一种复方中草药副产物的精准发酵方法及其应用

摘要

本发明涉及一种复方中草药副产物的精准发酵方法及其应用，属于中草药副产物资源化开发利用技术领域。本发明所述方法包括以下步骤：将干燥后的复方中草药副产物与水混合，加入生物酶制剂，在50℃下进行酶解反应1～2d，得到酶解产物；将所述酶解产物与酿酒酵母菌混合，在30℃下进行有氧发酵1～2d，得到有氧发酵产物；将所述有氧发酵产物与植物乳酸杆菌和糖蜜混合，在40℃下进行厌氧发酵2～4d，得到精准发酵产物。本发明通过调控培养温度、营养物质、需氧情况等条件，实现中草药阶段式、多菌种的精准发酵，降解中草药纤维成分转化成生物活性物质，提高生物功效和资源利用。

说明书

技术领域

本发明涉及中草药副产物资源化开发利用技术领域，具体涉及一种复方中草药副产物的精准发酵方法及其应用。

背景技术

快速发展的中草药产业产生了巨大的副产物(大概6000～7000万吨/年)，其相关开发利用存在着严重不足，导致资源的大量浪费。

中草药副产物主要是在中草药提取制备过程中产生的废弃物，仍含有大量的纤维素、一定含量的多糖、粗脂肪、氨基酸、粗蛋白、微量元素等，通过微生物发酵可以将纤维成分转化为生物活性物质，实现中草药副产物的资源化利用。

中草药副产物发酵一般以自然发酵为主，但是自然发酵过程中存在着多菌种拮抗、菌种不明、纤维降解程度不高、活性物质转化不充分，活性物质不清等问题。一般中草药副产物微生物发酵目前仍存在着发酵过程不可控、容易污染杂菌、安全和稳定性无法把控等问题。而目前中草药发酵主要采用固体发酵技术，通过外源单菌或多菌，以及营养物质的添加，结合微生物学、生物工程学、药物学和生物情报信息学等技术，能在一定程度上改善一般发酵存在的一些问题。但是仍存在着诸如多菌种拮抗、纤维降解程度不高、活性物质转化不充分等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种复方中草药副产物的精准发酵方法及其应用。本发明通过调控培养温度、营养物质、需氧情况等条件，实现中草药阶段式、多菌种的精准发酵，降解中草药纤维成分转化成生物活性物质，提高生物功效和资源利用。

本发明提供了一种复方中草药副产物的精准发酵方法，包括以下步骤：将干燥后的复方中草药副产物与水混合，加入生物酶制剂，在50℃下进行酶解反应1～2d，得到酶解产物；将所述酶解产物与酿酒酵母菌混合，在30℃下进行有氧发酵1～2d，得到有氧发酵产物；将所述有氧发酵产物与植物乳酸杆菌和糖蜜混合，在40℃下进行厌氧发酵2～4d，得到精准发酵产物；

所述生物酶制剂包括纤维素酶、木聚糖酶和蛋白酶。

优选的是，所述复方中草药副产物包括复方中草药的提取后药渣。

优选的是，所述复方中草药包括以下组分的组成：连翘、金银花、炒苦杏仁、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、红景天和甘草。

优选的是，所述干燥后的复方中草药副产物与水混合后，含水量为 40～60％。

优选的是，每克生物酶制剂含有6万U的纤维素酶，6万U的木聚糖酶和6万U的酸性蛋白酶。

优选的是，所述生物酶制剂添加的质量为干燥后的复方中草药副产物的质量的0.5～2％。

优选的是，所述酿酒酵母包括酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)；所述酿酒酵母的添加量为每克干燥后的复方中草药副产物10

优选的是，所述植物乳酸杆菌包括植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)SK3494；所述植物乳酸杆菌的添加量为每克干燥后的复方中草药副产物10

本发明还提供了上述技术方案所述精准发酵方法获得的精准发酵产物。

本发明还提供了上述技术方案所述精准发酵方法在如(1)～(6)任一项中的应用：

(1)促进复方中草药副产物纤维成分降解；

(2)提高复方中草药副产物中多糖、多酚、黄酮含量；

(3)提高复方中草药副产物抗氧化活性；

(4)提高复方中草药副产物抗病毒作用；

(5)提高复方中草药副产物杀菌功能；

(6)改变复方中草药副产物生物活性物质。

本发明提供了一种复方中草药副产物的精准发酵方法。本发明针对传统中草药自然过程中多菌种拮抗、菌种不明、纤维降解程度不高、活性物质转化不充分，活性物质不清等问题，提出了精准发酵方法。本发明结合菌酶特性、菌体营养需求、需氧情况、生长温度等情况设计了阶段式发酵。第一阶段50℃高温酶解，可以在不限制生物酶降解能力的前提下，杀灭不耐高温的有害菌，减少杂菌在发酵过程中对中草药的影响；第二阶段利用生物酶解制造的营养环境，降低处理温度至30℃接种酿酒酵母，酵母快速生长消耗氧气转化生成微生物菌体蛋白和其它的代谢产物；第三阶段在40℃接种植物乳酸杆菌，乳酸杆菌利用酶解和酵母制造的营养与厌氧环境，快速生长产生有机酸，进一步将大分子的生物活性物质转化为小分子生物活性物质，增加抗氧化等效果。此阶段式发酵又称为精准发酵充分利用酶的特性、不同菌种的生长需求、分阶段式处理能够极大降解复方中草药中的纤维素成分转化为小分子有效生物活性物质，增加了其抗氧化、抗病毒和杀菌效果，实现中草药副产物资源化利用。

附图说明

图1为本发明提供的复方中草药副产物的精准发酵流程图；

图2为本发明提供的自然发酵(SF)和精准发酵(PF1)复方中草药在不同阶段粗纤维(CF)、总糖(TS)、还原糖(RS)、总多酚(TP)、总黄酮 (TF)和抗氧化功能(TAA)的变化结果图；

图3为本发明提供的自然发酵(SF)和精准发酵(PF1)复方中草药水提物(Waterextract，WE)和乙醇提取物(Ethanol extract，EE)对猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV)和猪链球菌(Streptococcus suis)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)和产肠毒素大肠杆菌(EnterotoxigenicE.coli)的杀菌作用结果图；

图4为本发明提供的基于液质联用分析在阳离子模式下精准发酵复方中草药(PF1)相对自然发酵复方中草药(SF)在氨基酸、生物碱、黄酮和萜类化合物活性物质变化结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种复方中草药副产物的精准发酵方法，包括以下步骤：将干燥后的复方中草药副产物与水混合，加入生物酶制剂，在50℃下进行酶解反应1～2d，得到酶解产物；将所述酶解产物与酿酒酵母菌混合，在30℃下进行有氧发酵1～2d，得到有氧发酵产物；将所述有氧发酵产物与植物乳酸杆菌和糖蜜混合，在40℃下进行厌氧发酵2～4d，得到精准发酵产物；

所述生物酶制剂包括纤维素酶、木聚糖酶和蛋白酶。

本发明将干燥后的复方中草药副产物与水混合，加入生物酶制剂，在 50℃下进行酶解反应1～2d，得到酶解产物。在本发明中，所述复方中草药副产物优选包括复方中草药的提取后药渣。在本发明中，所述复方中草药优选包括以下组分的组成：连翘、金银花、炒苦杏仁、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、红景天和甘草。在本发明中，所述连翘、金银花、炒苦杏仁、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、红景天和甘草的质量比优选为(2～5):(2～5):1:(2～5): (2～5):(2～5):1:1，更优选为3:3:1:3:3:3:1:1，更优选的，本发明所述复方中草药包括连翘255g、金银花255g、炒苦杏仁85g、板蓝根255g、绵马贯众255g、鱼腥草255g、红景天85g和甘草85g。在本发明中，所述干燥后的复方中草药副产物与水混合后，含水量优选为40～60％；更优选的，所述干燥后的复方中草药副产物与水的混合质量比为10:8。在本发明中，每克生物酶制剂优选含有6万U的纤维素酶，6万U的木聚糖酶和6万U的酸性蛋白酶。在本发明中，所述生物酶制剂添加的质量优选为干燥后的复方中草药副产物的质量的0.5～2％。在本发明中，所述酶解反应的时间优选为2d。

得到酶解产物后，本发明将所述酶解产物与酿酒酵母菌混合，在30℃下进行有氧发酵1～2d，得到有氧发酵产物。在本发明中，所述酿酒酵母优选包括酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae，SC)。在本发明中，所述酿酒酵母的添加量为每克干燥后的复方中草药副产物10

得到有氧发酵产物后，本发明将所述有氧发酵产物与植物乳酸杆菌和糖蜜混合，在40℃下进行厌氧发酵2～4d，得到精准发酵产物。在本发明中，所述植物乳酸杆菌优选包括植物乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)SK3494。在本发明中，所述植物乳酸杆菌的添加量优选为每克干燥后的复方中草药副产物10

本发明还提供了上述技术方案所述精准发酵方法获得的精准发酵产物。

本发明还提供了上述技术方案所述精准发酵方法在如(1)～(6)任一项中的应用：

(1)促进复方中草药副产物纤维成分降解；

(2)提高复方中草药副产物中多糖、多酚、黄酮含量；

(3)提高复方中草药副产物抗氧化活性；

(4)提高复方中草药副产物抗病毒作用；

(5)提高复方中草药副产物杀菌功能；

(6)改变复方中草药副产物生物活性物质。

本发明所述精准发酵方法相较与自然发酵方式，能够增加复方中草药副产物纤维成分的降解程度，更多地转化成多糖和还原糖，促进多酚和黄酮的产生，增强抗氧化活性。此外，还能提高精准发酵产物的抗病毒和杀菌能力。此外，还能改变生物活性物质，所述生物活性物质包括氨基酸、生物碱、黄酮和萜类化合物。具体的，本发明方法能够增加异亮氨酸(L-Isoleucine)、苯丙氨酸(L-Phenylalanine)、赖氨酸、L-天冬酰胺、天冬氨酸(Aspartate) 和酪氨酸；还能提高生物碱Stepharine，Papaverine和3-Furfuryl 2-pyrrolecarboxylate的含量；以及提高主要黄酮类物质如金丝桃苷(槲皮素 -3-O-β-D-半乳糖苷Quercetin-3-O-glucoside)、芹黄素糖苷(芹黄素-6-C-糖苷 -7-O-糖苷Apigenin-6-C-glucoside-7-O-glucoside)、异鼠李素(Isorhamnetin)、罗汉果黄素(Grosvenorine)、柚皮素(Naringenin)和山奈素(Kaempferide) 的含量；主要萜类化合物如硬飞燕草碱(Delsoline)、多根乌头碱(Karakoline)、咖啡酸乙酯(Ethyl caffeate)和二氢香豆素(3,4-Dihydrocoumarin)的含量。氨基酸类物质的丰富有助于提高最终产物的营养价值，黄酮、生物碱和萜类化合物能够提高最终产品的抗菌、抗氧化和抗炎等功效。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种复方中草药副产物的精准发酵方法及其应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

实验材料：植物乳酸杆菌Lactobacillus plantarum SK3494，酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae(SC)，生物酶制剂：1g含有纤维素酶活6万U、木聚糖酶6万U、酸性蛋白酶6万U。

实验方法：

(1)中草药发酵:复方中草药由连翘、金银花、炒苦杏仁、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、红景天、甘草组成，经水提处理，取药渣作为复方中草药副产物。首先将复方中草药副产物干燥处理后打成粉末，与水按着10:8的比例混合，第一阶段加入2％的生物酶制剂(纤维素酶/木聚糖酶/蛋白酶，6万单位/g)在50℃条件下进行酶解处理2d；接着加入10

图1为复方中草药副产物精准发酵流程图。复方中草药副产物经干燥打碎处理后，经酶解(第一阶段：生物酶制剂50℃处理，主要目的降解纤维素)，酵母发酵(第二阶段：接种酵母菌，30℃好氧处理，主要目的增加微生物生长的营养物质)；乳酸杆菌发酵(第三阶段：接种乳酸杆菌40℃厌氧处理，生物活性物质转化产生更丰富的生物活性分子)。

(2)粗纤维检测：配置0.13mol/L的硫酸溶液、0.23mol/L的氢氧化钾溶液、0.5mol/L的盐酸溶液。首先将样品粉碎过筛至10～40目。将过筛的样品，放入玻璃或者金属器皿，放入鼓风干燥箱，在105℃的环境下烘干4个小时，将烘干后的样品放入干燥皿中，放凉至少30min。秤取1g样品，标记滤袋，将装入样品的滤袋封口后放入丙酮寖泡去除样品中的脂肪。再次向玻璃烧杯中倒入足量的0.5mol/L的盐酸溶液，在通风橱中放置20min，倒掉盐酸溶液后静置10min。按照纤维测定仪标准程序，对发酵香菇菌糠样品进行酸碱消煮。取出样品，用丙酮、盐酸溶液依次浸泡后，将所有滤袋均匀的放入鼓风干燥箱中，105℃烘干，放凉30min后，将滤袋放入坩埚中，然后将坩埚放入马弗炉中，550℃灰化4h，放凉，称重计算。

(3)总糖检测：称取1g样品置于100mL锥形瓶中，加入10mL盐酸 (6mol/L)溶液和15mL蒸馏水，于100℃水浴锅中消煮30min，边煮边搅拌，取出锥形瓶，待液体冷却后，用6mol/L的NaOH溶液调节pH至7.4 左右，再将液体定容至100mL，4000rpm、10min离心，取10mL上清液定容至100mL。取1mL总糖提取液，加入2mL DNS溶液，置于100℃水浴锅中煮沸10min，冷却后加入9mL蒸馏水，混匀，取200uL溶液与96 孔板，540nm测定吸光值，计算分析。

(4)还原糖检测：称取1g样品置于100mL锥形瓶中，加入15mL蒸馏水，于50℃水浴锅中消煮30min，边煮边搅拌，取出锥形瓶，待液体冷却后，4000rpm、10min离心，取上清液，再将20mL蒸馏水倒入离心管离心，取上清液，将两次的上清液混合，定容至100mL。取1mL总糖提取液，加入2mL DNS溶液，置于100℃水浴锅中煮沸10min，冷却后加入9mL 蒸馏水，混匀，取200uL溶液与96孔板，540nm测定吸光值，计算分析。

(5)抗氧化功能分析：发酵样品的抗氧化测试、总多酚和总黄酮含量分析是使用苏州科铭生物公司(苏州，中国)生产的总抗氧化能力试剂盒 (FRAP-1-G)、总多酚试剂盒(TP-1-G)、总黄酮试剂盒(LHT-1-G)，具体实验方法参考相关试剂盒的使用说明书。

(6)抗病毒杀菌作用分析：

分别将SF和PF1样品的水提和醇提物按二倍比稀释10个浓度梯度，取 100μL药液与等体积100倍TCID50浓度的病毒液(呼吸障碍综合征病毒 (Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)相互作用2h 后，接种于单层宿主细胞(Marc-145细胞)上，设3个复孔，设为SF组和 PF1组；加入100μL维持液和100μL病毒液设为病毒对照组；加入200μL维持液设为细胞对照组；加入100μL药液和100μL病毒液，另设为无细胞的空白对照组。37℃、5％CO

最小杀菌质量浓度(MBC)的测定：MBC的测定采用试管两倍稀释法。试验组取10支经过高压灭菌的试管，在第1～9管中均加入2mL无菌的肉汤培养基，在第1个管中加入SF或PF1的水提或醇提液2mL，混匀后取2 mL加入第2管，以此类推，至第9管取2mL废去。第10个试管做阳性对照，即不加SF或PF1的水提或醇提液，添加2mL无菌的肉汤培养基。最后向10支试管中分别加入50μL供试菌液(猪链球菌(Streptococcus suis)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)和产肠毒素大肠杆菌 (Enterotoxigenic E.coli)并振荡使其均匀。第2组为对照组，区别在于试管中不加供试菌液，其他组和第1组相同。将试管放置37℃恒温培养箱中培养18h。阳性对照会出现细菌生长的浑浊现象，阴性对照出现无细菌生长的浑浊现象，则试验成立。观察其他试管状况，不出现浑浊的浓度是发酵中草药副产物的最小抑菌质量浓度MIC。将所有清晰无菌生长的试管培养液以划线法接种于普通琼脂平板，37℃培养24h，以菌落不超过5个为发酵中药的最小杀菌质量浓度MBC。

(7)生物活性物质分析：称取100mg样品，加入500μL提取液(甲醇:水＝4:1)，涡旋30s后45Hz/240s研磨，冰水浴超声1h，-40℃静置1h 后将样本在4℃，12000rpm离心15min，取上清过0.22μm滤膜至进样瓶中，每个样本取30μL混成QC样本，上机检测；所使用的仪器为Agilent超高效液相1290UPHLC，流动相条件按照表1中的流动相参数进行分析。所使用的色谱柱为Waters的UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm*2.1*100mm)。进样体积为5μL。

表1流动相参数

Q Exactive Focus质谱仪能够在控制软件(Xcalibur，Thermo FisherScientific)控制下基于FullScan-ddMS2功能进行一级、二级质谱数据采集。详细参数如下：Sheath gas flow rate:45Arb，Aux gas flow rate:15Arb， Capillary temperature:400℃，Full ms resolution:70000，MS/MS resolution: 17500，Collision energy:15/30/45in NCE mode，Spray Voltage:4.0kV (positive)。使用XCMS软件将质谱原始导入。进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等工作，利用自建二级质谱数据库及相应裂解规律匹配法对含有MSMS数据的峰进行物质鉴定。

自然发酵就是不添加外源物质，利用复方中草药自身已有的微生物进行发酵，具体的发酵温度和发酵时间和取样时间和精准发酵复方中草药相同。

结果

1、PF1(精准发酵)vs SF(自然发酵)纤维成分以及抗氧化功能变化

图2为自然发酵(SF)和精准发酵(PF1)复方中草药在不同阶段粗纤维(CF)、总糖(TS)、还原糖(RS)、总多酚(TP)、总黄酮(TF)和抗氧化功能(TAA)的变化结果图；其中，F0d，未发酵；F2d-E2，发酵2d(酶解2d)；F3d-Sc1d，发酵3d(酶解2d，酿酒酵母发酵1d)；F7d-Sc1d-Lp4d，发酵7d(酶解2d，酿酒酵母发酵1d，植物乳酸杆菌发酵4d)。结果显示，在不同发酵阶段，精准发酵复方中草药相对于自然发酵中草药，相较于未发酵阶段7d发酵后明显降低了粗纤维含量，但是两种发酵方式没有明显差异。总糖方面，在发酵的第7d，精准发酵比自然发酵总糖含有少许降低。还原糖方面，在发酵的第2d(亦是生物酶处理2d)后,还原糖含量极大幅度提高，在发酵的第3d(亦是酵母发酵的第1d),还原糖作为酵母的能量源被使用，但直到第7d仍维持一个较高的水平。总多酚方面，酶解处理的第2d(F2d-E2) 精准发酵的总酚含量高于自然发酵，乳酸杆菌发酵的第4d(总发酵第7d， F7d-Sc1d-Lp4d)精准发酵的总酚含量明显高于自然发酵。黄酮含量方面，在酶解2d酵母发酵1d(F3d-Sc1d)后，精准发酵的黄酮含量要稍高于自然发酵。总抗氧化方面，在不同的发酵阶段，精准发酵处理的总抗氧化要高于自然发酵。复方中草药主要由中草药物质组成，在提取过程中相当部分的有效成分仍然限制在植物的细胞壁中，通过酶解和微生物的阶段发酵处理，可以增加纤维成分的降解程度，转化成多糖和还原糖能够改善有益菌的生长，同时促进大分子多酚和黄酮类物质转化小分子物质，因而增强抗氧化等活性。相对于自然发酵复方中草药，精准发酵增加了黄酮类活性物质和抗氧作用。

2、PF1(精准发酵)vs SF(自然发酵)抗病毒和杀菌作用

图3为自然发酵复方中草药副产物(药渣)(SF)和精准发酵复方中草药副产物(药渣)(PF1)的水提物(Water extract，WE)和乙醇提取物(Ethanol extract)对猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)抑制(A)和猪链球菌(Streptococcus suis)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)和产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic E. coli)的杀菌作用结果图(B)。

水提取方法：添加没过药渣的蒸馏水直火煮加热半小时，过滤，原药渣重新加水重复2次，合并提取液，提取液使用旋转蒸发仪80℃，-0.8Mpa浓缩。提取物60℃烘干后溶解：(12mg/mL)。

醇提取方法：用乙醇使用索式提取管回流提取，当馏出液澄清透明，不含有油珠状的有机物时，即可停止蒸馏，将提取完的乙醇提取液加入同样体积的蒸馏水并做新提取液，新提取液使用旋转蒸发仪60℃，-0.8Mpa浓缩。提取物60℃烘干后溶解：(6mg/mL)。

精准发酵(PF1)水提物(1.5mg/mL)和乙醇提取物(0.19mg/mL) 相对于自然发酵(SF)的水提物和乙醇提取物对PRRSV的抑制能力分别增加了50％和70％。PF1相对于SF，其水提物(WE)对于猪链球菌(Streptococcus suis)的杀灭效果增加了30％；其水提物(WE)和乙醇提取物(WE)对副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)和产肠毒素大肠杆菌(EnterotoxigenicE. coli)的杀菌效果分别增加了98％、99％和99％。总体上，精准发酵相较于自然发酵复方中草药抗病毒和杀菌作用都有了明显的提高。

3、PF1(精准发酵)vs SF(自然发酵)生物活性物质变化

图4为基于液质联用分析在阳离子模式下精准发酵复方中草药(PF1) 相对自然发酵复方中草药(PF2)在氨基酸、生物碱、黄酮和萜类化合物活性物质变化结果图。

自然发酵与最终精准发酵复方中草药的样品经过LC-MS分析后，其差异活性物质如图4所示。由于复方中草药含有复杂的活性物质，这里主要对氨基酸、生物碱、黄酮和萜类化合物做了分离和整理。在阳离子模式下，相对于自然发酵复方中草药，精准发酵复方中草药的异亮氨酸(L-Isoleucine) 增加了367倍，苯丙氨酸(L-Phenylalanine)增加了281倍，赖氨酸(L-Lysine) 增加了261倍，L-天冬酰胺(L-Asparagine)增加了203倍，天冬氨酸(Aspartate) 增加了31倍和酪氨酸(tyrosine)增加了4倍；生物碱Stepharine，Papaverine和3-Furfuryl 2-pyrrolecarboxylate分别增加了6倍、4倍和3倍；主要黄酮类物质如金丝桃苷(槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷Quercetin-3-O-glucoside)、芹黄素糖苷(芹黄素-6-C-糖苷-7-O-糖苷Apigenin-6-C-glucoside-7-O-glucoside)、异鼠李素(Isorhamnetin)、罗汉果黄素(Grosvenorine)、柚皮素(Naringenin) 和山奈素(Kaempferide)分别增加了10倍、4倍、4倍、3倍、2倍和2倍；主要萜类化合物如硬飞燕草碱(Delsoline)、多根乌头碱(Karakoline)、咖啡酸乙酯(Ethyl caffeate)和二氢香豆素(3,4-Dihydrocoumarin)分别增加了10679倍、53倍、7倍和3倍。氨基酸类物质的丰富有助于提高最终产物的营养价值，黄酮、生物碱和萜类化合物能够提高最终产品的抗菌抗氧化和抗炎等功效。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。