一种水曲柳U6基因启动子proFmU6.5及其克隆与应用

摘要

本发明涉及一种水曲柳U6基因启动子proFmU6.5及其克隆与应用。本发明首次成功克隆了水曲柳RNA聚合酶Ⅲ型启动子——水曲柳内源U6基因启动子proFmU6.5，并成功构建了水曲柳U6基因启动子活性检测载体，通过瞬时转化水曲柳幼苗、GUS染色验证，证明该启动子具有高效转录活性，为水曲柳及近缘植物的转化研究提供了高效的启动子序列。

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，特别是植物转基因技术领域，具体涉及一种水曲柳RNA聚合酶Ⅲ型启动子，更具体涉及一种水曲柳U6基因启动子proFmU6.5，并进一步公开其克隆方法和应用。

背景技术

水曲柳是木犀科白蜡属落叶大乔木，被列为国家二级保护渐危种，木材总体强度高、抗震性好、木质优良，常用于建筑、家具等，具有重要的经济价值。自1983年首次获得烟草转基因植株后，木本植物的遗传转化也得到重视，遗传转化作为林木基因工程的一个重要组成部分，在木本植物抗病、抗虫、改良性状以及基因工程育种中发挥重要作用。在生命科学领域，突变体对于基因功能的研究具有至关重要的作用。然而，林木世代周期长、遗传杂合度高、基因组倍性复杂，传统的随机诱变方法往往需要构建大群体的突变体库，并进行大规模筛选才能获得目的基因功能丧失的突变体，这一过程需要大量的人力和物力。相比之下，基因组定点编辑技术具有巨大优势，能够直接在基因组特定位置引入突变。

CRISPR/Cas9系统是目前公认的最具有发展潜力的基因编辑技术，Cas9酶在sgRNA引导下定向切割目标位点，对目标基因进行精准编辑。相较于锌指核酸酶(zinc fingernucleases,ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-likeeffector nucleases,TALENs)技术，CRISPR/Cas9系统设计流程简单、操作方便、基因编辑效率高，一经开发被迅速广泛应用于动物、植物、微生物的研究中。自2013年CRISPR/Cas9首次用于模式植物拟南芥和烟草以来，该基因编辑系统已运用于包括水稻(Nekrasov等，NatBiotechnol,2013,31(8):691–693.)、小麦(Wang等,Nature biotechnology,2014,32(9):947-951.)、玉米(Zhen等,Journal of Genetics and Genomics,2014,41(2):63-68.)、高粱(Jiang等,Nucleic acids research,2013,41(20):e188.)、二穗短柄草、番茄(Brooks等,Plant Physiology,2014,166(3):1292-1297)等内的24个科45个属的植物(Shan等,Applications in plant sciences,2020,8(1):e11314.)，在提高作物产量、品质、抗性等方面具有良好的应用前景。CRISPR/Cas9系统的出现同样也为林木基因功能研究和遗传改良起到了很大的促进作用。但相较于草本植物和粮食作物，CRISPR/Cas9系统在木本植物的相关研究及应用较为滞后，多数仍处于基因编辑体系的建立阶段。柑橘属植物是最早尝试应用CRISPR/Cas9进行基因编辑的木本植物，此外该技术还成功应用于猕猴桃属、葡萄属、苹果属、石榴属、咖啡属、可可属、木薯属等。同时，其在杨树等经济木本植物中的成功应用展现了CRISPR/Cas9系统在调控植物逆境耐受性和缩短林木育种周期等方面的巨大潜力，实现了抗旱、抗病等林木的新品种培育，为林木基础研究和分子育种提供了新的途径，为精准改良植物性状和选育新品种提供了新的思路。

为提高CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率，人们不断对载体进行优化。决定靶点特异性的sgRNA是一段具有特定二级结构的小RNA，通常由U3/U6系列启动子驱动。U3/U6启动子是CRISPR/Cas9基因编辑系统的重要元件之一，其转录起始位点分别为A和G，且转录活性较高。其中U3多用于单子叶植物，U6多用于双子叶植物。选择具有明确起始位点的U3或U6启动子，能够精确引导sgRNA的转录，从而减少无关DNA转录带来的脱靶效应。虽然U3/U6已在多个物种的基因编辑中成功运用，但同一启动子在同源关系较远的物种间并不一定适用，且同一物种基因中常存在多个U3或U6启动子，其活性及转录效率存在一定差异。因此克隆出更多目标植物的内源U3/U6启动子，有利于CRISPR/Cas9基因编辑系统的完善。凡惠金等人在毛竹中克隆出两个PeU3启动子并进行不同长度的截短，发现不同启动子及同一启动子不同截短长度时转录活性不同(凡惠金等,植物学报,2020,55(03):299-307.)。浦艳等在番茄中验证启动子转录活性时发现克隆的U3启动子长度在250bp以内仍具有转录活性(蒲艳,华北农学报,2019(1):33-39.)。基于构建CRISPR/Cas9基因编辑载体的需要，所用的U3/U6启动子在保证其具有较高转录活性的基础上，长度要求尽量短，以保证尽可能不含有酶切位点，已有研究表明，用于CRISPR/Cas9基因编辑技术的U6启动子通常只有200-400bp长(Fauser等,The Plant Journal,2014,79(2):348-359.)，甚至短于100bp(Vladimir等,Nature biotechnology,2013,31(8):691-693.)。Long等利用棉花内源U6启动子将sgRNA的表达水平提高了6-7倍，基因编辑效率也提高了4-5倍(Longs等,Plant Methods.2018,14(1):80.)。刘春霞等人利用番茄U6启动子驱动sgRNA的表达，与拟南芥的U6启动子驱动的sgRNA相比较，番茄基因编辑效率从63％提高到73％(刘春霞等,分子植物育种,2020,18(20):6716-6724.)。

成功建立应用于水曲柳的CRISPR/Cas9基因编辑体系将为水曲柳定向突变体库的获取提供高效可靠的技术支持，为深入研究水曲柳基因功能及其基因资源的开发利用提供宝贵的材料基础。然而，迄今为止，在水曲柳上对U6启动子仍然缺乏研究，缺少适用的、尽可能短且具有较高转录活性的内源U6启动子已成为水曲柳CRISPR/Cas9基因编辑系统构建的限制因子，也限制了CRISPR/Cas9系统在水曲柳遗传育种及种质创新等方面的应用。因此，优先克隆出具有高效转录活性的水曲柳内源FmU6启动子，对水曲柳CRISPR/Cas9载体构建、水曲柳功能基因研究及遗传育种具有重要的研究意义及应用价值。

发明内容

针对目前研究现状，本发明的目的是提供一种水曲柳U6基因启动子FmU6.5和该启动子的克隆方法及应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：提供了一种水曲柳内源U6基因启动子proFmU6.5，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述水曲柳U6基因启动子proFmU6.5属于水曲柳U6 snRNA基因的RNA聚合酶Ⅲ型启动子。

优选地，所述水曲柳U6基因启动子proFmU6.5的核苷酸序列中包含102bp U6SnRNA。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：提供了一种克隆所述的水曲柳FmU6基因启动子proFmU6.5的方法，包括如下步骤：

(1)以水曲柳无菌苗DNA为模板，设计如下特异引物：

proFmU6.5-F:AGACAGCAAAGCACCTTGAGAG

proFmU6.5-R:TTATTGGTGGAACCCGCC

(2)使用LA Taq酶在50μL体系中进行PCR克隆，PCR扩增的反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环，70℃终延伸10min。

(3)将扩增产物克隆到pCloneEZ-TOPO载体上，转化大肠杆菌DH5α，挑取重组单克隆测序，即分别获取长度为1863bp水曲柳U6基因启动子proFmU6.5。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：提供了水曲柳U6基因启动子proFmU6.5在水曲柳分子育种技术领域中的应用。

本发明具有如下有益效果：首次在水曲柳中克隆获得了水曲柳U6 snRNA基因的RNA聚合酶Ⅲ型启动子——水曲柳内源U6基因启动子proFmU6.5，并将水曲柳U6基因启动子proFmU6.5与GUS基因融合表达转化水曲柳组培苗幼苗，通过瞬时表达验证了水曲柳U6基因启动子proFmU6.5能够在水曲柳上高效表达，为水曲柳及近缘植物的转化研究提供了高效的启动子序列。

附图说明

图1为水曲柳U6基因启动子proFmU6.5与拟南芥及大豆U6启动子序列比对，其中，框线位置分别为U6 snRNA转录的关键元件USE(Upstream Sequence Element)、TATA-likeBox及转录起始位点，横线标注位置为U6 snRNA；

图2为水曲柳U6基因启动子proFmU6.5的克隆电泳图，可见经过PCR扩增得到了1863bp的水曲柳U6基因启动子proFmU6.5片段；

图3为水曲柳无菌苗GUS染色情况，Control是使用农杆菌GV3101瞬时侵染的对照组。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员应当了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都属于本发明的保护范围之内。

下述实施例中，所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。

下述实例中启动子活性检测载体pNC-121-pro为NC Biotech公司的pNC系列载体，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不作为其他用途使用。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：

水曲柳U6基因启动子proFmU6.5的获得，具体操作如下：

(1)根据U6 snRNA序列在不同物种间的保守性，利用拟南芥AtU6 snRNA序列(GTCCCTTCGGGGACATCCGATAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCATAAATCGAGAAATGGTCCAAATTTT)及大豆GmU6 snRNA序列(GTCCCTTCGGGGACATCCGATAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCACAAATCGAGAAATGGTCCAAATTTT)与水曲柳基因组序列进行比对(BLAST)。检查比对结果，从中挑选序列同源性高于或等于99％的位置，利用Plant CARE在线分析软件对其上游1800bp序列进行启动子顺式作用元件分析。分析结果发现，USE(Upstream Sequence Element)及基本转录相关相关的TATA-like Box分别位于这些U6基因的转录起始位点上游60bp、30bp处。选择其中一条启动子序列命名为proFmU6.5。

(2)以水曲柳无菌苗基因组DNA为模板，在水曲柳U6基因启动子proFmU6.5上下游设计特异引物：

proFmU6-5-F:AGACAGCAAAGCACCTTGAGAG

proFmU6-5-R:TTATTGGTGGAACCCGCC

其中下游引物位于基因组序列中水曲柳snRNA下游300bp处，以保证克隆序列中包含完整的102bp的snRNA。

(3)使用LA Taq酶在50μL体系中进行PCR克隆，PCR扩增的反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环，70℃终延伸10min。

(4)将扩增产物克隆到pCloneEZ-TOPO载体上，转化大肠杆菌DH5α，挑取重组单克隆测序，最后分别获取如图2所示长度为1863bp的水曲柳U6基因启动子proFmU6.5。

(5)使用DNAMAN将该启动子序列与拟南芥AtU6-1、AtU6-26、AtU6-29及大豆GmU6-16g-1、GmU6-16g-2、GmU6-19g-2碱基序列比对分析，发现水曲柳U6基因启动子proFmU6.5序列含有USE元件及U6 snRNA转录关键位点TATA-like Box，如图1所示，并且水曲柳U6基因启动子proFmU6.5序列中这两个元件相对于转录起始位点的位置与拟南芥AtU6-1、AtU6-26、AtU6-29及大豆GmU6-16g-1、GmU6-16g-2、GmU6-19g-2启动子序列位置一致，这对其功能的行使具有重要意义。

实施例2：

水曲柳U6基因启动子proFmU6.5的活性检测，具体操作如下：

(1)水曲柳U6基因启动子proFmU6.5活性检测载体的构建：

设计如下用于与pNC-121-pro(pBI121框架，GUS报告基因，将NC克隆框取代pBI121的35S启动子而成)同源重组克隆的含有同源臂的特异引物：

pNC-proFmU6.5-F:

pNC-proFmU6.5-R:

(下划线所示为与pNC-121-pro载体同源序列)

以水曲柳U6基因启动子proFmU6.5阳性重组单克隆质粒为模板，PCR扩增获得两端含有同源臂的proFmU6.5 DNA片段，用Nimble Mix(A)将上述片段与pNC-121-pro质粒混合，吸打混匀10-20次后，用PCR仪50℃处理45分钟后，4℃恒温，最终获得pNC-121-pro:FmU6.5启动子活性检测载体。

(2)水曲柳U6基因启动子proFmU6.5的农杆菌转化验证：

将构建的启动子活性检测载体pNC-121-pro:FmU6.5转化到农杆菌GV3101菌株，以接种15d的水曲柳幼苗为瞬时转化外植体材料，进行农杆菌瞬时侵染，共培养3天后取出水曲柳幼苗进GUS染色观察，以评估水曲柳U6基因启动子proFmU6.5的启动能力和表达活性。

将用于检测的水曲柳组培苗加入GUS染液，真空抽滤半小时后于37℃摇床中避光过夜染色，倒掉染色液，95％酒精脱色3d，观察GUS染色情况。以空载GV3101农杆菌侵染的水曲柳幼苗做对照，染色情况如图3所示。

可见，本发明在水曲柳中获得了水曲柳U6 snRNA基因的RNA聚合酶Ⅲ型启动子——水曲柳U6基因启动子proFmU6.5，并被验证具有启动活性。因此，本发明为水曲柳及近缘植物的转化研究提供了高效的启动子序列。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的权力要求所保护的范围。

序列表

<110> 东北林业大学

<120> 一种水曲柳U6基因启动子proFmU6.5及其克隆与应用

<130> proFmU6.5

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1863

<212> DNA

<213> 水曲柳(Fraxinus mandshurica)

<400> 1

agacagcaaa gcaccttgag agaagccatt aacaacttaa aaatgtacta aaactctctt 60

tcctcttcgg agattgcttt atgaaattcc tatgaagcat tctgtatata tatatagagg 120

gagaaaaaga gagctcatgt gatcaaatca actgctcttc taccaaatcc tcctacttcc 180

actacatgcc tcttatggct aagtgctaac catgacccct tcaacttgta gtacatgcac 240

ctttatggaa atggatttta aagaaaggag tttgaaattt gtgacagtgt ttctggtttc 300

agtttcacct gctccatgaa catatacaga aattcccatt tgtcatatac ttgatcagtt 360

accacatttg acaatttgcg ttagtttttg ttacatttat tgcgccagtt agcggactaa 420

aacagacaaa caatgctata attaggggtg ctaaaaaaag ttcaagatga acatgctgac 480

cagtagttga actcaaaaat cctttagtta taaaggggga attaattatt cttttttcca 540

gcgattatct caagaataat gtccctgaat tttaccttga aaaaaaaaga ttattatatt 600

tttaaaacaa tgttatatta agaacatcga gtggtagtat tgatggatca agattcatac 660

gaagtatata gtgggcatga aaatggatga atatagttat cgagttaatt ttctttgaaa 720

tacatgtact tatcacatta gaagggtcac aagtttgttt ttagatcatt tgtaatatat 780

ttctctacat cattattttg gttttatcaa gatgtgatca tattcacatt tgttcgtaga 840

ctttgtcatc gaaatagact ttccttttgt tagtgggtct atatttctcc aaattctatc 900

tttgatccaa catgatgctg atgtaatagt gaattattta gaaatttgtg tcacatgagc 960

aaaagtagat ggtattataa aattcatctt caatgtaagc taacagaatt agagttccgt 1020

ctagattcaa acgatatgtt agacggagtg atccgacaaa atttttattt ctttttccaa 1080

tttatatttc ctatcaaaat gtagacgtga aaattaagaa atatggaacc acacgtgaaa 1140

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tctaacccga cccagaatct aacttacact gttctaattc gatcccaact attctagtcc 1620

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aaaattttcc ttcttggttt tttgcgaccg aatgatatta ttttcggcgg gttccaccaa 1860

taa 1863