological Ecology Adaptation of Plant Salt-tolerance.29(14):76-79.

[30]Mach,Jennifer，2019，Fear Not the Unknown:OPENER as a Study inShedding Light on Genes with Unknown Function.The Plant Cell 31(7):1420-1420.

[31]Morris,Logan,et al.，2019，Characterization of Excreted Salt fromthe Recretohalophytes Distichlis spicata and Spartina pectinata.Journal ofEnvironmental Quality 48(6):1775-1780.

[32]Muchate,N.S.,et al.，2016，Plant Salt Stress:Adaptive Responses,Tolerance Mechanism and Bioengineering for Salt Tolerance.82(4):1-36.

[33]Munns,R.,and M.Tester，2008，Mechanisms of salinity tolerance.AnnuRev Plant Biol 59:651-81.

[34]Nounjan,N.,and P.Theerakulpisut，2012，Effects of exogenous prolineand trehalose on physiological responses in rice seedlings during salt-stressand after recovery.

[35]Oh,D.H.,et al.，2009，Loss of halophytism by interference with SOS1expression.Plant Physiol 151(1):210-22.

[36]Perri,S.,et al.，2020，River basin salinization as a form ofaridity.Proc Natl Acad Sci U S A 117(30):17635-17642.

[37]Qiu,Q.,et al.，2002，Regulation of SOS1,a plasma membrane Na

[38]Sanchez-Barrena,M.J.,et al.，2007，The structure of the C-terminaldomain of the protein kinase AtSOS2 bound to the calcium sensor AtSOS3.MolCell 26(3):427-35.

[39]Semenova,Galina A.,Irina R.Fomina,and Karl Y.Biel，2010，Structuralfeatures of the salt glands of the leaf of Distichlis spicata'Yensen 4a'(Poaceae).Protoplasma 240(1):75-82.

[40]Shi,H.,et al.，2000，The Arabidopsis thaliana salt tolerance geneSOS1 encodes a putative Na1yH1 antiporter.

[41]Shimony,C.,and A.Fahn，1968，Light and electron microscopicalstudies on the structure of salt glands of Tamarix aphylla L.

[42]Singh,A.，2021，Soil salinization management for sustainabledevelopment:A review.J Environ Manage 277:111383.

[43]Song,J.,and B.Wang，2015，Using euhalophytes to understand salttolerance and to develop saline agriculture:Suaeda salsa as a promisingmodel.Ann Bot 115(3):541-53.

[44]Sui,N.,et al.，2017，Overexpression of Glycerol-3-PhosphateAcyltransferase from Suaeda salsa Improves Salt Tolerance inArabidopsis.Front Plant Sci 8:1337.

[45]Wang,D.,et al.，2020，A novel sucrose transporter gene IbSUT4involves in plant growth and response to abiotic stress through the ABF-dependent ABA signaling pathway in Sweetpotato.BMC Plant Biol 20(1):157.

[46]Wang,L.,et al.，2018，A novel gene of Kalanchoe daigremontianaconfers plant drought resistance.Sci Rep 8(1):2547.

[47]Wang,X.,et al.，2021，A novel gene LbHLH from the halophyteLimonium bicolor enhances salt tolerance via reducing root hair developmentand enhancing osmotic resistance.BMC Plant Biol 21(1):284.

[48]Wiehe,W.,and S.W.Breckle，1990，Die Ontogenese der Salzdrusen vonLimonium(Plumbaginaceae)..Botanica Acta 103:107-110.

[49]Wl,A,et al.，2018，Plant salt-tolerance mechanism:A review.495(1):286-291.

[50]Xu,Y.,et al.，2020，Importin-beta From the RecretohalophyteLimonium bicolor Enhances Salt Tolerance in Arabidopsis thaliana by ReducingRoot Hair Development and Abscisic Acid Sensitivity.Front Plant Sci 11:582459.

[51]Yuan,F.,et al.，2013，An efficient autofluorescence method forscreening Limonium bicolor mutants for abnormal salt gland density and saltsecretion.South African Journal of Botany 88:110-117.

[52]Yuan,F.,M.Chen,and J.Yang，2014，A system for the transformationand regeneration of the recretohalophyte Limonium bicolor.In VitroCell.Dev.Biol.—Plant.

[53]Yuan,F.,et al.，2018，Reproductive Physiology of Halophytes:CurrentStanding.Front Plant Sci 9:1954.

[54]Yuan,F.,B.Leng,and B.Wang，2016a，Progress in Studying SaltSecretion from the Salt Glands in Recretohalophytes:How Do Plants SecreteSalt？Front Plant Sci 7:977.

[55]Yuan,F.,B.Y.Leng,and B.S.％J Plant Physiology Journal Wang，2015a，Research Progress in Salt Secretion of Salt Glands in Plants.

[56]Yuan,F.,et al.，2019，AWD40-Repeat Protein From theRecretohalophyte Limonium bicolor Enhances Trichome Formation and SaltTolerance in Arabidopsis.Front Plant Sci 10:1456.

[57]Yuan,F.,et al.，2015b，Comparative transcriptome analysis ofdevelopmental stages of the Limonium bicolor leaf generates insights intosalt gland differentiation.Plant Cell Environ 38(8):1637-57.

[58]Yuan,F.,et al.，2016b，The transcriptome of NaCl-treated Limoniumbicolor leaves reveals the genes controlling salt secretion of saltgland.Plant Mol Biol 91(3):241-56.

[59]Zhang,Wei-Dan,et al.，2017，SOS1,HKT1；5,and NHX1 SynergisticallyModulate Na+ Homeostasis in the Halophytic Grass Puccinellia tenuiflora.8.

[60]Zhao,K.F.,et al.，2010，Growth response to ionic and osmotic stressof NaCl in salt-tolerant and salt-sensitive maize.J Integr Plant Biol 52(5):468-75.

[61]Zhu,J.K.，2002，Salt and drought stress signal transduction inplants.Annu Rev Plant Biol 53:247-73.

[62]Ziegler,H.,and U.Lüttge，1967，Die Salzdrüsen von Limonium vulgare.

序列表

<110> 山东师范大学

<120> 二色补血草基因Lb1G04202及其应用

<130> PI202210002

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 173

<212> PRT

<213> 二色补血草(Limonium bicolor)

<400> 1

Met Thr Glu Glu Glu Lys Ala Asp Tyr Tyr Arg Gln Ile Glu Glu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Phe Asp Ile Glu Arg Leu Glu Asn Val Ala Tyr Ser Asp Ile

20 25 30

Val Pro Ile Lys Pro Cys Leu Leu Glu Thr Ile Pro Ser Tyr Ala Glu

35 40 45

Val Ala Lys Glu Gly Leu Glu Ser His Asn Gln Lys Thr Gly Asp Asn

50 55 60

Leu Glu Leu Ile Lys Val Val Lys Val Asn Leu Lys Phe Tyr Pro Cys

65 70 75 80

Cys Ala Cys Asp Tyr Tyr Phe Thr Leu Met Leu Arg Asp Glu Asp Gly

85 90 95

Ala Glu Arg Met Tyr Arg Ala Lys Val Lys Ser Arg Tyr Ala Ser Ala

100 105 110

Lys Gly Glu Met Met Phe Ile Lys Glu His Thr Gly Gly Asn Ser Thr

115 120 125

Phe Thr Phe Glu Ser Lys Ala Ser Glu Glu Lys Asp Met Ile Ser Asn

130 135 140

Asp Asn Ser Gly Ala Pro Glu Gly Asp Gly Tyr Val Val Arg Ala Thr

145 150 155 160

Arg Lys Arg Ser Phe Ala Thr Ile Ala Glu Ser Lys Asp

165 170

<210> 2

<211> 522

<212> DNA

<213> 二色补血草(Limonium bicolor)

<400> 2

atgaccgaag aggagaaagc cgattactat cggcagatcg aggaaagcga gggattcgat 60

attgagaggt tggagaatgt tgcatactct gacattgtgc ctattaagcc ttgtttgctg 120

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